Laporan 1 - 7 Kelompok 8

LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA
Disusun Untuk Memenuhi Tugas Praktikum Fitokimia
OLEH :
KELAS : FARMASI B
1. Titan Octavia Kurnia Putri 201410410311070

2. Salsabila Az Zahra 201510410311057
3. Dewi Ayu Safitri 201510410311069
4. Ayu Isnawati Abdjulu 201510410311084
5. Trimianti Hidahyatun Nazah 201510410311100
DOSEN PEMBIMBING :
Drs. Herra Studiawan, M.si., Apt
Siti Rofida, M.Farm., Apt
PRODI FARMASI
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2018
1
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI .......................................................................................................... 2
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ALKALOID ................................ 8
(Ekstrak Piper nigrum L) ..................................................................................... 8
1.1 TUJUAN ....................................................................................................... 9
1.2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 9
1.2.1 Tanaman Lada Hitam (Piper nigrum L.) ................................................ 9
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman Lada Hitam ......................................... 11
1.2.3 Manfaat Tanaman Lada Hitam ............................................................. 12
1.2.4 Golongan Senyawa (alkaloida) ............................................................. 12
1.2.5 Klasifikasi Senyawa Alkaloid ............................................................... 13
1.2.6 Cara Identifikasi Senyawa Alkaloida ................................................... 15
1.2.7 Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) ........................................................ 20
1.3 PROSEDUR KERJA ................................................................................... 24
1.3.1 Preparasi Sampel................................................................................... 24
1.3.2 Reaksi Pengendapan ............................................................................. 24
1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .......................................................... 24
1.4 SKEMA KERJA.......................................................................................... 25
1.5 BAGAN ALIR ............................................................................................ 27
1.6 HASIL PENGAMATAN ............................................................................ 28
1.7 PEMBAHASAN ......................................................................................... 29
1.8 KESIMPULAN ........................................................................................... 31
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 32
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN GLIKOSIDA SAPONIN,
TRITERPENOID DAN STEROID (Ekstrak Sapindus rarak DC) ................ 33
1.1 TUJUAN ..................................................................................................... 34
1.2 TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................. 34
1.2.1 Tanaman Klerak (Sapindus rarak DC.) ................................................ 34
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman ............................................................. 35
1.2.3 Golongan Senyawa ............................................................................... 36
2
1.2.4 Identifikasi Senyawa Saponin ............................................................... 38
1.2.5 Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis .................................................. 39
1.3 PROSEDUR KERJA ................................................................................... 41
1.3.2 Reaksi Warna ........................................................................................ 41
1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis...................................................................... 41
1.4 SKEMA KERJA.......................................................................................... 43
1.5 BAGAN ALIR ............................................................................................ 45
1.6 HASIL PENGAMATAN ............................................................................ 48
1.6.1 Perhitungan Rf ...................................................................................... 48
1.7 PEMBAHASAN ......................................................................................... 49
1.8 KESIMPULAN ........................................................................................... 53
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 54
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FLAFONOID ........................... 55
(Ekstrak Psidium guajava).................................................................................. 55
1.1 TUJUAN ..................................................................................................... 56
1.2 DASAR TEORI ........................................................................................... 56
1.2.1 Tanaman Jambu Biji (Psidium guajava L.) .......................................... 56
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman ............................................................. 57
1.2.3 Manfaat Tanaman Jambu Biji ............................................................... 58
1.2.4 Golongan Senyawa Tanaman Jambu Biji ............................................. 58
1.2.5 Klasifikasi Senyawa Flavonoid ............................................................ 60
1.2.6 Cara Identifikasi Senyawa Flavonoid ................................................... 64
1.2.7 Tinjauan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ........................................... 64
1.3 PROSEDUR KERJA ................................................................................... 66
1.3.1 Preparasi sampel ................................................................................... 66
1.3.2 Reaksi warna ......................................................................................... 66
1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis...................................................................... 66
1.4 SKEMA KERJA.......................................................................................... 68
1.5 BAGAN ALIR ............................................................................................ 70
3
1.6 HASIL ......................................................................................................... 72
1.6.1 Reaksi Warna ........................................................................................ 72
1.6.2 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .................................................... 73
1.6.3 Perhitungan Rf ...................................................................................... 73
1.7 PEMBAHASAN ......................................................................................... 74
1.8 KESIMPULAN ........................................................................................... 77
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 78
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN POLIFENOL DAN TANIN .... 79
(Ekstrak Psidium guajava).................................................................................. 79
1.1 TUJUAN ..................................................................................................... 80
1.2 DASAR TEORI ........................................................................................... 80
1.2.1 Tanaman Jambu Biji (Psidium guajava) .............................................. 80
1.2.2 Manfaat Tanaman Jambu Biji ............................................................... 81
1.2.3 Kandungan Senyawa Tanaman Jambu Biji .......................................... 82
1.2.4 Golongan Senyawa Tanaman Jambu Biji ............................................. 82
1.2.5 Tinjauan Klasifikasi Senyawa .............................................................. 84
1.2.6 Cara Identifikasi Senyawa Polifenol dan Tanin ................................... 87
1.2.7 Tinjauan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ........................................... 87
1.3. PROSEDUR KERJA .................................................................................. 89
1.3.1 Preparasi Sampel................................................................................... 89
1.3.2 Uji Gelatin............................................................................................. 89
1.3.3 Uji Ferri Klorida ................................................................................... 89
1.3.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .......................................................... 89
1.4 SKEMA KERJA.......................................................................................... 90
1.5 BAGAN ALIR ............................................................................................ 92
1.6 HASIL ......................................................................................................... 93
1.6.2 Uji Ferri Klorida ................................................................................... 93
1.6.3 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .................................................... 93
1.6.4 Perhitungan Rf ...................................................................................... 94
4
1.7 PEMBAHASAN ......................................................................................... 95
1.8 KESIMPULAN ........................................................................................... 98
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 99
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ANTRAKINON ...................... 100
(Ekstrak Rheum officinale L) ........................................................................... 100
1.1 TUJUAN ................................................................................................... 101
1.2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 101
1.2.1 Klasifikasi Tanaman Kelembak .......................................................... 101
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman ........................................................... 102
1.2.3 Manfaat Tanaman ............................................................................... 103
1.2.4 Efek Farmakologi pada Tanaman ....................................................... 104
1.2.5 Tinjauan Tentang Senyawa Antrakinon ............................................. 105
1.2.6 Tinjauan tentang Kromatografi Lapis Tipis........................................ 107
1.2.7 Cara Mengidentifikasi Senyawa Antrakinon ...................................... 111
1.2.8 Indeks Polaritas ................................................................................... 115
1.2.9 Tinjauan Eluen .................................................................................... 116
1.3 PROSEDUR KERJA ................................................................................. 120
1.3.1 Reaksi warna ....................................................................................... 120
1.4 BAGAN ALIR .......................................................................................... 121
1.5 SKEMA KERJA........................................................................................ 123
1.6 HASIL PRAKTIKUM .............................................................................. 125
1.6.1 Reaksi Warna ...................................................................................... 125
1.6.2 Perhitungan ......................................................................................... 128
1.7 PEMBAHASAN ....................................................................................... 130
1.8 KESIMPULAN ......................................................................................... 133
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 134
UJI KLT DENGAN BERBAGAI ELUEN ..................................................... 135
1.1 TUJUAN ................................................................................................... 136
5
1.2.1 Kolesterol ............................................................................................ 136
1.2.2 Biosintesis Kolesterol ......................................................................... 137
1.2.3 Konstanta Dielektrik ........................................................................... 138
1.2.4 Tinjauan Eluen .................................................................................... 139
1.2.5 Tinjauan Polaritas ............................................................................... 142
1.2.6 Kromatografi Secara Umum ............................................................... 143
1.2.7 Kromatografi Lapis Tipis.................................................................... 145
1.2.8 Faktor yang Mempengaruhi KLT ....................................................... 145
1.3 PROSEDUR KERJA ................................................................................. 154
1.4 BAGAN ALIR .......................................................................................... 155
1.5 SKEMA KERJA........................................................................................ 156
1.6 HASIL PRAKTIKUM .............................................................................. 157
1.7 PERHITUNGAN ....................................................................................... 159
1.7.1 Perhitungan Konstanta Dieletrik ......................................................... 159
1.7.2 Perhitungan Nilai Rf .......................................................................... 160
1.8 PEMBAHASAN ....................................................................................... 161
1.9 KESIMPULAN ......................................................................................... 164
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 165
FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM.............................. 166
1.1 TUJUAN ................................................................................................... 167
1.2.1 Tanaman Psidium Guajava ( Jambu biji ) .......................................... 167
1.2.2 Kandungan Kimia Tanaman ............................................................... 172
1.2.3 Manfaat dari Tanaman ........................................................................ 174
1.2.4 Fraksinasi ............................................................................................ 175
1.2.5 Macam – macam proses fraksinasi: .................................................... 177
1.2.6 Kromatografi ....................................................................................... 178
1.2.7 Kromatografi Lapis Tipis.................................................................... 178
1.2.8 Kromatografi Kolom........................................................................... 184
6
1.2.9 Metode Pemisahan Kromatografi Kolom ........................................... 189
1.2.10 Tinjauan Eluen .................................................................................. 190
1.2.11 Indeks Polaritas ................................................................................. 192
1.3 PROSEDUR KERJA ................................................................................. 194
1.4 BAGAN ALIR .......................................................................................... 196
1.5 SKEMA KERJA........................................................................................ 198
1.6 HASIL PRAKTIKUM .............................................................................. 200
1.7 PERHITUNGAN ....................................................................................... 204
1.7.1 Perhitungan Nilai Rf ........................................................................... 204
1.8 PEMBAHASAN ....................................................................................... 206
1.9 KESIMPULAN ......................................................................................... 210
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 211
7
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ALKALOID
(Ekstrak Piper nigrum L)
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
8
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan alkaloida
dalam tanaman.
1.2 TINJAUAN PUSTAKA

1.2.1 Tanaman Lada Hitam (Piper nigrum L.)
Lada hitam adalah buah Piper nigrum L. yang belum masak. Kadar
minyak atsiri tidak kurang dari 1% b.v (DepKes RI Meteria Medica Jilid
VI)
Menurut Tjitrosoepomo (2007), klasifikasi tanaman lada adalah sebagai
berikut :
Kingdom : Plantae ( tumbuhan )
Subkingdom : Tracheobionta ( Tumbuhan berpembuluh )
Super Divisi : Spermatophyta ( Menghasilkan biji )
Divisi : Magnoliophyta ( Tumbuhan berbunga )
Kelas : Magnoliopsida ( Berkeping dua / dikotil )
Sub Kelas : Piperales
Ordo : Piperaceae
Genus : Piper
Spesies : Piper nigrum L.
Nama Daerah : Lada, Merica
Simplisia : Minyak atsiri mengandung felandren, dipenten,
kariopilen, limonene, alkaloida piperina dan
kavisina
Gambar 1 : Piper nigrum
9
a. Nama Daerah
Merica hitam (Piper nigrum L.) mempunyai nama Sumatera: lada
(Aceh), leudeu pedih (Gayo), lada (Batak), lada (Nias), raro (Mentawai),
lada kecik (Bengkulu), lade ketek (Minangkabau), lada (Lampung). Jawa:
Lada, pedes (Sunda), merica (Jawa). Nusa Tenggara: maicam, mica (Bali),
saha (Bima), saang (Flores). Kalimantan: sahang laut (Dayak), sahang
(Sampit). Sulawesi: kaluya jawa, marisa jawa, malita lodawa (Gorontalo).
Maluku: marisano (Sepa), rica jawa, rica polulu (Ternate), mica jawa, rica
tamelo (Tidore), Indonesia : lada hitam (DepKes RI Materia Medica Jilid
IV)
b. Morfologi Tanaman
Tanaman ini adalah batang pokok berkayu, beruas-ruas dan tumbuh
merambat dengan menggunakan akar pelekat pada tiang panjat atau
menjalar di atas permukaan tanah. Tanaman lada merupakan akar tunggang
dan memiliki daun tunggal, berseling dan tersebar (Tjitrosoepomo, 2004).
Daun berbentuk bulat telur sampai memanjang dengan ujung
meruncing (Rismunandar, 2007). Buah merupakan produksi pokok daripada
hasil tanaman lada. Buah lada berbentuk bulat, berbiji keras dan berkulit
buah yang lunak. Kulit buah yang masih muda berwarna hijau, sedangkan
yang tua berwarna kuning. Buah yang sudah masak berwarna merah,
berlendir dengan rasa manis. Sesudah dikeringkan lada berwarna hitam.
buah lada merupakan buah duduk, yang melekat pada malai. Besar kulit dan
bijinya 4-6 mm, sedangkan besarnya biji 3-4 mm. Berat 100 biji kurang
lebih 38 gram atau rata-rata 4,5 gram. Kulit buah atau pericarp terdiri dari 3
bagian, yaitu epicarp (kulit luar), mesocarp (kulit tengah), endocarp (kulit
dalam) (Rismunandar, 2007).
Kulit ini terdapat biji-biji yang merupakan produk dari lada, biji-biji
ini juga mempunyai lapisan kulit yang keras (Sutarno dan Agus Andoko,
2005). Buah lada umumnya dikenal dalam dua jenis, yaitu lada hitam dan
lada puith. Yang membedakan kedua jenis ini adalah proses
pembuatannya. Proses pembuatan lada hitam adalah dengan mengambil
buah yang masih hijau, diperam, kemudian dijemur sampai kering. Dari
10
penjemuran diperoleh buah lada yang keriput dan berwarna kehitam-
hitaman. Sedangkan lada putih diambil dari buah yang hampir masak,
direndam, dan dikupas kulitnya yang kemudian dijemur hingga berwarna
putih (Rismunandar, 2007)
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman Lada Hitam

Kandungan : Mengandung minyak atsiri dan senyawa alkaloida piperina
dan kavisina
Simplisia : Minyak atsiri mengandung felandren, dipenten, kariopilen,
limonene, alkaloida piperina dan kavisina
Menurut Williamson (2002), susunan kimia lada hitam terdiri dari :
a. Minyak atsiri (Essential oil) diantaranya mengandung 1,2 – 2,6%
minyak atsiri yang terdiri dari sabinine (15-25%), caryophyllene, α-
pinene, dll.
b. Asam Fenolat adalah senyawa yang terdiri dari cincin fenolik dan gugus
asam karboksilat (COOH) dengan struktur kimia C6-C1. Menurut
Meghwal dan Goswami (2012) asam fenolat yang terkanlldung dalam
buah lada hitam memiliki fungsi sebagai antioksidan.
c. Piperin (1–piperilpiperidin ) C17H19O3N merupakan alkaloid dengan
inti piperidin. Piperin berbentuk ocale berwarna kuning dengan titik
leleh 1270C -1290C, merupakan basa yang tidak optis aktif, dapat larut
dalam ocale, ocale, eter, dan sedikit larut dalam air (Anwar,dkk. 1994).
Piperin terdapat dalam beberapa spesies piper dan dapat dipisahkan
baik dari lada hitam maupun lada putih perdagangan piperin juga dapat
ditemukan pada cabe jawa. Kandungan piperin biasanya berkisar antara
5-92% (Anwar,dkk. 1994).
Menurut Shingate et al. (2013) lada terdiri dari piperine alkaloid (3-
9%), pungent resin (6.0%), volatile oil (1-2.5%), piperidine dan starch
(about 30%) yang berkhasiat sebagai CNS stimulant, analgesic, antipyretic
dan antifeedent activities, depressant, anticonvulsant.
11
1.2.3 Manfaat Tanaman Lada Hitam
Biji kering yang sudah dihaluskan banyak digunakan untuk pengobatan
dan juga menjadi bahan peramu yang ditambahkan dalam masakan Eropa.
Daya tarik Lada sebagai bahan masakan karena adanya zat piperin.
Lada diketahui berkhasiat dalam menambah nafsu makan, memperbaiki
sistem pencernaan, menambah cita rasa makanan, meluruhkan keringat,
mingkatkan sekresi asam lambung, meluruhkan flatus, mengurangi rasa
mual, menigkatkan suhu tubuh, serta sebagai stimulan dan antibakteri.
Sementara itu, lada hitam dipercaya dapat digunakan untuk mengobati
konstipasi, diare, sakit telinga, gangren, penyakit jantung, hernia, suara
serak, gangguan pencernaan, gigitan serangga, kesulitan tidur, linu sendi,
gangguan hati, paru bisul dalam mulut dan sakit gigi ( Agoes, 2010 )
Karminative, dan iritasi local (Materia Medica Jilid IV). Piperin
memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, antimalaria, menurunkan berat
badan, menurunkan demam, menetralkan racun bisa ular, antiepilepsi,
membantu meningkatkan penyerapan vitamin tertentu (Kolhe et al., 2009).
Piperin memiliki aktivitas sebagai analgesik dan antipiretik pada tikus, dan
menunjukkan hasil yang sebanding dengan indometasin sebagai obat
standar (Sabina et al., 2013). Kualitas ekstrak buah lada dipengaruhi oleh
kandungan dan kadar senyawa kimia di dalamnya. Proses ekstraksi buah
lada hitam dalam skala industri digunakan pelarut etanol 60% (Agoes,
2009). Senyawa piperin merupakan senyawa identitas yang paling banyak
terkandung dalam buah lada serta memiliki beragam khasiat pengobatan,
maka perlu dipisahkan secara selektif melalui penyarian atau ekstraksi.
Piperin yang terkandung dalam lada hitam dapat meningkatkan
bioavaibilitas suatu obat seperti Barbiturates, Coenzyme Q10 (CoQ10),
Curcumin (extract from turmeric), Dapsone, Ethambutol, Atenolol,
Phenytoin, Propranolol, Pyrazinamide, Rifampicin, Ampicilin, etc (Shingate
et al., 2013).
1.2.4 Golongan Senyawa (alkaloida)
Alkaloid pertama kali diperkenalkan oleh W. Meisner pada awal abad
19 untuk senyawa bahan alam yang bereaksi seperti basa. Alkaloid adalah
12
senyawa nitrogen organik, lazimnya bagian cincin heterosiklik, bersifat
basa, sering bersifat optis aktif dan kebanyakan berbentukkristal. Pada
waktu yang lampau sebagian besar sumber alkaloid adalah pada tanaman
berbunga, angiosperma. Pada tahun-tahun berikutnya penemuan sejumlah
besar alkaloid terdapat pada hewan, serangga organisme laut,
mikroorganisme dan tanaman rendah. Karena alkaloid sebagai suatu
kelompok senyawa yang terdapat sebagian besar pada tanaman
berbunga,maka para ilmuwan sangat tertarik pada sistematika aturan
tanaman. Kelompok teretentu alkaloid dihubungkan dengan family atau
genera tanaman tertentu. Kebanyakan family tanaman yang mengandung
alkaloid yang penting adalah Liliaxea, Rubiaceae, Apocynaceae,
Papilionaceae, Ranunculaceae, Solanaceae dan Papaveraceae. Serta
alkaloida tidak terdapat pada tanaman dengan suku Rosaceae dan Labiatae.
1.2.5 Klasifikasi Senyawa Alkaloid

Alkaloid merupakan sekelompok senyawa, tidak diperoleh definisi
tunggal tentang alkaloid. Banyak usaha untuk mengklasifikasikan alkaloid.
System klasifikasi yang paling banyak diterima, menurut Hegnauer, alkaloid
dikelompokan sebagai:
1) True Alkaloid
Alkaloid sejati adalah senyawa yang mengandung nitrogen pada
struktur heterosiklik, struktur kompleks, distribusi terbatas yang
menurut beberapa ahli hanya ada pada tumbuhan. Alkaloid sejati
ditemukan dalam bentuk garamnya dan dibentuk dari asam amino
sebagai bahan dasar biosintesis. Contohnya Atropine.
2) Pseudoalkaloid
Pseudoalkaloid memiliki mengandung nitrogen pada struktur
heterosiklik tetapi tidak diturunkan dari asam amino. Contoh :
isoprenoid, terpenoid (coniin), dan alkaloid steroidal (paravallarine).
3) Protoalkaloid
Protoalkaloid diturunkan dari asam amino tetapi tidak mengandung
nitrogen pada cincin heterosiklik. Contoh : mescaline, betanin, dan
serotonin (Swastini, Dewa Ayu.2007).
13
4) False alkaloid
Senyawa bukan alkaloid tetapi memberikan rekasi positive terhadap
alkaloid.
a. Penamaan Alkaloid
 Berdasarkan sumber/asalnya (genus dan spesies)
contoh: papaverin,efedrin, atropin, cocain
 Berdasarkan aktivitas farmakologi
contoh : emetine untuk muntah
 Berdasarkan penemunya
contoh : pelleterine (P.J.Pelletier)
 Nama simplisia digunakan
Contoh : ergotamina - ergot
b. Sifat-sifat fisika
Kebanyakan alkaloid yang telah diisolasi berupa padatan Kristal dengan
titik lebur tertentu atau mempunyai kisaran dekomposisi. Sedikit alkaloid
berbentuk amorf (emetin), dan beberapa seperti nikotin dan konini berupa
cairan.
Kebanyakan alkaloid tidak berwarna, tetapi beberapa senyawa yang
kompleks, spesies aromatic berwarna. Pada umumnya basa bebas alkaloid
hanya larut dalam pelarut organic, meskipun beberapa pseudoalkaloid dan
protoalkaloid larut dalam air. Garam alkaloid dan alkaloid quartener sangat
larut dalam air.
c. Sifat-sifat kimia
Kebanyakan alakaloid bersifat basa. Sifat tersebut tergantung pada
adanya pasangan electron pada nitrogen. Jika gugus fungsional yang
berdekatan dengan nitrogen bersifat melepaskan electron, sebagai contoh
gugus alkil maka ketersediaan electron pada nitrogen naik dan senyawa
lebih bersifat basa.
Kebasaan alkaloid menyebabkan senyawa tersebut sangat mudah
mengalami dekomposisi, terutama oleh panas dan sinar dengan adanya
oksigen. Dalam Hasil dari reaksi ini sering berupa N-oksida. Dekomposisi
14
alkaloid selama atau setelah isolasi dapat menimbulkan berbagai persoalan
jika penyimpanan berlangsung dalam waktu yang lama. Pembentukan
garam dengan senyawa organic atau anorganik sering mencegah
dekomposisi. Itulah sebabnya dalam perdagangan alkaloid lazim berada
dalam bentuk garamnya.
1.2.6 Cara Identifikasi Senyawa Alkaloida
a. Reaksi pengendapan
Terbentuknya endapan pada uji Mayer, Wagner dan Dragendorf berarti
terdapat alkaloid didalamnya. Tujuan penambahan HCl adalah karena
alkaloid bersifat basa sehingga biasanya diekstrak dalam pelarut yang
mengandung asam (Harborne, 1987)
Uji Pereaksi Hasil
Fitokimia
Alkaloid Mayer Terbentuk endapan putih
Wagner Terbentuk warna coklat
kemerahan
Dragendroff Terbentuk warna jingga
Flavonoid Mg + HCl pekat Terbentuk warna jingga
Saponin Air + HCl Terbentuk Busa stabil
Steroid Liebermann-burchard Terbentuk warna Hijau
Triterpenoid Liebermann-burchard Terbentuk warna coklat
kemerahan
Tanin FeCl3 1% Terbentuk warna hijau
kehitaman
Hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya

endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kalium-
alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Mayer, larutan merkurium(II) klorida
ditambah kalium iodida akan bereaksi membentuk endapan merah
merkurium(II) iodida. Jika kalium iodida yang ditambahkan berlebih
maka akan terbentuk kalium tetraiodomerkurat(II) (Svehla, 1990)
Alkaloid mengandung atom nitrogen yang mempunyai pasangan
15
elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan
kovalen koordinat dengan ion logam (Marliana dkk., 2005)
Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer, diperkirakan nitrogen

pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium
tetraiodomerkurat(II) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang
mengendap. Perkiraan reaksi yang terjadi pada uji Mayer ditunjukkan
pada Gambar 1.
Gambar 2. Reaksi Alkolid dengan Reagen Mayer
Hasil positif alkaloid pada uji Wagner ditandai dengan terbentuknya

endapan coklat muda sampai kuning. Diperkirakan endapan tersebut
adalah kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Wagner, iodin
bereaksi dengan ion I- dari kalium iodide menghasilkan ion I3- yang
berwarna coklat. Pada uji Wagner, ion logam K+ akan membentuk
ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada alkaloid membentuk
kompleks kalium- alkaloid yang mengendap. Reaksi yang terjadi pada
uji Wagner ditunjukkan pada Gambar 3.
16
Hasil positif alkaloid pada uji Dragendorff ditandai dengan
terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning. Endapan tersebut
adalah
Gambar 3. Reaksi Alkolid dengan reagen Wagner
kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Dragendorff, bismut nitrat

dilarutkan dalam HCl agar tidak terjadi reaksi hidrolisis karena garam-
garam bismut mudah terhidrolisis membentuk ion bismutil (BiO+). Agar
ion Bi3+ tetap berada dalam larutan, maka larutan itu ditambah asam
sehingga kesetimbangan akan bergeser ke arah kiri. Selanjutnya ion
Bi3+ dari bismut nitrat bereaksi dengan kalium iodide membentuk
endapan hitam Bismut(III) iodida yang kemudian melarut dalam kalium
iodida berlebih membentuk kalium tetraiodobismutat.
Pada uji alkaloid dengan pereaksi Dragendorff, nitrogen digunakan

untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan K+ yang merupakan
ion logam. Reaksi pada uji Dragendorff ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4 . Reaksi Alkoloid dengan Reagen Dragendorff

1) Cara percobaan
Timbang 500 mg serbuk simplisia, tambahkan 1 ml asam klorida 2 N
dan 9 ml air, panaskan di atas tangas air selama 2 menit, dinginkan dan
saring. Pindahkan masing-masing 2 tetes filtrate pada dua kaca arloji.
17
Tambahkan 2 tetes Mayer LP pada kaca arloji pertama dan 2 tetes
Bouchardat LP pada kaca arloji kedua.
Jika pada kedua percobaan tidak terjadi endapan, maka serbuk tidak
mengandung alkaloida.
Jika dengan Mayer LP terbentuk endapan menggumpal berwarna putih
atau kuning yang larut dalam methanol P dan dengan Bouchardat LP
terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam, maka ada kemungkinan
terdapat alkaloida.
Lanjutkan percobaan dengan mengocok sisa filtrate dengan 3 ml
ammonia pekat P dan 10 ml campuran 3 bagian volume eter P dan 1 bagian
volume kloroform P. ambil fase organic, tambahkan natrium sulfat anhidrat
P, saring. Uapkan filtrate di atas tangas air. Larutkan sisa dalam sedikit
asam klorida 2 N. lakukan percobaan dengan keempat golongan larutan
percobaan. Serbuk mengandung alkaloida jika sekurang-kurangnya
terbentuk endapan dengan menggunakan 2 golongan larutan percobaan yang
digunakan.
b. Reaksi warna
1) Cara percobaan
Lakukan penyarian dengan campuran eter-kloroform seperti pada
cara Reaksi pengendapan. Pindahkan beberapa ml filtrate pada cawan
porselin, uapkan. Pada sisa tambahkan 1 sampai 3 tetes larutan
percobaan seperti yang tertera pada masing-masing monografi.
c. Identifikasi
1) Pada 2 mg serbuk buah tambahkan 5 tetes asam sulfat P; terjadi warna
coklat tua .
2) Pada 2 mg serbuk buah tambahkan 5 tetes asam sulfat 10 N; terjadi
warna kuning.
3) Pada 2 mg serbuk buah tambahkan 5 tetes asam klorida pekat P; terjadi
warna coklat tua.
4) Pada 2 mg serbuk buah tambahkan 5 tetesasam klorida encer P; terjadi
warna kuning.
18
5) Mikrodestilasikan 20 mg serbuk buah pada suhu 240˚ selama 90 detik
menggunakan tanur TAS, tempatkan hasil mikrodestilasi pada titik
pertama dari lempeng KLT silica gel GF2 5 4P. Timbang 500 mg
serbuk buah, campur dengan 5 ml methanol P dan panaskan di atas
tangas air selama 2 menit, dinginkan. Saring, cuci endapan dengan
methanol P secukupnya sehingga diperoleh 5 ml filtrate. Pada titik
kedua dari lempeng KLT tutulkan 15 μl filtrate dan pada titik ketiga
tutulkan 2 μl larutan piperina P 0.1% b/v dalam etanol P. eluasi dengan
campuran etil asetat P-benzen P (30 + 70) dengan. Jarak rambat 15 cm,
keringkan lempeng di udara selama 10 menit. Amati dengan sinar
biasa dan dengan sinar ultraviolet 366 nm. Semprot lempeng dengan
anisaldehid-asam sulfat LP, panaskan pada suhu 110˚ selama 10 menit.
Amati dengan sinar biasa dan dengan sinar ultraviolet 366 nm
(Hardjono, 1996)
Pada kromatogram tampak bercak-bercak dengan warna dan hRf
sebagai berikut
Dengan sinar biasa Dengan sinar UV 366 nm

No hRf Tanpa
Dengan pereaksi Tanpa pereaksi Dengan pereaksi
pereaksi
1 4–6 - Merah muda Ungu Biru
2 9 – 13 - Biru hijau - Biru muda
3 24 – 30 - Kuning hijau Kuning hijau Kuning hijau terang
4 30 – 33 - Kuning hijau Biru Kuning hijau terang
5 35 – 38 - Biru Biru Ungu muda
6 40 – 44 - Ungu - Ungu kelabu
7 47 – 51 - Biru ungu - Ungu kecoklatan
8 55 – 59 - Merah lembayung - Merah lembayung
9 62 – 66 - Ungu Ungu Ungu terang
10 68 – 70 - Biru ungu - kelabu
Catatan : piperina sebagai pembanding tampak sebagai bercak berwarna kuning
hijau dengan harga hRf 27.
19
1.2.7 Kromatografi Lapis Tipis ( KLT )
Kromatografi lapisan tipis digunakan pada pemisahan zat secara cepat,
dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan
serba rata pada lempeng kaca. Elmpeng yang dilapis, dapat dianggap
sebagi “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan didasarkan pada
penyerapan, pembagian, atau gabungnya, tergantung dari jenis zat
penyerap dan cara oembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut.
Kromatografi lapis tipis dengan penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi
lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan.
Senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis,
tidak tetap jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi
kertas. Karena itu pada lempeng yang sama disamping kromatogram dari
zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda – beda.
Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan
harga Rf dan ukuran yang lebih kurang sama. Ukuran dan itensitas bercak
dapat digunakan untuk memperkirakan kadar. Penetapan kadar yang lebih
teliti dapat dilakukan dengan cara spektrofotometri. Pada kromatografi
lapis tipis dua dimensi, lempeng yang telah dieluasi diputar 90° dan
dieluasi lagi, umumnya menggunakan bejana lain yang berisi pelarut lain
(Depkes RI Materia Medika jilid VI)
 Alat
 Lempeng kaca: tebal seluruh permukaan lempeng kaca sama, umunya
berukuran 20cm x 20cm; sebagai lempeng tapi digunakan lempeng
kaca berukuran 5cm x 20cm.
 Baki lempeng. Umumnya baki lempeng berukuran 122cm x 23cm
dengan satu sisi panjang dan satu sisi pendek yang berbingkai untuk
menahan lempeng kaca. Baki digunakan untuk meletakkan dan
mengatur lempeng kaca pada waktu membuat lapisan zat penyerap
hingga diperoleh permukaan yang rata.
 Rak penyimpanan. Rak penyimpanan dipergunakan untuk tempat
lempeng tang telah dilapisi zat penyerap pada waktu pengeringan atau
pemindahan. Rak mempunyai ukuran yang cocok sehingga dapat
20
masuk kedalam lemari pengering. Dapat memuat lebih kurang 10
lempeng dengan jarak tertentu.
 Zat penyerap. Zat penyerap yang terdiri dari zat penyerap
kromatografi yang halus. Zat penyerap yadapat dilapiskan langsung
pada lempeng kaca atau dengan pertolongan zat perekat, misalnya
kalsium sulfat anhidrat 5% sampai 15% atau kanji. Kalsium sulfat
tidak dapat memberikan permukaan yang keras seperti kanji, tetapi
tidak terpengaruh pereaksi semprot yang bersifat oksidator kuat.
 Alat pembuat lapisan. Berbentuk bak panjang yang dibuat dengan
teliti mempunyai celah memanjang pada dasarnya. Bobot alat
sedemikian rupa, sehingga jika digerakkkan ke atas lempeng kaca,
akan memberikan lapisan zat penyerap pada seluruh permukaan
lempeng setebal 0m25 mm. Untuk memperoleh tebal lapisan yang
lain, digunakan alat pembuat lapisan yang dapat diatur.
 Bejana Kromatografi. Umumnya dapat memuat 2 lempeng kaca dab
dapat tertutup rapat. Kedalam bejana dapat dimasukkan sebuah rak
penyangga terbuat dari baja tahan kaat tang dapat emuat 2 lempeng
kaca sebelah menyebelah. Bagian atas bejana terasah halus dan rata
dan dapat ditutup rapat dengan tutup kaca dengan pertolongan lemak
penutup
 Sablon. Umunya dibuat dari plastik, digunakan untuk membantu
memberi tanda pada lempeng, misalnya untuk memberi tanda pada
tempat penutulan dengan jarak tertentu dan untuk membantu memberi
tanda – tanda lain pada lempeng.
 Pipet mikro. Pipet mikr berskala 10µl untuk memindahkan cairan.
Jumlah larutan zat yang diperiksa dan larutan baku yang harus
ditutulkan, tertera pada masing – masing monografi.
 Alat penyemprot pereaksi.alat penyemptoy tahann terhadap pereaksi
dan dapat menyemprotkan pereaksi dalam bentuk butir – butir halus.
 Pelarut; larutan pembanding; larutan zat yang diperiksa; pereaksi.
Tertera pada masing – masing monografi.
21
 Lampu ultraviolet. Lampu ultraviolet yang cocok untuk pengamatan
dengan panjang gelombang pendek ( 254nm ) dan dengan panjang
gelombang panjang ( 366nm ).
 Cara kerja
Bersihkan lempeng kaca dengan cara memcelup kedalam asam
pencuci, bilas dengan air secukupnya hingga air mengalir dari lempeng
kaca tanpa meninggalkan tetesan air atau noda minyak, keringkan dengan
lap bersih. Pada waktu melapiskan zat penyerap, lempeng harus bebas dari
serat atau debu. Atur lempeng kaca di atas baki lempeng, letakkan
lempeng tepi berukuran 5cm x 20cm pada ujung dan pangkal baki
usahakan agar pada waktu melapisi semua lempeng tidak ada yang
tergeser. Letakkan alat pembuat lapisan pada ujung baki. Kecuali
dinyatakan lain, campur satu bagian zat penyerap dengan dua bagian
volume air, kocok kuat – kuat dalam labu Erlenmeyer bersumbat kaca
sekama 30 detik. Tuangkan massa kental kedalam alat pembuat lapisan,
umumnya 30g zat penyerap dan 60ml air cukup untuk 5 lempeng
berukuran 20cm x 20cm. Pekerjaan melapisi ini harus selesai dalam waktu
2 menit sejak penambahan air, karena setelah 2 menit campuran mulai
menjadi keras. Geser hati – hati alat pembuat lapisan diatas lemepng kaca
ke arah sisi pendek baki yang berbingkai. Jika telah sampai pada lempeng
tepi terakhir, angkat alat pembuat lapisan. Cuci segera alat pembuat
lapisan. Biarkan lempeng selama 5 menit kemudian pindahkan lempeng,
dengan lapisan menghadap ke atas, pada rak penyimpanan, keringkan pada
suhu 105° selama 30 menit. Setelah lempeng kering, biarkan dingin hingga
suhu kamar dan amati serba ratanta pembagian dan susunan zat penyerap.
Cahaya yang ditransmisikan akan menunjukkan keserba rataan susunan.
Simpan lempeng yang baik dalam eksikator yang cocok. Kecuali
dinyatakn lain pada masing – masing monografi tempatkan pada sisi
bejana kromatografi, 2 helai kertas saring, tinggi 18cm lebar sama dengan
panjang bejana.
Masukkan lebih kurang 100ml pelarut kedalam bejana kromatografi
hingga tinggi pelarut 0,5 cm sampai 1 cm, tutup rapat, biarkan sistem
22
mencapai kesimbangan, kertas saring harus basah seluruhnya. Keempat
sisi bejana dapat juga dilapisi dengan kertas saring. Kertas saring pada
dasar bejana harus tercelup kedalam pelarut. Tutulkan terpisah dengan
jarak lebih kurang 1,4cm larutan zat yang diperiksa dan larutan
pembanding, menurut cara yang tertera pada masing – masing monografi
dan terletak lebih kurang 2cm dari tepi bawah lempeng, biarkan kering.
Tepi bawah lempeng adalah bagian lempeng yang terdahulu dilalui alat
pembuat lapisan pada waktu melapiskan zat penyerap. Sablon untuk
membantu menentukkan titik tempat penutulan dan jarak yang harus
dilalui pelarut. Tempatkan lempeng pada rak penyangga, hingga tempat
penutulan terletak disebalah bawah, masukkan rak penyangga ke dalam
bejana. Pelarut yang ada didalam bejana harus mencapai tepi bawah
lapisan penyerap, tempat penutulan tidak boleh terendam. Tutup rapat
dengan pertolongan zat lemak penutup, biarkan hingga pelarut merambat
lebih kurang 10cm di atas titik penutulan; umumnya berlangsung selama
15 menit sampai 1 jam; keluarkan lempeng.
Keringkan diudara, amati bercak mula – mula dengan sinar ultraviolet
gelombang pendek (254 nm) kemudian dengan sinar ultraviolet
gelombang panjang (366 nm).
Ukur dan catat jarak bercak dari titik penutulan, dan catat panjang
gelombang untuk tiap bercak yang tampak. Jika perlu, semprot bercak
dengan pereaksi yang tertera pada monografi, amati dan bandingkan
kromatogram zat yang diperiksa dengan kromatogram zat pembanding.
Hitung harga Rf seperti pada Kromatografi kertas.
23
1.3 PROSEDUR KERJA
1.3.1 Preparasi Sampel
a. Ekstrak sebanyak 0,9 gram ditambah etanol ad larut, ditambah 5 ml
HCl 2N, dipanaskan diatas penangas air selama 2 – 3 menit, sambil
diaduk.
b. Setelah dingin ditambah 0,3 gram NaCl, diaduk rata kemudian
disaring.
c. Filtrat ditambah 5 ml HCl 2N. Filtrat dibagi menjadi 3 bagian dan
disebut sebagai larutan IA, IB, dan IC.
1.3.2 Reaksi Pengendapan

a. Larutan IA ditambah pereaksi Mayer, larutan IB ditambah dengan
pereaksi Wagner dan laturan IC dipakai sebagai blanko.
b. Adanya kekeruhan atau endapan menunjukan adanya alkaloid.
1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

a. Larutan IC ditambah NH4OH pekat 28% sampai larutan menjadi basa,
kemudian diekstraksi dengan 5 ml kloroform (dalam tabung reaksi).
b. Filtrat (fase CHCL3) diuapkan sampai 1/3 bagian, kemudian untuk
pemeriksaan KLT.
Fase diam : Kiesel gel GF 254
Fase gerak : CHCL3 – Etil asetat (1:1)
Penampak noda : Pereaksi Dragendorf
c. Jika timbul warna jingga menunjukan adanya alkaloid dalam ekstrak.
24
1.4 SKEMA KERJA
Ekstrak sebanyak 0,9 Ditambah etanol ad Ditambah 5 ml HCl

gram tepat larut 2N
Filtrat ditambah 5 ml HCl 2N, Setelah dingin, ditambah 0,3

kemudian dibagi menjadi 4 gram NaCl, diaduk rata Dipanaskan diatas
bagian : IA, IB, IC, ID. kemudian disaring penangas air selama
2-3 menit, sambil
diaduk
Larutan IA ditambah Adanya alkaloid

pereaksi Mayer, ditunjukan dengan
larutan IB ditambah adanya kekeruhan
dengan pereaksi atau endapan.
Wagner, dan larutan
IC sebagai blanko.
25
Larutan ID Lalu dicek menggunakan Direaksikan

ditambah kertas lakmus sampai larutan dengan 5 ml
NH4OH, menjadi basa. kloroform
Kemudian siap untuk

pemeriksaan KLT :
Fase gerak : CHCL3 – Etil
Salisilat (1:1)
Filtrat diuapkan
Penampak noda : Pereaksi
sampai 1/3
dragendorf
bagian
Jika timbul warna jingga menunjukan adanya alkaloid dalam ekstrak.
26
1.5 BAGAN ALIR
Ekstrak sebanyak 0,9 gram
Ditambah etanol ad tepat larut
Ditambah 5 ml HCl 2N
Dipanaskan diatas penangas air selama 2-3

menit, sambil diaduk
Setelah dingin, ditambah 0,3 gram NaCl, diaduk rata

kemudian disaring
Filtrat ditambah 5 ml HCl 2N, kemudian dibagi menjadi 4 bagian :
IA, IB, IC, ID.
Larutan IA ditambah pereaksi Mayer, larutan IB ditambah dengan pereaksi Wagner, dan
larutan IC sebagai blanko.
Larutan ID ditambah NH4OH,, lalu dicek menggunakan kertas lakmus sampai larutan menjadi basa.
Adanya alkaloid ditunjukan dengan

adanya kekeruhan atau endapan.
Filtrat diuapkan sampai 1/3 bagian

kemudian disaring
Direaksikan dengan 5 ml kloroform
Kemudian siap untuk pemeriksaan KLT :

Jika timbul warna
jingga menunjukan
Fase gerak : CHCL3 – Etil Salisilat (1:1)
adanya alkaloid dalam
Penampak noda : Pereaksi dragendorf
ekstrak.
27
1.6 HASIL PENGAMATAN
Larutan IA positif
Setelah eluasi,
alkaloid (endapan putih)
menggunakan
Larutan I B + pereaksi UV 254
wagner (endapan coklat)
Setelah penambahan
pereaksi dragendorf, Sebelum eluasi,
menggunakan UV 254 menggunakan
UV 365
Setelah penambahan Setelah eluasi,

pereaksi dragendorf, menggunakan
menggunakan UV 365 UV 365
Sebelum eluasi, Garis titik noda

menggunakan untuk menentukan
UV 254 harga Rf
1.6.1 Perhitungan Rf
a. Rf = 1,2 / 8 = 0,15 cm
b. Rf = 4,88 / 8 = 0,61 cm
c. Rf = 5,28 / 8 = 0,66 cm
28
1.7 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa alkaloid
pada tanaman lada hitam (Piper nigrum). Untuk mengetahui ada tidaknya
alkaloid pada tanaman lada hitam (Piper nigrum) diidentifikasi dengan cara
reaksi pengendapan dan kromatografi lapis tipis (KLT).
Pada ekstrak lada hitam (Piper nigrum) hasil analisis terdapat golongan
senyawa alkaloid dengan tes uji warna menggunakan pereaksi Mayer dan
Wagner. Pada tabung IIA diberikan pereaksi Mayer dan tabung IIB diberikan
peraksi Wagner. Adanya alkaloid tersebut dapat dilihat dari terbentuknya
endapan dan warna yang keruh pada uji Mayer maupun pada uji Wagner.
Sebelum penambahan pereaksi ada penambahan HCl yang tujuanya adalah
karena alkaloid bersifat basa sehingga biasanya diekstrak dengan pelarut yang
mengandung asam, kemudian perlakuan ekstrak dengan NaCl setelah
penambahan HCl dilakukan untuk menghilangkan protein. Adanya protein
yang mengendap pada penambahan pereaksi yang mengandung logam berat
(pereaksi Mayer) dapat memberikan reaksi positif palsu pada beberapa
senyawa.
Hasil yang didapat pada tabung IIA adalah positif alkaloid karena pada uji
Mayer ditandai dengan terbentuknya endapan putih. Diperkirakan endapan
tersebut adalah kompleks kalium-alkaloid. Pada uji alkaloid dengan pereaksi
Mayer, diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam
K+ dari kalium tetraiodomerkurat(II) membentuk kompleks kalium-alkaloid
yang mengendap.
Hasil pada tabung IIB dengan uji Wagner adalah positif alkaloid hal ini
ditandai dengan terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning.
Diperkirakan endapan tersebut adalah kalium-alkaloid.. Pada uji Wagner, ion
logam K+ akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada
alkaloid membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap.
Selanjutnya dilakukan uji dengan Kromatografi Lapis Tipis. Pada hasil
identifikasi senyawa alkaloid pada ekstrak Piper nigrum L. dengan
menggunakan KLT didapatkan 3 noda berwarna jingga. Pada identifikasi ini
digunakan pemisahan senyawanya dengan menggunakan KLT karena salah
29
satu keunggulannya yaitu pemisahan dapat dilakukan dengan cepat. Pada saat
mengambil filtrat selanjutnya akan tercampur dengan fase lain. Dalam proses
ektraksi digunakan kloroform karena memiliki kemmapuan untuk mengambil
senyawa yang bersifat non polar, maka hal ini sesuai dengan pengujian yang
dilakukan kali ini. Setelah dilakukan pengambilan filtrat kemudian kemudian
diuapkan hal ini bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi dari senyawa yang
akan diidentifikasi lebih pekat sehingga mempermudah untuk pengamatan.
Setelah diuapkan dilakukan penotolan pada plat KLT yang kemudian
dilakukan eluasi, hal ini bertujuan untuk menarik senyawa alkaloida. Setelah
dieluasi sampel diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 365 nm maka noda
akan tampak berwarna jingga. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak Piper
nigrum L. positif mengandung alkaloida. Digunakan pereaksi dragendorf
karena pereaksi ini untuk mengetahui bahwa tanaman yang diamati
mengandung alkaloida atau tidak. Jika positif megandung alkaloida
menghasilkan warna orange hal ini dibukatikan karena pada senyawa basa
pada tanaman sehingga akan membentuk senyawa garam. Dari noda yang
tampak maka dapat diketahui harga Rf nya yang pada praktkum kali ini harga
Rf yang dihasilkan yaitu 0,15; 0,61 dan 0,66. Harga Rf merupakan parameter
karakteristik dari KLT. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu
senyawa pada kromatogram.
30
1.8 KESIMPULAN
 Pada uji reaksi pengendapan dengan reaksi mayer dan wagner, didapatkan
hasil positif bahwa ekstrak Piper Nigrum L mengandung alkaloid. Pada
uji KLT, menunjukkan adanya warna jingga pada lempeng KLT maka
dapat disimpulkan bahwa sampel ekstrak tanaman Piper Nigrum L
mengandung senyawa golongan alkaloida dengan nilai Rf I 0,15, Rf II
0,61, dan Rf III 0,66.
 Dari hasil identifikasi senyawa alkaloida pada ekstrak Piper nigrum L.
dengan ,enggunakan reaksi pengendapan maupun KLT menunjukkan
bahwa ekstrak Piper nigrum L. mengandung atau terdapat senyawa
alkaloida.
31
DAFTAR PUSTAKA
Agoes,Azwar.2010.Tanaman Obat Indonesia.Jakarta : Salemba Medika
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.1979.Materia Medica Indonesia Jilid
III.Jakarta : Direktorat Pengawasan Obat dan Makanan
Harborne,J.B.1987.Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, diterjemahkan oleh Padmawinata, K. Bandung : ITB
Hikmawati, Ni Putu.dkk.2016. Kandungan Piperin Dalam Ekstrak Buah Lada
Hitam Dan Buah Lada Putih (Piper nigrum L.) Yang Diekstraksi Dengan
Variasi Konsentrasi Etanol Menggunakan Metode Klt-Densitometri. Jakarta :
Media Farmasi Vol. 13
Sastrohamidjojo, Hardjono. 1996. SINTESIS BAHAN ALAM. Gadjah Mada
University Press: Yogyakarta.
Svehla.1990.Vogel Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan
Semimikro. Jakarta : PT. Kalman Media Pustaka.
32
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN GLIKOSIDA SAPONIN,

TRITERPENOID DAN STEROID (Ekstrak Sapindus rarak DC)
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
33
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan glikosida
saponin, triterpenoid, dan steroid dalam tanaman.

1.2.1 Tanaman Klerak (Sapindus rarak DC.)
Kingdom :Plantae(Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)
Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)
Sub Kelas : Rosidae
Ordo : Sapindales
Famili : Sapindaceae
Genus : Sapindus
Spesies : Sapindus rarak DC
Gambar 1 : Buah lerak
Tumbuhan lerak berbentuk pohon dan rata-rata memiliki tinggi 10m

walaupun bisa mencapai 42 meter dengan diameter 1m, karenanya pohon
lerak besar dengan kualitas kayu yang setara kayu jati banyak ditebang
karena memiliki nilai ekonomis. Bentuk daunnya bulat-telur berujung
runcing, bertepi rata, bertangkai pendek dan berwarna hijau. Biji
terbungkus kulit cukup keras bulat seperti kelereng, kalau sudah masak
warnanya coklat kehitaman, permukaan buah licin dan mengkilat.
34
Sapindus rarak merupakan tanaman rimba yang tingginya mencapai 42
m dan batangnya 1 m. Tanaman ini tumbuh liar di Jawa pada ketinggian
antara 450 dan 1500 m diatas permukaan laut. Tanaman ini mempunyai
batang berwarna putih kotor. Daun tanaman ini majemuk menyirip ganjil
dan anak daun berbentuk lanset. Bunga tanaman ini melekat di pangkal,
kuning, dan daun mahkotanya empat. Tanaman ini mempunyai buah yang
keras, bulat, diameter + 1,5 cm dan berwarna kuning kecoklatan (Gambar
1). Biji tanaman ini tunggang dan kuning kecoklatan. Buah lerak terdiri
dari 73% daging buah dan 27% biji.
1.2.2Kandungan Senyawa Tanaman

Berdasarkan hasil penelitian yang dimuat di beberapa jurnal
menyebutkan bahwa buah, kulit batang, biji, dan daun tanaman lerak
mengandung polifenol, dan tanin. Menurut Widowati (2003) dalam
Syahroni (2013), saponin terdapat pada semua bagian tanaman Sapindus
dengan kandungan tertinggi terdapat pada bagian buah. Pengujian secara
kualitatif senyawa yang terdapat pada daging buah diantaranya adalah
triterpen, alkaloid, steroid, antrakinon, tanin, fenol, flavonoid, dan minyak
atsiri (Sunaryadi, 1999). Wina et al. (2005) menyatakan bahwa kulit buah,
biji, kulit batang dan daun lerak mengandung saponin dan flavonoid,
sedangkan kulit buah juga mengandung alkaloida dan polifenol. Kulit
batang dan daun tanaman lerak mengandung tanin. Senyawa aktif yang
telah diketahui dari buah lerak adalah senyawa–senyawa dari golongan
saponin dan sesquiterpen. Saponin berasal dari bahasa latin Sapo yang
berarti sabun karena sifatnya yang menyerupai sabun. Saponin merupakan
senyawa kimia yang berasal dari metabolit sekunder yang banyak
diperoleh dari tumbuh-tumbuhan. Struktur kimia saponin yang terdiri dari
senyawa polar dan non-polar menjadikan buah lerak dikenal sebagai
soapberry atau soapnut. Saponin memiliki sifat berasa pahit, berbentuk
busa stabil dalam air, bersifat racun bagi hewan berdarah dingin (seperti :
ikan, siput, dan serangga), dapat menstabilkan emulsi, dan menyebabkan
hemolisis (rusaknya sel darah merah).
35
1.2.3 Golongan Senyawa
a. Glikosida Saponin
Saponin adalah jenis glikosida yang banyak ditemukan dalam
tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih. Sehingga ketika
direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang dapat
bertahan lama. Saponin mudah larut dalam air dan tidak larut dalam eter.
Saponin memberikan rasa pahit pada bahan pangan nabati. Sumber
utama saponin adalah biji-bijian khususnya kedele. Saponin dapat
menghambat pertumbuhan kanker kolon dan membantu kadar kolesterol
menjadi normal. Tergantung pada jenis bahan makanan yang dikonsumsi,
seharinya dapat mengkonsumsi saponin sebesar 10-200 mg.
Secara umum saponin merupakan bentuk glikosida yang memiliki
aglikon berupa steroid dan triterpen. Triterpen merupakan jenis senyawa
bahan alam yang memiliki 6 monoterpen atau memiliki jumlah atom
karbon sebanyak 30. Dari aglikonnya saponin dapat bagi menjadi dua
yaitu saponin dengan steroid dan saponin dengan triterpene
1) Tipe steroid
Tersusun atas inti steroid (C27)
dengan molekul karbohidrat. Steroid
saponin dihidrolisis menghasilkan
satu aglikon yang dikenal sebagai
sapogenin. Tipe saponin ini memiliki
efek antijamur. Pada binatang Gambar 2 : Struktur Dasar Steroid
menunjukan penghambatan aktifitas otot
polos. Saponin steroid diekskresikan setelah koagulasi dengan asam
glukotonida dan digunakan sebagai bahan baku pada proses biosintetis
obat kortikosteroid. Saponin jenis ini memiliki aglikon berupa steroid
yang di peroleh dari metabolisme sekunder tumbuhan. Jembatan ini
juga sering disebut dengan glikosida jantung, hal ini disebabkan karena
memiliki efek kuat terhadap jantung
36
2) Tipe triterpenoid
Tersusun atas inti triterpenoid
dengan molekul karbohidrat.
Dihidrolisis menghasilkan suatu aglikon
yang disebut sapogenin ini merupakan
suatu senyawa yang mudah dikristalkan
lewat asetilasi sehingga dapat
dimurnikan. Tipe saponin ini adalah Gambar 3 : Stuktur Dasar Triterpen
turunan –amyrine.
3) Glikosida Steroid
Glikosida steroid adalah glikosida yang aglikonnya berupa steroid.
Glikosida steroid disebut juga glikosida jantung karena memiliki daya
kerja kuat dan spesifik terhadap otot jantung. Struktur Kimiawi Secara
kimiawi bentuk struktur glikosida jantung sangat mirip dengan asam
empedu yaitu bagian gula yang menempel pada posisi tiga dari inti
steroid dan bagian aglikonnya berupa steroid yang terdiri dari dua tipe
yaitu tipe kardenolida dan tipe bufadienolida. Tipe kardenolida
merupakan steroid yang mengandung atom C-23 dengan rantai samping
terdiri dari lingkaran lakton 5-anggota yang tidak jenuh dan alfa-beta
menempel pada atom C nomor 17 bentuk beta. Sementara tipe
bufadienolida berupa homolog dari kardenolida dengan atom C-24 dan
mempunyai rantai samping lingkaran keton 6-anggota tidak jenuh
ganda yang menempel pada atom C nomor 17.
4) Glikosida triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari
enam satuan isopren, dimana kerangka karbonnya dibangun oleh dua
atau lebih satuan C5 tersebut. Senyawa terpenoid terdapat bebas dalam
jaringan tanaman, tetapi banyak diantaranya yang terdapat sebagai
alkohol, aldehid (Harbone,1987), glikosida dan ester asam aromatik
(Sastrohamidjojo, 1996). Struktur Kimia Isopren Triterpenoid merupakan
senyawa yang tidak berwarna, berbentuk kristal, bertitik leleh tinggi dan
optik aktif, yang umumnya sukar dicirikan karena tidak mempunyai
37
kereaktifan kimia. Kebanyakan senyawa ini memberikan warna hijau-
biru dengan pereaksi Liebermann-Burchard (asam asetat anhidrid-asam
sulfat pekat) (Harborne, 1987).
1.2.4 Identifikasi Senyawa Saponin

a. Uji Buih
Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti
sabun sehingga keberadan saponin sangat mudah ditandai dengan
pembentukan larutan koloidal dengan air yang apabila dikocok
menimbulkan buih yang stabil selama 10 menit (Anonim, 2009)
Dapat terbentuk buih dikarenakan oleh sifat saponin yang dapat
menurunkan tegangan permukaan air. Seperti sabun atau detergen, saponin
mempunyai molekul besar yang mengandung gugus hidrofilik dan lipofilik
(hidrofobik). Dalam air, molekul saponin mensejajarkan atau meluruskan
diri secara vertikal pada permukaannya, dengan gugus lipofilik
(hidrofobik) menjauhi air.
Dengan adanya air, gugus hidrofil akan berikatan dengan air
sedangkan gugus hidrofob akan menjauhi air atau mengarah ke atas
(udara). Bagian polar (hidrofil) dapat bergabung dengan molekul air, tetapi
bagian nonpolar (hidrofob) ditolak karena gaya adhesif yang dapat terjadi
dengan air lebih kecil dibandingkan dengan gaya kohesif antara molekul-
molekul air. Akibatnya zat tersebut diadsorpsi pada antarmuka air-udara
(Martin, 1993)
Adsorpsi molekul saponin pada permukaan air dapat mengakibatkan
penurunan tegangan permukaan air yang dapat menimbulkan buih. Buih
merupakan suatu struktur yang relatif stabil yang terdiri dari kantong-
kantong udara terbungkus dalam lapisan tipis cairan, dispersi gas dalam
cairan yang distabilkan oleh suatu zat penurun tegangan permukaan.
Dengan adanya alasan ini saponin diklasifikasikan sebagai zat penurun
tegangan permukaan (Mills, 2000).
b. Uji Liebermann-Burchard
Uji reaksi ini dilakukan untuk membuktikanada tidaknya senyawa
triterpenoid atau steroid dalam tanaman. Karena reaksi ini positif dengan
38
kebanyakan triterpenoid dan steroid setelah dipanasi dengan asam asetat
anhidrat sebagai pereaksi menghasilkan warna kuning kecoklatan yang
berubah menjadi merah keunguansetelah ditetesi dengan asam sulfat yang
berfungsi sebagai oksidatorz
Gambar 4 : Reaksi Liebermann Burchard pada Steroid
c. Reaksi salwoski
Reaksi warna lain yang digunakan adalah reaksi Salkowski. Reaksi ini
untuk menentukan atau mempertegas bahwa senyawa yang terdapat dalam
tanaman adalah terpenoid. Hal tersebut dapat dilihat dari hasil positif
adanya warna kuning kecoklatan yang lama-kelamaan berubah menjadi
merah tua setelah ditambah dengan asam sulfat pekat. Kloroform
digunakan sebagai pelarut, karena aglikon yang terdapat dalam herba
krokot larut dalam kloroform. Sedangkan asam sulfat pekat yang
ditambahkan digunakan sebagai katalis dalam reaksi tersebut.
1.2.5 Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis

KLT merupakan metode kromatografi cair yang melibatkan dua fase
yaitu fase diam dan fase gerak. Fase geraknya berupa campuran pelarut
pengembang dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi
sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi
sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fase
diam pada KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai
39
penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir
segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT,
contohnya silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur
(tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling
banyak dipakai dalam KLT.
40
1.3 PROSEDUR KERJA
1.3.1 Uji Buih
 Ekstrak sebanyak 0,2 gram dimasukkan tabung reaksi, kemudian

ditambah air suling 10 ml, dikocok kuat-kuat selama kira-kira 30 detik.
 Tes buih positif mengandung saponin bila terjadi buih yang stabil
selama lebih dari 30 menit dengan tinggi 3 cm diatas permukaan cairan.
1.3.2 Reaksi Warna

a. Preparasi Sampel
0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam 15 ml etanol, lalu dibagi menjadi 3
bagian masing-masing 5 ml, disebut sebagai larutan IIA, IIB, dan IIC.
 Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIB sebanyak 5 ml
ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat, amati
perubahan warna yang terjadi. Kemudian kocok perlahan dan diamti
terjadinya perubahan warna.
 Terjadinya warna hijau biru menunjukan adanya saponin steroid,
warna merah ungu menunjukan adanya saaponin triterpenoid dan
warna kuning mudah menunjukan adanya saponin triterpenoid/steroid
jenuh.
c. Uji Salkowski
 Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIC sebanyak 5 ml
ditambah 1-2 ml H2SO4 pekat melalui tabung reaksi.
 Adanya steroid tak jenuh ditandai dengan timbulnya cincin warna
merah.
1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis

a. Identifikasi sapogenin steroid/triterpenoid
 Ekstrak sebanyak 0,5 gram ditambah 5 ml HCl 2N, didihkan dan tutup
dengan corong besisi kapas basah selama 50 menit untuk
menghidrolisis saponin.
41
 Setelah dingin, tambahkan ammonia sampai basa, kemudian ekstraksi
dengan 4-5 ml n-heksan sebanyak 2x, lalu uapkan sampai tinggal 0,5
ml, totolkan pada plat KLT.
Fase diam : Kiesel Gel 254
Fase gerak : n-heksan-etil asetat (4:1)
Penampak noda : Anisaldehid asam sulfat (dengan pemanasan)
 Adanya sapogenin ditunjukan dengan terjadinya warna merah ungu
(ungu) untuk anesaldehida asam sulfat
b. Identifikasi Terpenoid/Steroid Bebas Secara KLT
 Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes n-heksan, diaduk sampai
larut, totolkan pada fase diam.
 Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :
 Adanya terpenoid/steroid ditunjukan dengan terjadinya warna merah
ungu atau ungu
42
1.4 SKEMA KERJA
1.4.1 Uji Buih
Dikatakan positif
saponin jika terjadi
buih yang stabil
Timbang 0,2 Masukkan dalam tabung reaksi selama >30menit
gram ekstrak lalu tambahkan aquadest 10 ml dengan tinggi 3cm
kocok kuat selama 30 detik diatas permukaan
air.
1.4.2 Reaksi Warna

a. Preparasi Sampel
Dibagi menjadi 3
bagian masing-
masing 5 ml
0,5 gram ekstrak IIA, IIB, IIC
dilarutkan dalam 15
ml etanol
IIA = sebagai
blanko
Warna hijau :
+ 3 tetes asam asetat glasial
adanya saponin
steroid.
IIB Warna merah
ungu : adanya
+ 3 tetes asam asetat glasial saponin
triterpenoid
Kuning muda :
adannya saponin
triterpenoid
/steroid jenuh
43
c. Uji Salkowski
IIA = sebagai
blanko
1 – 2 ml H2SO4 pekat, Timbulnya cincin warna

IIC merah menunjukan
melalui dinding tabung.
adanya steroid tak jenuh

Dididihkan dan ditutup

dengan corong berisi
kapas basa selama 50
menit
0,5 g ekstrak ditambah 5
ml HCl 2N
Setelah dingin ditambahkan Ammonia sampai basa, kemudian

diekstraksi dengan 4-5 ml n-heksana sebanyak 2x
Diuapkan sampai 0,5 ml Ditotolkan pada plat KLT
b. Identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT
Ekstrak ditambah n-heksan 1-2ml, diaduk sampai larut kemudian

ditotolkan pada fase diam
44
1.5 BAGAN ALIR
1.5.1 Uji Buih
Masukkan 0,2 gram ekstrak kedalam tabung reaksi
Tambahkan aquadest 10 ml lalu dikocok kuat selama 30 detik
Dikatakan positif saponin jika terjadi buih yang stabil selama >30
menit dengan tinggi 3cm diatas permukaan air.
1.5.2 Reaksi Warna

a. Preparasi sampel
0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam 15 ml etanol
Dibagi menjadi 3 bagian (IIA, IIB, IIC) masing-

masing 5 ml
IIA = sebagai blanko
IIB = ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat & 1 tetes H2SO4 pekat.
Kemudian dikocok perlahan
Warna hijau : Warna merah Kuning muda :

adanya saponin ungu : adanya adannya saponin
steroid. saponin triterpenoid
triterpenoid /steroid jenuh
45
c. Uji Salkowski
IIA = sebagai blanko
IIC = ditambahkan 1 – 2 ml H2SO4 pekat, melalui dinding tabung.
Timbulnya cincin warna merah menunjukan adanya

steroid tak jenuh

0,5 gram ekstrak ditambah 5 ml HCL 2N
didihkan dan tutup dengan corong besisi kapas basah selama 50 menit untuk menghidrolisis saponin.
Tambahkan amonia, lalu dicek menggunakan kertas lakmus sampai basa.
Tambahkan 4-5 ml n-heksan, kemudian di ekstraksi. Lakukan 2x ekstraksi.

Uapkan sampai dengan 5 ml, kemudian totolkan pada plat KLT. Siap untuk
pemeriksaan KLT.

Adanya sapogenin ditunjukan dengan terjadinya warna merah ungu (ungu)

untuk anesaldehida asam sulfat
46
b. Terpenoid/Steroid Bebas Secara KLT
Diaduk sampai larut. Lalu totolkan pada fase diam
Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes n-heksan

Siap untuk ppemeriksaan KLT :
Adanya terpenoid/steroid ditunjukan dengan terjadinya warna

merah ungu atau ungu.
47
1.6 HASIL PENGAMATAN
Hasil positif saponin pada Sebelum eluasi

uji buih dengan tinggi buih pada UV 254
6 cm selama 3 menit
Hasil positif steroid

tak jenuh dengan Sebelum eluasi
adanya cincin merah pada UV 365
pada uji salkowski
Hasil positif
Setelah eluasi
saponin adanya
pada UV 254
warna merah
keunguan pada uji
liebermaan
Setelah eluasi +
Setelah eluasi + penampak penampak noda
noda anisaldehida asam anisaldehida
sulfat pada sinar tampak asam sulfat
pada UV 365
Letak noda : 3 cm
Rf : 3cm / 8 cm = 0,4 cm
48
1.7 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa
golongan glikosida saponin, triterpenoid dan steriod dalam ekstrak tanaman
lerak (sapindus rarak) dengan berbagai metode.Senyawa golongan
glikosida saponin, triterpenoid dan steriod dalam tanaman lerak dapat
diidentifikasi dengan beberapa uji diantaranya : Uji buih, reaksi warna (uji
Liebermann-Burchard, uji Salkowski), identifikasi sapogenin
steroid/triterpenoid dengan KLT dan identifikasi terpenoid/steroid bebas
KLT.
Secara kimia terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat pada
sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstraksi dengan
eter,minyak bumi, kloroform dan dapat dipisahkan secara KLT pada silica
gel. Tapi sering kali ada kesulitan saat mendeteksi dalam skala mikron
karena banyak senyawa tidak berwarna dan tidak ada pereaksi kromogenik
yang peka. Untuk itu dilakukan penyemprotan dengan anisaldehid asam
sulfat yang akan dipanaskan untuk penampak noda.
Saponin merupakan salah satu golongan senyawa triterpenoid, yaitu
senyawa yang mempunyai kerangka karbonil dari satuan isopren (Harborn,
1987). Saponin merupakan senyawa aktif permukaan. Steroid adalah
triterpen yang kerangka dasarnya sistem cincin siklopentana
perhidrofenatrena. Umumnya berada dalam bentuk bebas sebagai glikosida
sederhana.
Untuk metode pengujian yang pertama yaitu Uji Buih yang
merupakan Uji spesifik untuk saponin, karena saponin merupakan senyawa
aktif permukaan maka cara termudah untuk identifikasi saponin adalah
memanfaatkan sifatnya yang akan membentuk busa pada permukaan air.
Oleh karena itu, pada praktikum ini diuji kemampuan membentuk buih dari
ekstrak Sapindus rarak DC yang dikocok kuat dalam air dan berdasarkan
hasil pengamatan dari praktikum didapatkan hasil buih yang stabil selama
>30menit dengan tinggi buih 6 cm. Hal ini menunjukan sampel yang
diujikan positif mengandung saponin.
49
Selanjutnya dilakukan uji reaksi warna yang dilakukan terlebih dahulu
preparasi sampel dengan cara dimasukan sejumlah ekstrak dalam tabung
reaksi kemudian dilarutkan dalam etanol, hal ini bertujuan untuk
memisahkan gugus steroid dengan senyawa lain. Selain itu Digunakan
etanol dikarenakan etanol merupakan pelarut universal karena dapat
memisahkan senyawa dari yang bersifat polar sampai non polar. Selain itu,
etanol dapat memisahkan komponen steroid secara optimal. Setelah
penambahan etanol dan larutan telah dihomogenkan, selanjutnya dibagi
menjadi 3 bagian, larutan IIA IIB IIC. Larutan A sebagai blanko, larutan B
untuk uji Liebermann-Burchard ditambahkan dengan H2SO4 pekat dan
asam asetat anhidrat. Tujuan penambahan H2SO4 pekat adalah untuk
memutuskan ikatan gula pada senyawa uji. Apabila ikatan gula terlepas,
steroid bebas akan terikat dengan adanya cincin berwarna merah-ungu.
Sedangkan fungsi asam asetat anhidrat untuk membentuk turunan asetil dari
steroid yang akan membentuk turunan asetil didalam kloroform. Pada
ekstrak yang diujikan menunjukkan positif mengandung saponin
triterpenoid yang ditandai dengan terbentuknya warna merah-ungu pada
larutan.
Sedangkan untuk larutan C untuk uji salkowski, Penambahan H2SO4
pekat melalui dindingnya bertujuan untuk memisahkan ikatan gula (gugus
glikosida steroid terdiri dari gugus gula dan steroid) dari senyawa dengan
memutus ikatan eter dari senyawa. Kemudian steroid bebas ini akan
bereaksi dengan asam sulfat pekat membentuk warna merah (cincin merah)
yang pada praktikum kali ini menunjukkan hasil yang positif.
Uji selanjutnya yaitu uji KLT Sapogenin triterpenoid/steroid.
Glikosida triterpenoid alkohol dan glikosida steroid tertentu larut dalam air
dan etanol. Aglikonnya disebut sapogenin yang diperoleh dari hidrolisis
dalam suasana asam atau menggunakan enzim dan tanpa bagian gula.
Oleh karena itu pada uji sapogenin, ekstrak Sapindus rarak DC
terlebih dahulu dihidrolisis dalam suasana asam dengan penambahan +HCl
2 N dan dipanaskan 50 menit yang bertujuan untuk mempercepat reaksi)
50
Diasogenin
Gugus gula
Aglikon
Kemudian dibasakan menggunakan ammonia karena sapogenin

bersifat asam dan dinetralkan dengan basa. Selanjutnya karena sapogenin
cenderung larut dalam n-heksana maka ekstraksi dapat dilakukan
menggunakan n-heksana. Yang kemudian filtrat yang telah diperoleh
diuapkan untuk mendaptkan senyawa yang pekat KLT yang dilakukan
adalah normal fase: fase diam bersifat polar dan fase gerak bersifat
nonpolar.
Penampakan noda setelah lempeng disemprot dengan penampak noda
anisaldehid asam sulfat. Sinar UV yang digunakan adalah sinar UV dengan
panjang gelombang 254 nm karena berdasarkan literatur, bahwa banyak
senyawa organik yang dapat berflouresensi jika disinari UV 254 nm. Pada
lampu UV 254 nm noda yang tampak berwarna gelap (ungu) karena yang
berflouresensi adalah lempengnya yang mengandung indikator sedangkan
sampelnya tidak. Pada lampu UV 365 nm warna noda yang tampak adalah
terang atau tampak jelas karena lempengnya tidak berflouresensi tetapi
sampelnya.Noda yang muncul berwarna ungu dengan nilai Rf 0,4
menunjukkan bahwa ekstrak positif mengandung sapogenin.
Pengujian yang terakhir dilakukan yaitu Uji KLT terpenoid/steroid
bebas. Uji ini dilakukan langsung dengan mengekstraksi steroid/triterpenoid
dengan n-hexane untuk menarik senyawa tersebut dari ekstrak.
menggunakan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak yaitu n-heksana :
etil asetat (4:1). Pemilihan fase gerak dengan komposisi tersebut
berdasarkan kemampuan untuk meminimalkan pengotor dan menghasilkan
noda yang terpisah dengan baik. Kemudian langsung dilakukan proses yang
sama dengan Uji KLT sapogenin. Namun pada praktikum kali ini untuk uji
tersebut menunjukkan hasil yang negatif yang ditunjuukan dengan tidak
51
adanya noda yang berwarna keunguan sehingga tidak dapat diketahui pula
untuk nilai rf nya
Pada praktikum kali ini untuk uji KLT ( identifikasi sapogenin steroid/
triterpenoid dan Identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT )
menunjukkan hasil yang kurang bagus yang ditunjukkan pada identifikasi
sapogenin hanya diperoleh satu penampak noda yang berwarna ungu dan itu
tidak terlihat cukup jelas dimana hal ini menunjukkan adanya senyawa
sapogenin yang hanya sedikit sedangkan pada identifikasi terpenoid / steroid
bebas menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini terjadi kemungkinan
disebabkan oleh pemisahan senyawa yang dilakukan belum sempurna
sehingga senyawa yang diperoleh bukan hanya terdapat senyawa yang
diinginkan namun masih tercampur dengan senyawa lain sehingga filtrat
yang ditotolkan belum mengandung senyawa yang benar – benar murni
maka ketika pembacaan noda tidak dapat terbaca dengan jelas. Selain itu
ketika proses eluasi chamber dibuka sehingga fase gerak yang mulai naik
kemungkinan dapat trun dan konsentrasi dari fase gerak didalam chamber
dapat berubah karena seperti yang diketahui bahwa bahan – bahan yang
digunakan sangat mudah menguap.
52
1.8 KESIMPULAN
 Berdasarkan hasil pengamatan terhadap uji identifikasi senyawa
saponin triterpenoid dan steroid pada ekstrak Sapindus rarak DC
disimpulkan dari uji buih didapatkan hasil bahwa ekstrak menghasilkan
buih yang stabil selama > 30 menit dengan tinggi 8,3 cm dari
permukaan larutan.
 Adapun berdasarkan uji Liebermann-Burchard, ekstrak Sapindus rarak
DC menunjukan positif mengandung saponin triterpenoid karena
menunjukan warna merah-ungu setelah penambahan pereaksi.
 Berdasarkan uji Salkowski, ekstrak positif mengandung steroid bebas,
hal ini diidentifikasi dari cincin merah-ungu yang terbentuk.
 Untuk KLT pada uji sapogenin, ekstrak positif mengandung sapogenin
steroid/triterpenoid, hal ini disimpulkan dari noda berwarna ungu yang
terbentuk setelah penambahan penampak noda (Rf = 0,95). Sedangkan
Pada uji triterpenoid dan steroid bebas, ekstrak disimpulkan negatif
mengandung triterpenoid/steroid bebas, hal ini terjadi kemungkinan dari
proses pengamatn yang kurang berhati – hati dan teliti.
53
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2009. Lerak (Sapindus rarak) Tanaman Industri Pengganti Sabun.
Jurnal Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri. Volume 15
Nomor 22 Agustus 2009. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan.
Harbone, JB, 1987, Phytochemical Methods, Terbitan kedua diterjemahkan oleh
Padmawinata. K dan Soediro L, 14-15, 21-24 147-156, ITB, Bandung
Mils, S, 2000, Principles and Practise of Phytoteraphy, 43-47, Churchill
Livingstone, China
Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. 28. 35-36. Penerbit Liberty. Yogyakarta
Syahroni, Yan Yanuar dan Djoko Prijono. 2013. Aktivitas Insektisida Ekstrak
Buah Piper aduncum L. (Piperaceae) dan Sapindus rarak DC.
(Sapindaceae) serta Campurannya Terhadap Larva Crocidolomia
pavonana (F.) (Lepidoptera : Crambidae). Jurnal Entomologi Indonesia
Volume 10 Nomor 1 : 39 – 50 April 2013. Departemen Proteksi Tanaman.
Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor.
Widowati L. 2003. Sapindus rarak DC. In : Lemmens RHMJ. Bunyapraphastsara
N (Eds). Plant Resources of South-East Asia Vol 12 (3). Medicinal and
Poisonous Plants. pp. 358-359. Bogor : Prosea Foundation.
Wina E, Muetzel S, Hoffmann E, Makkar HPS, Becker K. 2005. Effect of
secondary compounds in forages on rumen micro-organisms quantified by
16S and 18S rRNA. Anim Feed Sci Technol. 121:159-174.
54
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FLAFONOID
(Ekstrak Psidium guajava)
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
55
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan flavonoida
dalam tanaman.
1.2 DASAR TEORI

1.2.1 Tanaman Jambu Biji (Psidium guajava L.)
Jambu biji berasal dari Amerika tropis, tumbuh pada tanah yang
gembur maupun liat, pada tempat terbuka dan mengandung air cukup
banyak. Tanaman jambu biji putih dapat berbunga sepanjang tahun.
Tanaman ini sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 1-
1.200 mdpl (Hapsoh dan Hasanah, 2011).
Klasifikasi tanaman jambu biji adalah sebagai berikut :
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Myrtales
Suku : Myrtaceae
Marga : Psidium
Jenis : Psidium guajava L.
Daun jambu biji tergolong daun tidak Gambar 1 : tanaman Psidium guajava
lengkap karena hanya terdiri dari tangkai
(Petiolus) dan helaian (Lamina) saja yang disebut daun bertangkai. Dilihat
dari letak bagian terlebarnya pada daunnya bagian terlebar daun jambu biji
(P. Guajava L.) berada ditengah-tengah dan memiliki bagian jorong
karena perbandingan panjang : lebarnya adalah 1,5 - 2 : 1 (13 - 15 : 5,6 - 6
Cm). Daun jambu biji (P. Guajava L.) memiliki tulang daun yang
menyirip yang mana daun ini memiliki 1 ibu tulang yang berjalan dari
pangkal ke ujung dan merupakan terusan tangkai daun dari ibu tulang ke
samping,keluar tulang-tulang cabang, sehingga susunannya mengingatkan
kita pada susunan sirip ikan. Jambu biji memiliki ujung daun yang tumpul,
pada umumnya warna daun bagian atas tampak lebih hijau jika
dibandingkan sisi bawah daun. Tangkai daun berbentuk selindris dan tidak
menebal pada bagian tangkainya.
56
Tanaman jambu biji putih atau Psidium guajava L. termasuk familia
Myrtaceae. Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya
dapat dimakan sebagai buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk
makanan dan minuman. Selain itu, buah jambu biji bermanfaat untuk
pengobatan (terapi) bermacam-macam penyakit, seperti memperlancar
pencernaan, menurunkan kolesterol, antioksidan, menghilangkan rasa lelah
dan lesu, demam berdarah, dan sariawan. Selain buahnya, bagian tanaman
jambu biji seperti daun, kulit akar maupun akarnya dapat berkhasiat untuk
menyembuhkan penyakit disentri, keputihan, sariawan, kurap, diare,
radang lambung, gusi bengkak, dan peradangan mulut, serta kulit terbakar
sinar matahari (Cahyono, 2010).
Daun jambu biji mempunyai manfaat bagi kesehatan yaitu sebagai
antiinflamasi, antidiare, analgesik, antibakteri, antidiabetes, antihipertensi,
mengurangi demam dan penambah trombosit. Daun jambu biji putih telah
terbukti secara klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang
menyebabkan enteritis pada anak-anak dan menyembuhkan kejang dan
penyakit diare akut
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman

Daun jambu biji memiliki kandungan flavonoid yang sangat tinggi,
terutama quercetin. Senyawa tersebut bermanfaat sebagai antibakteri,
kandungan pada daun Jambu biji lainnya seperti saponin, minyak atsiri,
tanin, anti mutagenic, flavonoid, dan alkaloid (Anonim, 2013).
Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang
umumnya tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis
flavonoid yang ditemukan dalam buah-buahan, sayuran, daun dan
bijibijian. Hal ini juga dapat digunakan sebagai bahan dalam suplemen,
minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida yang banyak
ditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih.
Sehingga ketika direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk
buih yang dapat bertahan lama. Minyak atsiri adalah kelompok besar
minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu ruang namun mudah
menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri
57
merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau minyak gosok (untuk
pengobatan) alami. Tanin merupakan substansi yang tersebar luas dalam
tanaman dan digunakan sebagai energi dalam proses metabolisme dalam
bentuk oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada buah. Alkaloid
adalah sebuah golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan
heterosiklik dan terdapat didunia tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan
senyawa yang berasal dari hewan).
1.2.3 Manfaat Tanaman Jambu Biji

Daun jambu biji ternyata memiliki khasiat tersendiri bagi tubuh kita,
baik untuk kesehatan ataupun untuk obat penyakit tertentu. Dalam
penelitian yang telah dilakukan ternyata daun jambu biji memiliki
kandungan yang banyak bermanfaat bagi tubuh kita. Diantaranya, anti
inflamasi, anti mutagenik, anti mikroba dan analgesik (Setiawan, 2000).
Pada umumnya daun jambu biji (P. Guajava L.) digunakan untuk
pengobatan seperti diare akut dan kronis, perut kembung pada bayi dan
anak, kadar kolesterol darah meninggi, sering buang air kecil, luka,
sariawan, larutan kumur atau sakit gigi dan demam berdarah (Retno,
2013).
Berdasarkan hasil penelitian, telah berhasil diisolasikan suatu zat
flavonoid dari daun jambu biji yang dapat memperlambat pengganda
(replika) Human Immunodeficiency Virus (HIV) penyebab penyakit AIDS.
Zat ini bekerja dengan cara menghambat pengeluaran enzim reserved
transriptase yang dapat mengubah RNA virus menjadi DNA di dalam
tubuh manusia.
1.2.4 Golongan Senyawa Tanaman Jambu Biji

a. Flavonoid
Gambar 2 : Sistem Penomoran Senyawa Flavonoid

58
Flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam yang tersebar
luas pada tumbuhan hijau dan mengandung 15 atom karbon dalam inti
dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6 yaitu dua cincin
aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak
dapat membentuk cincin ketiga (Markham, 1988).
Senyawa flavonoid dalam tumbuhan dapat terikat dengan gula atau
tanpa gula. Flavonoid yang terikat dengan gula disebut glikosida,
sedangkan flavonoid yang tidak terikat dengan gula disebut aglikon.
Flavonoid dapat berkhasiat sebagai antioksidan, antibakteri dan
antiinflamasi (Harborne, 1987).
b. Alkaloid
Alkaloid merupakan golongan zat tumbuhan sekunder yang terbesar.
Pada umumnya alkaloid mencangkup senyawa yang bersifat basa yang
mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan,
sebagai bagian dari sistem siklik. Alkaloid sering sekali beracun bagi
manusia dan banyak mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol, jadi
digunakan secara luas dalam bidang pengobatan.
Alkaloid yang paling umum adalah asam amino. Secara kimia alkaloid
merupakan suatu golongan heterogen. Fungsi alkaloid dalam tumbuhan
masih sangat kabur, meskipun masin-masing senyawa telah dinyatakan
terlibat sebagai pengatur tumbuh, atau penghalau atau penarik serangga
(Harborne, 1987).
c. Saponin
Senyawa golongan ini banyak terdapat pada tumbuhan tinggi. Saponin
adalah suatu glikosida yang bila dihidrolisa menghasilkan bagian aglikon
yang disebut sapogenin dan bagian glikon. Saponin merupakan senyawa
dengan rasa yang pahit dan mampu membentuk larutan koloidal dalam air
serta menghasilkan busa jika dikocok dalam air. Senyawa ini dapat
mengiritasi membran mukosa dan pada konsentrasi rendah dapat
menyebabkan hemolisa darah merah. Saponin dapat menurunkan tegangan
permukaan dari larutan berair sehingga dalam bidang farmasi digunakan
sebagai penstabil sediaan suspensi.
59
d. Steroid
Steroid adalah triterpenoid yang kerangka dasarnya sistem cincin
siklopentana perhidrofenantren. Uji yang biasa digunakan adalah reaksi
Lieberman Bourchard yang dengan kebanyakan triterpen dan steroid
memberikan warna hijau biru (Harborne, 1987).
e. Triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari
enam satuan isoprene dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon
C30 asiklik, yaitu skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yang rumit,
kebanyakan berupa alkohol, aldehid atau asam karboksilat (Harborne,
1987).
1.2.5 Klasifikasi Senyawa Flavonoid

Pada flavonoid C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoi
dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan
suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom
C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan C nomor 8 dalam inti
flavonoid misalnya pada orientin (Markham, 1988)
Flavonoid dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada
rantai C3 yaitu :
a. Flavonol
Gambar 2 : Sistem Penomoran Senyawa Flavonoid

Folavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-
glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan
mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Flavonol
60
lain yang terdpat dialam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur
sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi
oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada
pengerjaannya masih dapat dilakukan.
b. Flavon
Gambar 3 : Senyawa Flavon

Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat
gugus 3-hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan
kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon terdapat juga sebagai
glikosidanya lebih sedikit dari pada jenis glikosida pada flavonol. Flavon
dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.
c. Isoflavon
Gambar 4 : Senyawa Isoflavon

Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit
dan sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam
tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit.
d. Flavonon
Gambar 5 : Senyawa Flavonon 61

Terdistribusi luas di alam. Flavonon terdapat didalam kayu daun dan
bunga. Flavonon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman
genus prenus dan buah jeruk ; dua glikosida yang paling lazim adalah
nerigenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
Gambar 6 : Senyawa Flavononol

e. Flavononol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit
sekali jika dibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagaian besar senyawa
ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
f. Katekin
Gambar 7 : Senyawa Katekin

Terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan
berkayu. Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak
kental Uncaria gambirdan daun teh kering yang mengandung kira-kira
30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan.
g. Leukoantosianidin
62
Merupakan senyawa tan warna, terutama terdapat pada tumbuhan
berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya
melaksidin, dan apiferol.
h. Antosianin
Gambar 8 : Senyawa Antosianin

Merupakan pewarna yang paling pentingdan paling tersebar luas dalam
tumbuhan. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan dari suatu
struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari
pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil
atau dengan metilasi atau glikosilasi.
i. Khalkon
Gambar 9 : Senyawa Khalkon

Adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar
UV bila di kromatografi kertas. Aglikon flavon dapat dibedakan dari
glikosidanya, karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat
bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air.
j. Auron
Berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan
briofita. Dalam larutan basa senyaw ini berwarna merah ros dan tampak
pada kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet
warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi uap amonia.
63
1.2.6 Cara Identifikasi Senyawa Flavonoid
Senyawa golongan flavonoid dilakukan pada ekstrak hasil maserasi,
ekstrak hasil partisi, dan fraksi hasil kromatografi kolom. Pengujian
dilakukan dengan beberapa pereaksi berikut (Geissman, 1962) :
 Uji Wilstatter : Sejumlah tertentu sampel ditambah serbuk Mg dan
HCl pekat.
 Uji Bate Smith-Matcalfe: Sejumlah tertentu sampel ditambahkan
H2SO4 pekat dan dipanaskan selama 15 menit diatas penangas air.
 Uji dengan NaOH 10%: Sejumlah tertentu sampel ditambahkan
beberapa tetes NaOH 10%.
Warna merah sampai jingga diberikan oleh senyawa flavon, warna

merah tua diberikan oleh flavonol atau flavonon, warna hijau sampai biru
diberikan oleh aglikon atau glikosida.
1.2.7 Tinjauan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis
cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai
selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif,
atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system
penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau
kromatografi cair kinerja tinggi.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar
dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk
mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh
dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan
isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang
disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan
tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi
– pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari
64
KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf
untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa
standar.
Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh
senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari
titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.
Pemisahan pada KLT hanya membutuhkan waktu setengah jam saja
sedangkan pemisahan yang umum pada kertas membutuhkan waktu
beberapa jam. Media pemisahannya adalah lapisan dengan ketebalan
sekitar 0,1 – 0,3 mm zat pada adsorben pada lempeng kaca, plastik dan
aluminium. Lempeng yang paling umum digunakan yang berukuran 8x2
inchi. Dan zat padat yang digunakan adalah alumina, KLT kadang-kadang
disebut dengan kromatografo planar. Tidak ada cara yang mudah dalam
mengelusi komponen sampel dari sampel (kertas) untuk melintasi sebuah
detektor tetapi telah dikembangkan peralatan untuk mengamati lempengan
dengan sifat-sifat sampel seperti itu adsorbsi sinar UV dan pengedaran.
65
1.3 PROSEDUR KERJA
1.3.1 Preparasi sampel
1) 0,3 gram ekstrak dikocok dengan 3 ml n-heksana berkali-kali dalam
tabung reaksi sampai ekstrak n-heksan tidak berwarna.
2) Residu dilarutkan dalam 20 ml etanol dan dibagi menjadi 4 bagian,
masing-masing disebut sebagai larutan IIIA, IIIB, IIIC, dan IIID.
1.3.2 Reaksi warna

1) Uji bate-smith dan metcalf
a. Larutan IIIA sebagai blanko larutan IIIB ditambah 0,5 ml HCl
pekat dan diamati perubahan warna yang terjadi, kemudian
dipanaskan diatas penangas air dan diamati lagi perubahan warna
yang terjadi.
b. Bila perlahan-lahan menjadi warna merah terang atau ungu
menunjukan adanya senyawa leukoantosianin (dibandingkan
dengan blanko)
2) Uji wilstater
a. Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIC ditambah 0,5 ml HCl
pekat dan 4 potong magnesium.
b. Diamati perubahan warna yang terjadi, diencerkan dengan 2 ml air
suling, kemudian ditambah 1 ml butanol.
c. Diamati warna yang terjadi disetiap lapisan. Perubahan warna
jingga menunjukan adanya flavon, merah pucat menunjukan
adanya flavonol, merah tua menunjukan adanya flavonon.

1) Larutan IIID ditotolkan pada fase diam.
2) Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :
Fase diam : Lapisan tipis selulosa (diganti Kiesel Gel 254)
Fase gerak : Kloroform ; aseton ; asam fomiat (6 : 6 : 1)
Penampak noda : Pereaksi sitrat borak atau
Uap amonia atau
Asam sulfat 10%
66
3) Adanya flavonoid ditunjukan dengan timbulnya noda berwarna kuning
intensif.
4) Noda kuning yang ditimbulkan oleh uap ammonia akan hilang secara
perlahan ketika amonianya menguap meninggalkan noda.
5) Sedangkan noda kuning yang ditimbulkan oleh pereaksi sitrat-borat
sifatnya permanen.
67
1.4 SKEMA KERJA
Dikocok sampai ekstrak

n-heksan tidak berwarna
Masukkan 0,3 gram Tambahkan 3 ml

ekstrak kedalam n-heksana
tabung reaksi
IIIA IIIB IIIC IIID
Residu dilarutkan dalam 20

ml etanol, lalu dibagi
menjadi 4 bagian
1.4.2 Reaksi Warna

1) Uji Bate-Smith dan Metcalf
Bila perlhan-lahan
Larutan IIIA = blanko menjadi warna merah
terang atau ungu
menunjukan adanya
senyawa leukoantosianin
Larutan IIIB = ditambah Amati perubahan warna

0,5 ml HCl pekat yang terjadi.
2) Uji Wilstater Perubahan warna jingga

adanya flavon, Merah
Larutan IIIA = blanko pucat adanya flavonol.
Merah tua adanya
flavanon
Amati perubahan warna
Larutan IIIC = ditambah 0,5 ml HCl yang terjadi. Diencerkan
pekat & 4 potongan magnesium dengan 2 ml aquadest lalu
ditambah 1 ml butanol
68
Siap untuk uji KLT :

Adanya flavonoid
ditunjukan dengan
timbulnya noda berwarna
Larutan IIID kuning intensif
ditotolkan pada
fase diam

Fase gerak : kloroform : aseton:asam (6:6:1)
Penampak noda : - pereaksi sitrat borat atau
- Uap amonia atau
- Asam sulfat 10%
69
1.5 BAGAN ALIR
Masukkan 0,3 gram ekstrak kedalam tabung reaksi
Tambahkan 3 ml n-heksana. Lalu dikocok sampai ekstrak n-heksan tidak berwarna
Residu dilarutkan dalam 20 ml etanol, lalu dibagi menjadi 4

bagian : IIIA, IIIB, IIIC, dan IIID
1.5.2 Reaksi Warna

1) Uji Bate-Smith dan Metcalf
Larutan IIIA = blanko
Larutan IIIB = ditambah 0,5 ml HCl pekat. Lalu amati perubahan

warna yang terjadi.
Bila perlahan-lahan menjadi merah atau ungu

menunjukan adanya senyawa leukoantosianin
2) Uji Wilstater
Larutan IIIA = blanko
Larutan IIIC = ditambah 0,5 ml HCl pekat & 4 potongan magnesium
Amati perubahan warna yang terjadi. Diencerkan

dengan 2 ml aquadest lalu ditambah 1 ml butanol
Perubahan warna jingga adanya flavon,. Merah pucat

adanya flavonol. Merah tua adanya flavanon
70
Larutan IIID ditotolkan pada fase diam
Siap untuk uji KLT

Fase gerak : kloroform : aseton:asam (6:6:1)
Penampak noda : - pereaksi sitrat borat atau
- Uap amonia atau
- Asam sulfat 10%
Adanya flavonoid ditunjukan dengan timbulnya noda berwarna

kuning intensif
Noda kuning yang ditimbulkan oleh uap ammonia akan menghilang perlahan
sedangkan yang ditimbulkan oleh pereaksi sitrat-borat sifatnya permanen
71
1.6 HASIL
1.6.1 Reaksi Warna
a. Uji Bate-smith dan Metcalf
Larutan IIIB setelah ditambahkan 0,5 ml HCl pekat

sebelum pemanasan. Memberikan hasil bahwa larutan
lebih keruh dari sebelumnya
Larutan IIB setelah ditambahkan 0,5 ml HCl pekat

setelah pemanasan. Memberikan hasil bahwa larutan
menjadi berwarna kemerahan menujukkan adanya
senyawa leukoantosianin
b. Uji Wilstater
Larutan IIIC setelah ditambhakan dengan 0,5ml hcl

pelat + serbuk magensium + 2ml aquadest + 1 ml
butanol. Menunjukkan adanya lapisan berwarna
jingga yang memnunjukkan adanya senyawa flavon
didalamnya 72
1.6.2 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
A B
B A
Larutan A dan larutan B Larutan A dan larutan B

setelah ditotolkan dan setelah diberikan noda uap
diamati dibawah sinar UV amoniak yang diamati
254nm secara visual
A B
A B
Larutan A dan larutan B Larutan A dan larutan B

setelah diberi penampak setelah diberik penampak
noda uap amoniak yang noda uap amoniak yang
diamati dengan sinar UV diamati dengan sinar UV
254nm 365nm
Keterangan :
A : Larutan IID
B : Larutan dari hasil ektraksi tampungan I dan II yang sebelumnya telah diaupkan
2. Larutan IIID 1. Larutan hasil ekstraksi tampungan I & II
a. Rf = 5,2/8 = 0,65 cm a. Rf = 6,7/8 = 0,84 cm
b. Rf = 7,3/8 = 0,91 cm b. Rf = 5,2/8 = 0,65 cm
73
1.7 PEMBAHASAN
Praktikum kali ini bertujuan untuk mengidentifikasi adanya senyawa
golongan flavonoida pada ekstrak Psidium guajava atau disebut jambu biji
dalam nama lokalnya. Pada pengujian ini, untuk mengidentifikasi senyawa-
senyawa yang ada dalam ekstrak jambu biji kita menggunakan uji warna
Bate-smith dan Metcalf, uji warna wilstater dan yang terakhir dilakukan uji
kromatografi lapis tipis.
Pada praktikum ekstrak dikocok berkali-kali menggunakan n-heksan hal
ini bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat nonpolar
seperti klorofil, triterpen, lemak dan senyawa nonpolar lainnya. Pengocokkan
dilakukan sampai membentuk larutan jernih. Untuk hasil pengocokkan
pertama dan kedua ditampung yang kemudian diuapkan sampai membentuk
ekstrak kental n-heksan untuk diujikan menggunakan klt. Residu dari hasil
pengocokkan yang sudah jernih ditambahkan etanol yang bertujuan untuk
melarutkan semua komponen-komponen kimia yang polar maupun non polar.
Hal ini disebabkan karena etanol merupakan pelarut yang bersifat universal,
sehingga senyawa-senyawa kimia mulai dari yang kurang polar sampai
dengan polar dapat larut. Hasil campuran residu dan etanol dibagi menjadi 4
bagian (IIIA, IIIB, IIIC, dan IIID) untuk uji fitokimia dengan metode reaksi
warna dan kromatografi lapis tipis.
Pada reaksi warna dilakukan dengan 2 cara identifikasi yaitu dengan
menggunakan reagen atau pereaksi Smith-Metcalf dan Willstater karena
dapat menghasilkan terjadinya perubahan warna yang menunujukan bahwa
ekstrak tersebut positif mengandung senyawa yang termasuk dalam golongan
flavonoid.
Pada uji Bate-Smith larutan IIIB ditambah dengan 0,5 ml HCl pekat untuk
menghidrolisis dan memutus ikatan glikosida. Hidrolisis ini untuk
menghidrolisis antosianin menjadi aglikon antosianin, yaitu antosianidin,
tetapi tidak ada perubahan warna yang terjadi, kemudian lautan dipanaskan
diatas penangas air untuk mempercepat terjadinya hidrolisis. Hasil uji warna
ini pada kelompok kami menunjukkan hasil yang positif, ditandai dengan
ditunjukkan adanya perubahan warna merah terang pada larutan, hal ini
74
menunjukkan adanya leukoantosianin. (dibandingkan dengan tabung IIA
blanko).
Uji warna yang kedua yaitu uji Wilstater. Lautan IIIC ditambah dengan 0,5
ml ( 10 tetes) HCl pekat dan serbuk Magnesium. secukupnya Penambahan ini
untuk reaksi reduksi menjadikan suatu flavonol, flavanon, flavonon dan
xanton. Magnesium dan asam klorida pada uji Wilstater bereaksi membentuk
gelembung – gelembung yang merupakan gas H2, sedangkan logam Mg dan
HCl pekat pada uji ini berfungsi untuk mereduksi inti benzopiron yang
terdapat pada struktur flavonoid sehingga terbentuk perubahan warna menjadi
merah. Dan pada praktikum kali ini terbentuk lapisan yang membentuk warna
jingga yang menunjukkan adanya kandungan senyawa flavon.
Hal ini tidak sesuai dengan teori dimana didalam teori pada uji wilstater
akan terbentuk 3 lapisan yang berwarna jingga yang menunjukkan adanya
senyawa flavon, jika berwarna merah pucat menunjukkan adanya senyawa
flavonol dan jika terbentuk warna merah tua menunjukkan adanya senyawa
flavonon. Hal ini terjadi kemungkinan akibat senyawa yang falvonol dan
flavonon yang terkandung dalam sampel yang diujikan sangan rendah atau
sangat sedikit. Selain itu kemungkinan akibat dari penambahan magnesium
dimana magnesium yang berfungsi untuk mereduksi senyawa yang
terkandung dalam larutan sampel namun belum mampu mereduksi secara
sempurna sehingga senyawanya tidak terbaca semuanya.
Selanjutnya uji yang terakhir adalah uji KLT, dengan fase diam kiesel gel
GF 254, fase gerak kloroform : aseton : asam formiat (6:6:1) dengan
penampak noda uap amoniak. Larutan IIID ditotolkan pada lempeng
sebanyak 1,5 kapiler dan ditotolkan residu yang telah diuapkan sebanyak 1
kapiler sebagai perbandingan dengan pelarut n-heksan dan etanol. Lalu dicek
di UV 254 nm setelah itu lempeng dieluasi dalam chamber, ditunggu hingga
garis batas atas pada lempeng. Sebelum disemprot, lempeng diamati dibawah
sinar UV (254nm) dan (365nm) untuk melihat noda Kemudian disemprot
dengan warna noda uap amoniak dan kemudian dipanaskan sampai terbentuk
warna kuning. Noda kuning yang ditimbulkan oleh uap amoniak akan hilang
secara perlahan ketika amonianya menguap meninggalkan noda. Adanya
75
flavonoid ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna kuning intensif, hasil
KLT menunjukkan hasil yang positif.
Dari hasil uji KLT ini diperoleh nilai Rf yaitu pada larutan IIID 0,65 dan
0,91. Sedangan ilai Rf yang diperoleh dari larutan hasil ekstraksi tampungan I
dan II yang sebelumnya telah diuapkan sebesar 0,65 dan 0,84. Menurut
pustaka eksrak jambu biji mengandung flavonoid terutama turunan dari
kuersetin yang termasuk dalam golongan flavon, dalam flavonoid kuersetin
teridentifikasi baik ketika berwarna kuning pada TLC ( El Sohafu, 2009).
Kuersetin standar memiliki nilai Rf 0,8 ( Fajar, 2011). Sehingga noda kuning
yang dihasilkan pada praktikum kemungkinan termasuk flavonoid golongan
kuersetin.
76
1.8 KESIMPULAN
 Uji Bate – Smith Metcalf : Positif mengandung Leukoantosianin yang
ditunjukkan dengan adanya warna kemerahan pada larutan.
 Uji Wilstater : Positif mengandung senyawa golongan flavon yang
ditunjukkan dengan adanya warna lapisan jingga pada larutan.
 Uji KLT : Positif mengandung senyawa golongan flavonoid yang
ditunjukkan dengan adanya noda warna kuning intensif pada plat KLT.
77
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, Manfaat dan Khasiat Dari Alam.
(http://organ1k.blogspot.com/2012/11/kandungan-daun-jambu biji.html).
(akses pada tanggal 3 mei 2013)
Cahyono, S. B. 2010. Hepatitis B. Yogyakarta: KANISIUS.
Hapsoh, Hasanah, 2011. Budidaya Tanaman Obat dan Rempah. Medan: USU
Press.
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung.
Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. diterjemahkan oleh

Kosasih Padmawinata, 15. Penerbit ITB. Bandung.
Retno AriaNingrum. 2013. Pemanfaatan Tumbuhan Jambu biji Sebagai Obat

Tradisional. Universitas Negeri Yogyakarta : Jogjakarta.
Setiawan Dalimartha. 2000. Atlas Tumbuhan Obat di Indonesia. Jakarta : Trubus

Agriwidya.
78
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN POLIFENOL DAN TANIN
(Ekstrak Psidium guajava)
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
79
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu identifikasi senyawa golongan polifenol dan tanin
dalam tanaman.
1.2 DASAR TEORI

1.2.1 Tanaman Jambu Biji (Psidium guajava)
Jambu biji berasal dari Amerika tropis, tumbuh pada tanah yang
gembur maupun liat, pada tempat terbuka dan mengandung air cukup
banyak. Tanaman jambu biji putih dapat berbunga sepanjang tahun.
Tanaman ini sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 1-
1.200 mdpl (Hapsoh dan Hasanah, 2011).
Klasifikasi tanaman jambu biji adalah sebagai berikut :
Bangsa : Myrtales
Suku : Myrtaceae
Marga : Psidium
Jenis : Psidium guajava L.
Gambar 1 : Psidium guajava
Daun jambu biji tergolong daun tidak lengkap karena hanya terdiri dari
tangkai (Petiolus) dan helaian (Lamina) saja yang disebut daun bertangkai.
Dilihat dari letak bagian terlebarnya pada daunnya bagian terlebar daun
jambu biji (P. Guajava L.) berada ditengah-tengah dan memiliki bagian
jorong karena perbandingan panjang : lebarnya adalah 1,5 - 2 : 1 (13 - 15 :
5,6 - 6 Cm). Daun jambu biji (P. Guajava L.) memiliki tulang daun yang
menyirip yang mana daun ini memiliki 1 ibu tulang yang berjalan dari
pangkal ke ujung dan merupakan terusan tangkai daun dari ibu tulang ke
samping,keluar tulang-tulang cabang, sehingga susunannya mengingatkan
kita pada susunan sirip ikan. Jambu biji memiliki ujung daun yang tumpul,
pada umumnya warna daun bagian atas tampak lebih hijau jika
dibandingkan sisi bawah daun. Tangkai daun berbentuk selindris dan tidak
menebal pada bagian tangkainya.
80
Tanaman jambu biji putih atau Psidium guajava L. termasuk familia
Myrtaceae. Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya
dapat dimakan sebagai buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk
sinar matahari (Cahyono, 2010)
mengurangi demam dan penambah trombosit. Daun jambu biji putih telah
penyakit diare akut
1.2.2 Manfaat Tanaman Jambu Biji

Tanaman jambu biji (Psidium guajava L) termasuk familia Myrtaceae.
Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya dapat
dimakan sebagai buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk
sinar matahari (Cahyono, 2010). Ekstrak etanol daun jambu biji juga telah
diteliti sebagai antioksidan.
81
mengurangi demam dan penambah trombosit. Daun jambu biji telah
penyakit diare akut.
1.2.3 Kandungan Senyawa Tanaman Jambu Biji

Kandungan kimia pada daun jambu biji (Psidium guajava L.) yaitu
terpen, fenolik, dan senyawa mengandung nitrogen terutama alkaloid.
Kandungan kimia tersebut merupakan bagian dari sistem pertahanan diri
yang berperan sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen
dan mencegah pemakanan oleh herbivora. Hasil fitokimia dalam ekstrak
daun jambu biji putih adalah senyawa flavonoid, tanin, triterpenoid,
saponin, steroid, dan alkaloid .
1.2.4 Golongan Senyawa Tanaman Jambu Biji

a. Polifenol
Tumbuhan yang hidup disekitar kita memiliki kandngan kimia berupa
bahan alam yang merupakan hasil dari metabolisme sekunder. Bahan
kimia yang dimaksud biasanya di gunakan manusia untuk memenuhi
kebutuhannya dalam bidang farmasi. Salah satu kelompok senyawa yang
Gambar 2 : Struktur Polifenol
banyak memberikan manfaat bagi manusia adalah polifenol.

Senyawa yng termasuk kedalam polifenol ini adalah semua senyawa
yang memiliki struktur dasar berupa fenol. Polifenol adalah kelompok zat
kimia yang ditemukan pada tumbuhan. Zat ini memiliki tanda khas yakni
memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Fenol sendiri merupkan
82
struktur yang terbentuk dari benzena tersubtitusi dengan gugus –OH.
Gugus –OH yang terkandung merupakan aktivator yang kuat dalam reaksi
subtitusi aromatik elektrofilik (Fessenden,1982).
Fenol Polifenol dapat diklasifikasikan menjadi beberpa jenis
berdasarkan unit basanya antara lain asam galia, asam sinamat, dan flavon.
Selain itu senyawa-senyawa polifenol jika berdasarkan komponen
penyusun fenolnya dapat dibagi menjadi fenol, pyrocatechol, pirogallol,
resorsinol, floroglucinol, dan hidroquinon. Polifenol banyak dimanfaatkan
oleh manusia dan sebagian telah diproduksi dengan cara disintesis secara
industri sebagai obat.
b. Tanin
Tanin merupakan salah satu contoh senyawa polifenol. Tanin terdapat
luas dalam tumbuhan berpembuluh dan terdapat khusus dalam jaringan
kayu pada angiospermae. Secara kimia terdapat dua jenis tannin, yaitu
Gambar 3 : Struktur Proanthocyanidin (golongan tanin)
tanin-terkondensasi atau flavolan dan tanin terhidrolisiskan.

Tanin-terkondensasi terdapat dalam paku-pakuan, gymnospermae, dan
angiospermae. Sedangkan tannin terhidrolisiskan penyebarannya terbatas
pada tumbuhan berkeping dua (Harborne, 1987). Tanin seringkali
dilaporkan sebagai mikromolekul yang mengganggu bioassay dan
seringkali berikatan tidak spesifik pada berbagai protein termasuk beragai
jenis reseptor sehingga menjadi sukar larut air. Namun, beberapa aktivitas
83
cukup penting juga dilaporkan pada tannin, yaitu dapat menghambat,
menghentikan pedarahan dan mengobatai luka bakar.
Tanin mampu membuat lapisan pelindung luka dan ginjal.
Kemampuan mengikat ion besi dengan menghasilkan warna larutan biru
kehitaman atau hijau kehitaman menjadi dasar analisis kualitatif tannin
terhidrolisis atau tannin galat (Saifudin dkk., 2011). Tannin dapat pula
dideteksi dengan sinar UV pendek berupa bercak lembayung yang
bereaksi positif dengan setiap pereaksi fenol baku (Harborne, 1987).
1.2.5 Tinjauan Klasifikasi Senyawa

a. Polifenol
Polifenol jika diklasifikasikan berdasarkan unit basanya dibagi
menjadi 4 kelompok besar yaitu asam galic, asam galat, flavon, dan asam
sinamat.
Gambar 4 : Asam Galic

1) Asam Galic
Senyawa ini memiliki struktur benzen yang tersubtitusi dengan 3

gugus – OH dan satu gugus Karboksilat. Contohnya seperti jenis
hydrolyzabletannins yang merupakan jenis tanin yang dapat larut di
dalam air membentuk asam gallic 3 dan asam protocatechuic dan gula.
Contoh jenis ini adalah gallotanin.
84
2) Asam Galat
Senyawa ini tidak terlalu berperan didalam tumbuhan tetapi cukup

memberikan sumbangan manfaat bagi manusia khususnya dalam
bidang kesehatan. Senyawa jenis ini telah diteliti dapat menghamba
tumor, anti-virus, anti oksidasi, anti diabetes.
Gambar 5 : Asam Galat
Gambar 6 : Flavon
3) Flavon
Jenis polifenol ini yang paling banyak terdapat di alam. Senyawa

ini juga termasuk flavonoid. Contoh senyawa ini adalah epicatechin
dan epigalocatechin, senyawa ini terkandung di dalam teh yang
memiliki fungsi sebagai antioksidan.epicatechin epigalocatechin.
4) Asam Sinamat
Senyawa jenis ini memliki struktur umum asam sinamat. Salah satu
contoh jenis ini adalah lignin. Lignin banyak terdapat pada tumbuhan
sebagai penyusun dinding sel. Senyawa ini berupa polimer yang
memiliki struktur kompleks dan beratmolekul lebih dari 10.000
monomer pada lignin disebut monolignols.
b. Tanin
Senyawa tanin termasuk kedalam senyawa polifenol artinya senyawa
85
yang memiliki bagian berupa fenolik. Senyawa tanin dibagi menjadi dua
yaitu tanin yang terhidrolisis dan tanin yang terkondensasi.
1) Tanin Terhidrolisis
Tanin ini biasanya berikatan dengan karbohidrat dengan
membentuk jembatan oksigen, maka dari itu tanin ini dapat
dihidrolisis dengan menggunakan asam sulfat atau asam klorida. Salah
satu contoh jenis tanin ini adalah gallotanin yang merupakan senyawa
gabungan dari karbohidrat dengan asam galat. Selain membentuk
gallotanin, dua asam galat akan membentuk tanin terhidrolisis yang
bisa disebut Ellagitanins. Berat molekul galitanin 1000-
1500,sedangkan Berat molekul Ellaggitanin 1000-3000. Ellagitanin
sederhana disebut juga ester asam hexahydroxydiphenic (HHDP).
Senyawa ini dapat terpecah menjadi asam galic jika dilarutkan dalam
air. Asam elagat merupakan hasil sekunder yang terbentuk pada
hidrolisis beberapa tanin yang sesungguhnya merupakan ester asam
heksaoksidifenat.
2) Tanin Terkondensasi
Tanin jenis ini biasanya tidak dapat dihidrolisis, tetapi dapat
terkondensasi meghasilkan asam klorida. Tanin jenis ini 7 kebanyakan
terdiri dari polimer flavonoid yang merupakan senyawa fenol. Oleh
karena adanya gugus fenol, maka tannin akan dapat berkondensasi
dengan formaldehida. Tanin terkondensasi sangat reaktif terhadap
formaldehida dan mampu membentuk produk kondensasi Tanin
terkondensasi merupakan senyawa tidak berwarna yang terdapat pada
seluruh dunia tumbuhan tetapi terutama pada tumbuhan berkayu.
Tanin terkondensasi telah banyak ditemukan dalam tumbuhan
pakupakuan. Nama lain dari tanin ini adalah Proanthocyanidin.
Proanthocyanidin merupakan polimer dari flavonoid yang dihubungan
dengan melalui C8 dengan C4. Salah satu contohnya adalah Sorghum
procyanidin, senyawa ini merupakan trimer yang tersusun dari
epiccatechin dan catechin.
86
1.2.6 Cara Identifikasi Senyawa Polifenol dan Tanin
Sebanyak 3 mL sampel diekstraksi akuades panas kemudian
didinginkan. Setelah itu ditambahkan 5 tetes NaCl 10% dan disaring.
Filtrat dibagi 3 bagian A, B, dan C. Filtrat A digunakan sebagai blangko,
ke dalam filtrat B ditambahkan 3 tetes pereaksi FeCl3, dan ke dalam filtrat
C ditambah garam gelatin. Kemudian diamati perubahan yang terjadi.
1.2.7 Tinjauan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi adalah cara pemisahan zat berkhasiat dan zat lain yang
ada dalam sediaan, dengan jalan penyarian berfraksi, atau penyerapan ,
atau penukaran ion pada zat padat berpori, menggunakan cairan atau gas
yang mengalir. Zat yang diperoleh dapat digunakan untuk percobaan
identifikasi atau penetapan kadar (Materia Medika Jilid V-VI : 523).
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya
komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya
suatu reaksi, menentukan efektivitas pemurnian, menentukan kondisi yang
sesuai untuk kromatografi kolom, serta memantau kromatografi kolom,
melakukan screening sampel untuk obat. Analisa kualitatif dengan KLT
dapat dilakukan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT
yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif
dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung pada lempeng
dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometry dan
cara berikutnya adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar
senyawa yang terdapat dalam bercak dengan metode analisis yang lain,
misalnya dengan metode spektrofotometri. Dan untuk analisis preparatif,
sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu
dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non- dekstruktif. Bercak
yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerok dan dilakukan
analisis lanjutan.
Kromatografi Lapisan tipis digunakan pada pemisahan zat secara
cepat, dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang
dilapiskan serba rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat
dianggap sebagai “kolom 10 kromatografi terbuka” dan pemisahan
87
didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung
dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis
pelarut. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap
jika dibandingkan dengan kromatografi kertas. Karena itu pada lempeng
yang disamping kromatogram dari zat yang diperiksa perlu dibuat
kromatogram dari zat pembanding kimia, lenih baik dengan kadar yang
berbeda-beda. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2
bercak dengan harga Rf dan ukuran yang lebih kurang sama. Ukuran dan
intensitas bercak dapat digunakan untuk memperkirakan kadar (Materia
Medika Jilid V-VI : 528).
88
1.3. PROSEDUR KERJA
1) 0,3 gram ekstrak ditambah 10 ml aquadest panas, diaduk dan
dibiarkan sampai temperatur kamar, lalu tambahkan 3-4 tetes 10%
NaCl, diaduk dan disaring.
2) Filtrat dibagi menjadi 3 bagian masing-masing ± 3 ml dan disebut
sebagai larutan IVA, IVB, dan IVC.
1.3.2 Uji Gelatin

1) Larutan IVA digunakan sebagai blanko, kemudian IVB ditambah
dengan 1 tetes larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%
2) Jika terjadi endapan putih menunjukan adanya tanin.
1.3.3 Uji Ferri Klorida

1) Sebagai larutan IVC diberi beberapa tetes larutan FeCl3 terjadi
perubahan warna menjadi hijau biru hingga hitam, menunjukan
adanya senyawa polifenol.
FeCl3 positif, uji gelatin positif  tanin (+)
FeCl3 positif, uji gelatin negatif  polifenol (+)
FeCl3 negatif  polifenol (-), tanin (-)

1) Sebagian larutan IVC digunakan untuk pemeriksaan dengan KLT.
Fase diam : Kieset Gel 254
Fase gerak : Metanol : Etil asetat : Asam formiat (0,5 :
9,5 : 2 tetes)
Penampak noda : pereaksi FeCl3
2) Jika timbul warna hitam menunjukan adanya polifenol dalam sampel.
89
1.4 SKEMA KERJA
IVA IVB IVC
Masukkan 0,3 gram

lalu tambahkan
ekstrak tambahkan
3-4 tetes 10%
aquadest panas, lalu
NaCl, diaduk Filtrat dibagi
diaduk dan biarkan
dan disaring menjadi 3 bagian
dingin
masing-masing ±
3 ml.
1.4.2 Uji Gelatin
Jika terjadi
endapan putih
menunjukan
adanya tanin
IV = blanko IVB = ditambah 1
tetes larutasn gelatin
& 5 ml larutan NaCl
10%

warna menjadi hijau
biru hingga hitam,
menunjukan adanya
senyawa polifenol
IVC = ditambah Amati perubahan
beberapa tetes warna yang
FeCl3 terjadi
90
Siap untuk uji KLT : Jika timbul warna

hitam menunjukan
adanya polifenol
Larutan IVC
dalam sampel
ditotolkan pada
fase diam

Fase gerak : Metanol : Etil asetat :
Asam formiat (0,5 : 9,5 : 2 tetes)
Penampak noda : Pereaksi FeCl3
91
1.5 BAGAN ALIR
Masukkan 0,3 gram ekstrak tambahkan aquadest panas, lalu diaduk dan biarkan
dingin
Lalu tambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, diaduk dan disaring
Filtrat dibagi menjadi 3 bagian (IVA, IVB, dan IVC) masing-masing ± 3

ml
1.5.2 Uji Gelatin

Larutan IVA digunakan sebagai blanko, kemudian IVB ditambah dengan 1 tetes
larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%
Jika terjadi endapan putih menunjukan adanya tanin.

Sebagai larutan IVC diberi beberapa tetes larutan FeCl3, lalu amati
perubahan warna yang terjadi
warna menjadi hijau biru hingga hitam, menunjukan adanya

senyawa polifenol

Larutan IVC ditotolkan pada fase diam. Lalu siap untuk uji KLT

Fase gerak : Metanol : Etil asetat : Asam formiat (0,5 : 9,5 : 2 tetes)
Penampak noda : Pereaksi FeCl3
Jika timbul warna hitam menunjukan adanya polifenol dalam sampel
92
1.6 HASIL
1.6.1 Uji Gelatin
Filtrat (tabung larutan IVB) yang ditambah

dengan 1 tetes larutan gelatin dan 5 ml NaCl
10% menghasilkan endapan yang berwarna
putih.
Perbandingan blanko dengan larutan IVC yang

ditambahkan dengan FeCl3  menghasilkan
perubahan warna dari kuning menjadi hitam.
1.6.3 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Larutan IVC setelah ditotolkan kemudian

dilihat dibawa sinar UV 254 nm.
93
Larutan IVC setelah dieluasi Larutan IVC setelah dieluasi
kemudian dilihat dibawa sinar kemudian dilihat dibawa sinar
UV 254 nm. UV 365 nm.
Larutan IVC setelah diberi Larutan IVC setelah diberi

penampak noda FeCl3 yang penampak noda FeCl3 yang diamati
diamati secara visual dibawah sinar UV 254 nm
Letak kolom = 3,5 cm
Rf = 3,8 / 8 = 0,475 cm
94
1.7 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk identifikasi senyawa golongan
polifenol dan tannin dengan menggunakan ekstrak Psidium guajava.
Adapun uji yang dilakukan adalah dengan uji gelatin, uji Ferri klorida dan
juga dengan uji kromatografi lapis tipis.
Polifenol merupakan salah satu kelompok senyawa yang banyak
memberikan manfaat bagi manusia. Senyawa yang termasuk kedalam
polifenol ini adalah semua senyawa yang memiliki struktur dasar fenol.
Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan pada tumbuhan.Zat ini
memiliki tanda khas yakni memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya
(Fessenden,1982).
Tanin merupakan salah satu contoh senyawa polifenol. Tanin
merupakan senyawa kimia yang terdapat luas dalam tumbuhan
berpembuluh, khusus dalam tumbuhan angiospermae terdapat dalam
jaringan kayu. Secara kimia terdapat dua jenis utama tanin, yaitu tanin
terkondensasi dan tanin terhidrolisis. Tanin terkondensasi atau flavolan
secara biosintesis dapat dianggap terbentuk dengan cara kondensasi katekin
tunggal (galokatekin) yang membentuk senyawa dimer dan kemudian
oligomer yang lebih tinggi. (Harborne, 1987).
Pada tanaman Psidium guajava memiliki kandungan flavonoid yang
sangat tinggi,terutama quercetin. Senyawa terse but bermanfaat sebagai
antibakteri, kandungan senyawa lainnya saponin, minyak atsiri,tanin, anti
mutagenic, flavonoid, dan alkaloid (Anonim, 2013).
Sebelum dilakukan uji untuk identifikasi senyawa polifenol dan tanin
sampel dipreparasi terlebih dahulu menggunakan 0,3 gram esktrak Psidium
guajava yang selanjutnya di masukan ke dalam tabung reaksi dan di
tambahkan dengan 10 ml aquadest panas hal ini bertujuan untuk menarik
seluruh tanin yang ada di ekstrak Psidium guajava. Hal ini dikarenakan
tanin merupakan senyawa polifenol yang dalam keadaan alami pada
tumbuhan berada dalam bentuk glikosidanya sehingga dapat larut dalam air.
Kemudian di tambah dengan larutan NaCl 10% sebanyak 4 tetes kemudian
diaduk dan setelah itu disaring. Penambahan NaCl berguna untuk
95
menghilangkan pengotor serta protein yang dapat mencegah terjadinya
positif palsu. Kemudian filtrat di bagi menjadi 3 bagian kurang lebih 3 ml
setiap tabung dan diberi tanda untuk masing – masing tabung IVA, IVB dan
IVC.
Pada pengujian pertama dilakukan uji gelatin, yang digunakan adalah
larutan IVB dengan ditambahkan sedikit larutan gelatin (1 tetes) kemudian
tabung digoyangkan lalu ditambahkan 5 ml larutan NaCl 10%. Penambahan
gelatin bertujuan untuk mengendapkan garam tannin tersebut, karena jika
ikatan tanin dan gelatin larutan akan akan terjadi endapan putih, hal ini
terjadi karena gelatin akan bereaksi dengan tannin, dimana tannin akan
mengendapkan protein pada gelatin. Tanin bereaksi dengan gelatin
membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air (Harborne,1996).
Reaksi ini lebih peka dengan penambahan NaCl 10% untuk mempertinggi
penggaraman dari tannin-gelatin. Setelah itu tabung IVB didiamkan
sebentar memberi waktu agar endapan terbentuk sempurna. Pada hasil uji
kelompok kami, Larutan IVB yang telah ditambahkan mengalami endapan
putih setelah diberi NaCl 10% dan gelatin. Hal ini menunjukkan pada
larutan IVB mengandung senyawa tannin.
Selanjutnya dilakukan uji Ferri klorida, larutan IVC ditambah
beberapa tetes larutan FeCl3. Apabila larutan berubah warna menjadi hijau
kehitaman itu menunjukkan adanya kandungan tanin. Perubahan warna
menjadi hijau kehitaman terjadi karena senyawa polifenol dan tannin yang
terkandung dalam larutan ekstrak bereaksi dengan larutan Ferri Klorida, hal
ini terjadi karena gugus OH pada polifenol dan tanin yang bereaksi dengan
penambahan larutan ferri klorida. Perlu diperhatikan FeCl3 ditambahkan
saat larutan dingin agar tidak teroksidasi. Dari hasil praktikum ini
didapatkan larutan berubah menjadi warna hijau kehitaman (dibandingkan
dengan blanko). Hal itu menunjukkan bahwa ekstrak Psidium guajava
mengandung tanin.
Identifikasi golongan polifenol dan tanin selanjutnya adalah dengan
kromatografi lapis tipis. Sampel ditotolkan pada fase diam berupa plat KLT
Kiesel Gel 254nm sebanyak 1 totolan dan fase geraknya digunakan
96
metanol:etilasetat:asam formiat (0,5:9,5:2tetes), lalu plat KLT dimasukkan
untuk dilakukan eluasi ditunggu eluen naik sampai garis tanda bagian atas
plat KLT. Setelah proses eluasi di semprotkan dengan penampak noda
pereaksi FeCl3. Noda yang tampak pada plat KLT setelah dieluasi dan
disemprot dengan penampak noda adalah warna noda hitam yang
menunjukkan adanya senyawa polifenol pada ekstrak Psidium guajava
penampak noda yang tampak diamati dengan sinar UV 254nm dan 365 nm.
karena berdasarkan literatur, jika sinari UV 254 nm banyak senyawa
organik yang dapat berflouresensi. Pada lampu UV 254 nm noda yang
tampak berwarna gelap (ungu) karena yang berflouresensi adalah
lempengnya yang mengandung indikator sedangkan sampelnya tidak.
Sedangkan pada lampu UV 365 nm warna noda yang tampak adalah terang
atau tampak jelas karena lempengnya tidak berflouresensi tetapi sampelnya.
Pada praktikum yang dilakukan pada uji KLT memperoleh 1 titik noda
dengan nilai Rf 0,44
97
1.8 KESIMPULAN
 Pada uji gelatin, setelah larutan IVB ditambahkan 1 tetes gelatin dan 5
ml nacl 10% terdapat endapan putih artinya ektrak positif mengandung
tanin.
 Pada uji ferri klorida, setelah larutan IVC ditambahkan 1 tetes larutan
FeCl3 terjadi perubahan warna hijau kehitaman, sehingga ektrak
tersebut positif mengandung senyawa tanin
 Pada uji KLT terdapat spot noda warna hitam dengan Rf 0,47 cm maka
dapat disimpulkan senyawa tersebut mengandung polifenol.
98
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, Manfaat dan Khasiat Dari Alam.
(http://organ1k.blogspot.com/2012/11/kandungan daun-jambu biji.html).
(akses pada tanggal 3 mei 2013)
Cahyono, S. B. 2010. Hepatitis B. Yogyakarta: KANISIUS.
Depkes RI.(1995). Materia Medika Indonesia. Jilid VI . Cetakan Keenam. Jakarta:
Direktorat Jendral Pengawasam Obat dan Makanan
Fessenden, R.J. and Fessenden, J.S. 1982. Kimia Organik. diterjemahkan oleh
Pudjaatmakan. A. H., Edisi Ketiga. Jilid 1. Penerbit Erlangga, Jakarta.
Hapsoh, Hasanah, 2011. Budidaya Tanaman Obat dan Rempah. Medan: USU
Press.
Harborne,J.B. 1987. Metode Fitokimia “Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan”. Terbitan Kedua. Penerbit ITB. Bandung
Saifuddin, Abdul Bari. 2011. Ilmu Kebidanan Sarwono Prawirohardjo.Edisi Ke-4
Cetakan Ke-4. Jakarta: PT Bina Pustaka Sarwono Prawirohardjo.
99
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ANTRAKINON
(Ekstrak Rheum officinale L)
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
100
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan antrakinon
dalam tanaman.

1.2.1 Klasifikasi Tanaman Kelembak
Gambar 1 : tanaman Rheum officinale L.

Menurut taksonominya, Rheum officinale L. dikalsifikasikan dalam:
Kingdom : Plantae
Ordo : Polygonales
Famili : Polygonaceae
Genus : Rheum
Spesies : Rheum officinale L. (Backer & Bakhuizen, 1965)
Kelembak merupakan salah satu tanaman yang sering digunakan

untuk pengobatan di Indonesia. Bagian yang digunakan dalam tanaman ini
adalah akar dan rhizomanya. Dengan indikasi untuk mengobati konstipasi,
jaundice, amenorea (tidak haid). Zat aktif yang ada dalam tanaman ini
antara lain turunan antrakinon (termasuk glikosida), rhein, emodin,
chrysophanol, aloe- emodin, physcion (Depkes, 2010).
101
a. Morfologi Tanaman
Kelembak termasuk tanaman perdu atau terna, yang tumbuh
kadangkadang memanjat, jarang yang berupa pohon, tidak berduri, tanpa
getah lateks. Daunnya tersusun spiral, kadang-kadang berhadapan atau
melingkar, umumnya ada seludang daun atau upih. Bunganya hermafrodit,
jarang berumah 1 atau 2, muncul di ketiak daun atau di ujung ranting;
aktinomorf, ada kelopak tetapi tidak ada mahkota. Tepala 4-6, benang sari
4-9. Bakal buahnya menumpang, pipih atau berbentuk segitiga, beruang 1,
isi 1 bakal biji. Buahnya kering tidak terbelah dan bijinya tidak bersayap
(Sutrisno, 1998).
Kelembak mempunyai akar berupa potongan padat, keras, berat,
bentuknya hampir silindrik, serupa kerucut atau berbentuk kubus cekung,
pipih atau tidak beraturan. Kadang berlubang dengan panjang 5 cm sampai
15 cm, lebarnya 3 cm sampai 10 cm, permukaannya yang terkupas agak
tersudut-sudut, umumnya diliputi serbuk berwarna kuning kecoklatan
terang, bagian dalamnya berwarna putih keabuan dengan garis-garis coklat
kemerahan. Pada pengamatan dengan kaca pembesar terhadap bidang
melintang terlihat garis-garis tersebut pada beberapa tempat merupakan
bentuk bintang. Patahan melintang tidak rata, berbutir-butir putih kelabu,
merah muda sampai coklat merah (Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, 1995).
1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman

Kelembak mempunyai kandungan antranoid, khusunya glikosida
antrakinon seperti rhein (semosida A dan B), aloe-emodin, physcion. Juga
mengandung asam oksalat, tanin yaitu gallotanin, katekin dan prosianidin.
Sedangkan kandungannya yang lain adalah pektin, asam fenolat (Newall et
al, 1996; Bradley, 1992; Chirikdjan et al, 1983).
Secara umum tanaman ini mengandung kandungan : Asam Krisofat,
krisofanin,rien-emodin, aloe-emodin, reokristin, alizarin, glukogalin,
tetrazin, katekin, saponin, tannin 11,80%, amilum dan kuinon. Setiap
bagian bagian tubuhnya mengandung zat-zat kimia yang berbeda; Akar
dan daunnya mengandung flavonoida, di samping itu akarnya juga
102
mengandung glikosida Reumemodin, krisofanol, rafontisin dan saponin,
sedangkan daunnya sendiri mengandung polifenol, Antraglikosida dan
frangula-emodin. Pada batangnya mengandung asam Krisofhanat,
Emodian dan Rhein (Depkes, 2010).
Antrakinon bebas sebagai krisofanol, aloe-emodin, rhein, emodin, dan
emodin mono-etil eter (physcion). Senyawa tersebut juga terdapat dalam
bentuk glikosida. Sejumlah glikosida dengan aglikon yang berhubungan
dengan antrasena ditemukan dalam tanaman obat kelembak. Glikosida ini
jika hidrolisis menghasilkan aglikon di-, tri-, atau tetrahidroksi
antrakuinon atau modifikasinya. Contohnya jika frangulin dihidrolisis
maka akan mengasilkan emodin (1,6,8-trihidroksi-3-metil antrakuinon)
dan rhamnosa. Antrakuinon bebas hanya memiliki sedikit aktivitas
terapeutik. Residu gula memfasilitasi absorpsi dan translokasi aglikon
pada situs kerjanya. Glikosida antrakuinon adalah katartik stimulant dan
bekerja dengan cara meningkatkan tonus otot halus dari usus besar
(Depkes, 2010).
Kelembak mempunyai kandungan antranoid, khusunya glikosida
antrakinon seperti rhein (semosida A dan B), aloe-emodin, physcion. Juga
mengandung asam oksalat, tanin yaitu gallotanin, katekin dan prosianidin.
Sedangkan kandungannya yang lain adalah pektin, asam fenolat (Newall et
al, 1996; Bradley, 1992; Chirikdjan et al, 1983).
Rheinosida bersifat sebagai pencahar (mengatasi konstipasi). Karena
itu penggunaannya sebagai pencahar akan efektif sekitar 6 jam dan
terkadang bisa menjadi tidak aktif dalam waktu 24 jam setelah pemakaian
oral.
1.2.3 Manfaat Tanaman

Mengobati konstipasi, jaundice, amenorea, akar kelembak menjadi
komponen dalam rokok klembak menyan yang populer di kalangan
masyarakat menengah ke bawah di DIY dan jateng kelembak juga
dijadikan campuran dalam pembuatan jamu. Khasiat obatnya adalah
sebagai laksatif penenang. Mengobati sembelit (konstipasi) dan membantu
103
mengatasi penggumpalan darah dan nanah serta Pengobatan hepatitis B
(Depkes, 2010).
Masing-masing manfaat terperinci tiap bagiannya adalah sebagai
berikut; Batangnya dapat mengobati malaria, sariawan dan batuk, Akarnya
mengandung glikosida adstringent yang berkelakuan sebagai zat
penyamak. Pada akarnya pula mengandung antrkuinon yang berefek
purgative,dan tannin yang berefek melawan astringen atau dapat disebut
sebagai adstringent,tapi dalam jumlah kecil efek astringen juga
dibutuhkan,tapi jika terlalu banyakmaka dapat menimbulkan efek laksatif
(Depkes, 2010).
Memperlancar buang air besar (BAB). Senyawa aktif dari akar
kelembak akan diuraikan dulu oleh bakteri dalam usus sehingga menjadi
bentuk senyawa yang dapat merangsang sistem pencernaan, yang akhirnya
dapat meningkatkan pergerakan usus sehingga buang air besar menjadi
mudah.
Manfaat lain dari Rheum officinale
 Melancarkan haid.
 Membantu mengatasi sakit kuning.
 Membantu menghentikan perdarahan.
Kelembak diketahui sekarang juga mengandung bahan yang aktif
dalam pengobatan Hepatitis B.
1.2.4 Efek Farmakologi pada Tanaman

Pada pengujian terhadap tikus, ditemukan bahwa kandungan rhein
pada kelembak dengan dosis 100 mg/kg bb per hari, mampu mereduksi
lemak pada db/db mencit. Menggunakan diet-induced obese (DIO)
C57BL/6 (db/db) mencit, didapatkan hasil bahwa rhein dapat memblok
kadar lemak yang tinggi pada hewan uji yang mengalami obesitas, diukur
berdasarkan massa lemak dan ukuran dari adiposit putih dan coklat serta
penurunan serum kolesterol, LDL kolesterol dan kadar glukosa darah
puasa pada mencit. Berdasarkan penggunaan metode analisis ekspresi gen
dan reporter assay ditemukan bahwa rhein menginhibisi transaktivitas
peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) dan ekspresi dari
104
target gen, menunjukkan bahwa rhein bisa berfungsi sebagai antagonis
dari PPARγ (Zhang et al., 2012).
1.2.5 Tinjauan Tentang Senyawa Antrakinon

Glikosida antrakinon, golongan glikosida yang hampir mirip dengan
golongan antrasena yang memiliki gugus karbonil pada kedua atom C
yang berseberangan, atau hanya pada salah satunya saja yang disebut
antron, atau hanya pada salah satunya namun diganti gugus hidroksil yang
disebut antranol. Senyawa antrakinon dan turunannya seringkali bewarna
kuning sampai merah sindur (oranye), larut dalam air panas atau alkohol
encer.
Kuinon adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar
seperti kromofor pada benzokuinon, yang terdiri atas dua gugus karbonil
yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbo-karbon. Untuk tujuan
identifikasi kuinon dapat dibagi atas empat kelompok yaitu : benzokuinon,
naftokuinon, antrakuinon dan kuinon isoprenoid. Tiga kelompok pertama
biasanya terhidroksilasi dan bersifat fenol serta mungkin terdapat dalam
bentuk gabungan dengan gula sebagai glikosida atau dalam bentuk kuinol
(Harborne, 1987). Golongan kuinon alam terbesar terdiri atas antrakuinon
dan keluarga tumbuhan yang kaya akan senyawa jenis ini adalah
Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae (Robinson, 1995; Herbert,19..).
Antrakuinon juga disebut 9,10- dioxo-dihydro-anthracen dengan rumus
C₁₄H₈O₂ (Merck, 1983; Samuelsson, 1999; Morrison dan Boyd, 1959)
Semua antrakuinon berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, larut
dalam pelarut organik basa. Senyawa ini biasa berwarna merah, tetapi
yang lainnya berwarna kuning sampai coklat, larut dalam larutan basa
dengan membentuk warna violet merah. Banyak antrakuinon yang terdapat
sebagai glikosida dengan bagian gula terikat dengan salah satu gugus
hidroksil fenolik (Robinson, 1995). Sama halnya dengan sifat glikosida
lainnya, glikosida antrakuinon juga mudah terhidrolisis. Bentuk uraiannya
adalah aglikon dihidroksi antrakuinon, trihidroksi antrakuinon, atau
tetrahidroksi antrakuinon. Sementara bagian gulanya tidak tertentu.
Antrakinon terhidroksilasi tidak sering terdapat dalam tumbuhan secara
105
bebas tetapi sebagai glikosida. Turunan antrakinon yang terdapat dalam
tanaman pergative berbentuk dihidroks fenol. Turunan antrakuinon sering
kali berwarna merah orange.
Gambar 2 : Struktur Dasar Senyawa Antrakinon
a. Sifat Fisika Kimia senyawa Antrakinon

Senyawa antrakinon dan turunannya seringkali bewarna kuning
sampai merah sindur (orange), larut dalam air panas atau alkohol encer.
Untuk identifikasi digunakan reaksi Borntraeger. Antrakinon yang
mengandung gugus karboksilat (rein) dapat diekstraksi dengan
penambahan basa, misalnya dengan natrium bikarbonat. Hasil reduksi
antrakinon adalah antron dan antranol, terdapat bebas di alam atau sebagai
glikosida. Antron bewarna kuning pucat, tidak menunjukkan fluoresensi
dan tidak larut dalam alkali, sedangkan isomernya, yaitu antranol bewarna
kuning kecoklatan dan dengan alkali membentuk larutan berpendar
(berf1uoresensi) kuat. Oksantron merupakan zantara (intermediate) antara
antrakinon dan antranof. Reaksi Borntraeger modifikasi Fairbairn, yaitu
dengan menambahkan hidrogen peroksida akan menujuk-kan reaksi
positif. Senyawa ml terdapat dalam Frangulae cortex. Diantron adalah
senyawa dimer tunggal atau campuran dan molekul antron, hasil oksidasi
antron (misalnya larutan dalam aseton yang diaerasi dengan udara).
Diantron merupakan aglikon penting dalam Cassia, Rheum, dan Rhamnus;
dalam golongan ini misalnya senidin, aglikon senosida. Reidin A, B, dan
C yang terdapat dalam sena dan kelembak merupakan heterodiantron.
106
b. Efek Farmakologi pada Senyawa Antrakinon
Glikosida antrakinon adalah stimulan katartika dengan meningkatkan
tekanan otot polos pada dinding usus besar, aksinya akan terasa sekitar 6
jam kemudian atau Iebih lama. Adapun mekanisme belum jelas, namun
diduga antrakinon dan antranol dan turunannya berpengaruh terhadap
tranpor ion dalam sel colon dengan menghambat kanal ion C1. Untuk
antron dan antranol mengeluarkan kegiatan lebih drastik (itulah sebabnya
ada beberapa simplisia yang boleh digunakan setelah disimpan selama satu
tahun, untuk mengubah senyawa tersebut menjadi antrakinon), bHa
jumlahnya Iebih besar dan pada antrakinon akan mengakibatkan mulas dan
rasa tidak enak.
c. Kegunaan Senyawa Golongan Antrakinon

Sebagai katartika, pewarna, dan antibakteri.
1.2.6 Tinjauan tentang Kromatografi Lapis Tipis

lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk
pemisahan. Senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi
lapis tipis, tidak tetap jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada
kromatografi kertas. Karena itu pada lempeng yang sama disamping
107
kromatogram dari zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang
berbeda – beda. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2
bercak dengan harga Rf dan ukuran yang lebih kurang sama. Ukuran dan
itensitas bercak dapat digunakan untuk memperkirakan kadar. Penetapan
kadar yang lebih teliti dapat dilakukan dengan cara spektrofotometri. Pada
kromatografi lapis tipis dua dimensi, lempeng yang telah dieluasi diputar
90° dan dieluasi lagi, umumnya menggunakan bejana lain yang berisi
pelarut lain (Depkes RI Materia Medika jilid VI)
a. Alat
 Lempeng kaca: tebal seluruh permukaan lempeng kaca sama,
umunya berukuran 20cm x 20cm; sebagai lempeng tapi digunakan
lempeng kaca berukuran 5cm x 20cm.
 Baki lempeng. Umumnya baki lempeng berukuran 122cm x 23cm
 Rak penyimpanan. Rak penyimpanan dipergunakan untuk tempat
lempeng tang telah dilapisi zat penyerap pada waktu pengeringan
atau pemindahan. Rak mempunyai ukuran yang cocok sehingga
dapat masuk kedalam lemari pengering. Dapat memuat lebih kurang
10 lempeng dengan jarak tertentu.
 Zat penyerap. Zat penyerap yang terdiri dari zat penyerap
 Alat pembuat lapisan. Berbentuk bak panjang yang dibuat dengan
108
 Bejana Kromatografi. Umumnya dapat memuat 2 lempeng kaca dab
penutup
 Sablon. Umunya dibuat dari plastik, digunakan untuk membantu
tempat penutulan dengan jarak tertentu dan untuk membantu
memberi tanda – tanda lain pada lempeng.
 Pipet mikro. Pipet mikr berskala 10µl untuk memindahkan cairan.
 Alat penyemprot pereaksi.alat penyemptoy tahann terhadap pereaksi
 Pelarut; larutan pembanding; larutan zat yang diperiksa; pereaksi.
 Lampu ultraviolet. Lampu ultraviolet yang cocok untuk pengamatan
dengan panjang gelombang pendek 254 nm) dan dengan panjang
b. Cara kerja
lap bersih. Pada waktu melapiskan zat penyerap, lempeng harus bebas
dari serat atau debu. Atur lempeng kaca di atas baki lempeng, letakkan
109
berukuran 20cm x 20cm. Pekerjaan melapisi ini harus selesai dalam
waktu 2 menit sejak penambahan air, karena setelah 2 menit campuran
mulai menjadi keras. Geser hati – hati alat pembuat lapisan diatas
lemepng kaca ke arah sisi pendek baki yang berbingkai. Jika telah sampai
pada lempeng tepi terakhir, angkat alat pembuat lapisan. Cuci segera alat
pembuat lapisan. Biarkan lempeng selama 5 menit kemudian pindahkan
lempeng, dengan lapisan menghadap ke atas, pada rak penyimpanan,
keringkan pada suhu 105° selama 30 menit. Setelah lempeng kering,
biarkan dingin hingga suhu kamar dan amati serba ratanta pembagian dan
susunan zat penyerap. Cahaya yang ditransmisikan akan menunjukkan
keserba rataan susunan. Simpan lempeng yang baik dalam eksikator yang
cocok. Kecuali dinyatakn lain pada masing – masing monografi
tempatkan pada sisi bejana kromatografi, 2 helai kertas saring, tinggi
18cm lebar sama dengan panjang bejana.
Masukkan lebih kurang 100ml pelarut kedalam bejana kromatografi
jarak lebih kurang 1,4cm larutan zat yang diperiksa dan larutan
dan terletak lebih kurang 2cm dari tepi bawah lempeng, biarkan kering.
110
1.2.7 Cara Mengidentifikasi Senyawa Antrakinon

a. Reaksi Warna
Antrakuinon merupakan senyawa turunan dari antrasena yang
diperoleh dari reaksi oksidasi dari antarasena. Golongan ini memiliki
anglikoh yang sekerabat dengan antrasena yang memiliki gugus karbonil
pada kedua atom C yang berseberangan (atom C9 dan C10) atau hanya C4
(antron) dan sampai marah sindur (orange), larut dalam air panas atau
alkohol encer. Untuk identifikasi digunakan reaksi Borntraeger. Semua
antrakuinon memberikan warna reaksi yang khas dengan reaksi
Borntraeger jika ammonia ditambahkan: larutan berubah menjadi merah
untuk antrakuinon. Antrakuinon yang mengandung gugus karboksilat
(rein) dapat diekstraksi dengan penambahan basa, misalnya dengan
natrium bikarbonat. Hasil reduksi antrakuinon adalah antron danantranol,
terdapat bebas di alam atau sebagai glikosida (Stanitsky, 2003).
Dalam mendeteksi glikosida pada Rhei radix khususnya Rhei palmati
radix menggunakan solvent sistem etil asetat : methanol : air (100 : 13,5 :
10) dan dideteksi menggunakan UV 365 nm akan di dapatkan fluorescent
menonjol berwarna kuning yang merupakan antraquinone aglycone zone
meliputi emodin, aloe-emodin, physcion, danchrysophanol. Selain itu akan
nampak pula 8-O-monoglukosides dengan warna coklat-merah dengan
111
Rf 0.45–0.55 dan dihasilkan pula sedikit diglikosides pada range Rf 0.1–
0.3. Sedangkan aglikon polar rhein ditunjukan pada warna biru florescent
dengan Rf ~ 0.4 (Wagner dan Bladt,2001).
b. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT )

KLT adalah kromatografi serapan, dimana sebagai fasa tetap (diam)
berupa zat padat yang disebut adsorben (penyerap) dan fasa gerak adalah
zat cair yang disebut larutan pengembang (Gritter, 1991).
Kromatografi Lapis Tipis Dalam kromatografi lapis tipis (KLT),
adsorben diletakkan tepat pada satu sisi plat atau kaca atau saluran plastik
ataupun aluminium. Adsorben yang paling sering digunakan adalah silika
gel dan alumina. Beberapa mikroliter larutan sampel yang akan dianalisa
ditotolkan pada plat sebagai titik kecil yang tunggal dengan menggunakan
pipa mikrokapilaritas. Plat dikembangkan dengan meletakkannya didalam
botol ataupun chamber pengembang yang berisi sejumlah kecil pelarut.
Pelarut akan menaiki plat dengan adanya gaya kapilar, dan membawa
senyawa dari sampel dengan itu. Senyawa yang berbeda dipisahkan dari
dasarnya pada saat interaksi mereka dengan lapisan adsorben. Plat KLT
yang biasa digunakan adalah plat dengan ukuran pori silika 60 Å dan
ketebalan lapisan 25 µm dalam penyangga poliester atau aluminium,
beberapa dengan menggunakan atau tanpa menggunakan indikator
fluorosensi yang sesuai untuk analisa cepat dari ekstrak kasar tanaman dan
digunakan sebagai dasar dari langkah preparatif. Plat biasa dapat digunting
dengan menggunakan gunting atau kertas cutter untuk mengambil ukuran
yang diinginkan. Deteksi noda yang dihasilkan dapat menggunakan lampu
ultraviolet ataupun dengan menyemprot dengan menggunakan reagen yang
sesuai (Cseke et al., 2006).
Fasa diam dalam KLT berupa silika gel (biasanya berupa plat silika
gel F254 yang mampu mengikat senyawa yang akan dipisahkan.
Sedangkan fasa geraknya berupa berbagai macam pelarut atau campuran
pelarut. Proses pengembangan atau elusi ialah proses pemisahan campuran
cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan fase
diam. Jarak hasil pemisahan senyawa pada kromatogram biasanya
112
dinyatakan atau harga Rf. Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan cara
analisis cepat yang memerlukan bahan yang sedikit. Untuk penelitian
kandungan flavonoid suatu ekstrak umumnya pengembang beralkohol.
Larutan pengembang pertama pada KLT misalnya butanol-asam asetat-air
(BAA) (Markham, 1998). Pemisahan flavonoid dengan KLT dapat
menggunakan penyemprot amoniak/uap amoniak yang memberikan warna
biru kehijauan, hijau kekuningan, lembayung dan kuning kecoklatan
(Halimah, 2010).
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran
kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran
rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam,
maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan
resolusinya.Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan
serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT
adalah adsorpsi dan partisi (Rohman, 2007).
Pada uji ini digunakan fase diam lapisan tipis selulosa (Kiesel Gel
254), fase gerak kloroform : etil asetat : asam formiat (0,5 : 9 : 1) tetes, dan
penampak noda yang digunakan yaitu pereaksi FeCl3. Adanya polifenol
ditunjukkan dengan adanya noda berwarna hitam.
1) Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi
dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel (Johnson, 1991).
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah
satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman
yang luas dari fase gerak yang digunakan dalam semua mode KLT,
tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya
harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus:
 Murni; tidak ada pencemar/kontaminan
113
 Tidak bereaksi dengan pengemas
 Sesuai dengan detektor
 Melarutkan cuplikan
 Mempunyai viskositas rendah
 Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
 Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena
prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua
persyaratan di atas, 4 persyaratan pertama adalah yang paling penting.
Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut,
karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan
banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan (Johnson, 1991).
Elusi Gradien dan Isokratik Elusi dapat dilakukan dengan cara
isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara
bergradien (komposisi fase gerak berubah – ubah selama elusi). Elusi
bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas
(Rohman, 2007).
2) Fase diam (lapisan penjerap)

Kromatografi lapis tipis, fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri
atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar
yang biasanya terbuat dari kaca, dapat pula terbuat dari plat polimer
atau logam. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan bahan
pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum. Penjerap yang umum
dipakai untuk kromatografi lapis tipis adalah silika gel, alumina,
kieselgur dan selulosa (Gritter et al., 1991).
Dua sifat yang penting dari fase diam adalah ukuran partikel dan
homogenitasnya, karena adesi terhadap penyokong sangat tergantung
pada kedua sifat tersebut. Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah
1-25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan
memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu cara untuk
memperbaiki hasil pemisahan adalah dengan menggunakan fase diam
114
yang butirannya lebih halus. Butiran yang halus memberikan aliran
pelarut yang lebih lambat dan resolusi yang lebih baik
(Sastrohamidjojo, 1985).
3) Harga Rf
Mengidentifikasi noda-noda dalam kromatografi lapis tipis sangat
lazim menggunakan harga Rf (Retordation Factor) yang didefinisikan
sebagai:
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf (Sastrohamidjojo, 1985):

a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
b. Sifat penjerap
c. Tebal dan kerataan dari lapisan penjerap
d. Pelarut dan derajat kemurniannya
e. Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana
f. Teknik percobaan
g. Jumlah cuplikan yang digunakan
h. Suhu
i. Kesetimbangan
1.2.8 Indeks Polaritas

Polaritas sering diartikan sebagai adanya pemisahan kutub bermuatan
positif dan negatif dari suatu molekul sebagai akibat terbentuknya
konfigurasi tertentu dari atom-atom penyusunnya. Dengan demikian,
molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul yang lain yang juga
mempunyai polaritas yang kurang lebih sama. Besarnya polaritas dari
suatu pelarut proporsional dengan besarnya konstanta dielektriknya
(Adnan, 1997).
Menurut Stahl (1985), konstanta dielektrik (ε) merupakan salah satu
ukuran kepolaran pelarut yang mengukur kemampuan pelarut untuk
menyaring daya tarik elektrostatik antara isi yang berbeda.
115
Ekstraksi berkesinambungan dilakukan secara berturut-turut dimulai
dengan pelarut nonpolar (misalnya n-heksan atau kloroform) dilanjutkan
dengan pelarut semipolar (etil asetat atau dietil eter) kemudian dilanjutkan
dengan pelarut polar (metanol atau etanol). Pada proses ekstraksi akan
diperoleh ekstrak awal (crude extract) yang mengandung berturutturut
senyawa nonpolar, semipolar, dan polar (Hostettmann et al., 1997).
1.2.9 Tinjauan Eluen

Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau
beberapa pelarut. Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya
gaya kapiler. Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak hanyalah pelarut
bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen
ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang terdiri
atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam
bagian volume total 100 (Nyiredy, 2002).
Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan oleh
Snyder’s berdasarkan kekuatan pelarutnya. Menurut Stahl (1985) eluen
116
atau fase gerak yang digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2
kelompok, yaitu untuk pemisahan senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen
untuk pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, metanol, asam asetat,
etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, dan n-butano l
sedangkan untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter,
kloroform, benzena, toluena, sikloheksana, dan petroleum eter.
a. Toluena
Toluena, dikenal juga sebagai metilbenzena ataupun fenilmetana,
adalah cairan bening tak berwarna yang tak larut dalam air dengan aroma
seperti pengencer cat dan berbau harum seperti benzena. Toluena adalah
hidrokarbon aromatik yang digunakan secara luas dalam stok umpan
industri dan juga sebagai pelarut. Seperti pelarut-pelarut lainnya, toluena
juga digunakan sebagai obat inhalan oleh karena sifatnya yang
memabukkan.
Golongan : Hidrokarbon aromatik
Sinonim :Toluol, Tolu-Sol; Methylbenzene;
Methacide; Phenylmetana; Methylbenzol.
Deskripsi : Cairan tidak berwarna, berbau manis, pedas
seperti benzene
Rumus Molekul : C7H8 (C6H5CH3)
Massa Molar : 92,14 g/mol
Densiitas : 0,8669 g/mL, zat cair
Titik Lebur : −93 °C
Titik didih : 110,6 °C
Kelarutas dalam air : 0,47 g/l (20-25 °C)
Viskositas : 0,590 cP at 20 °C
Kelarutan : larut dalam dietil eter, etanol, benzene,
kloroform, asam asetat glasial, karbon
disulfida dan aseton; praktis tidak larut
dalam air dingin; kelarutan dalam air: 0,561
g/L pada suhu 25°C.
117
b. Etil asetat
Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH3CH2OC(O)CH3.
Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam asetat. Senyawa ini
berwujud cairan tak berwarna, memiliki aroma khas. Senyawa ini sering
disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan OAc mewakili asetat.
Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai pelarut. Etil asetat
adalah pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap), tidak
beracun, dan tidak higroskopis. Etil asetat merupakan penerima ikatan
hidrogen yang lemah, dan bukan suatu donor ikatan hidrogen karena tidak
adanya proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat pada
atomelektronegatif seperti flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat
melarutkan air hingga 3%, dan larut dalam air hingga kelarutan 8%
pada suhu kamar. Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih tinggi.
Namun, senyawa ini tidak stabil dalam air yang
mengandung basa atau asam. Berikut ini adalah karakteristik atau sifat
fisika dan sifat kimia dari etil asetat :
Sifat fisis
Berat molekul : 88,1 kg/kmol
Boiling point : 77,1ºC
Flash point : -4ºC
Melting point : - 83,6ºC
Suhu kritis : 250,1ºC
Tekanan kritis : 37,8 atm
Kekentalan (25oC) : 0,4303 cP
Specific grafity ( 20ºC): 0,883
Kelarutan dalam air : 7,7% berat pada 20°C
Entalphy pembentukan (25ºC) gas : -442,92 kJ/mol
Energi Gibbs pembentukan (25ºC) cair : -327,40 kJ/mol
Sifat Kimia
Etil asetat adalah senyawa yang mudah terbakar dan mempunyai
resiko peledakan (eksplosif).
118
c. Asam Asetat Glasial
Asam asetat glasial merupakan nama trivial yang merujuk pada asam
asetat yang bebas-air (anhidrat). Asam asetat, asam etanoat atau asam
cuka[10] adalah senyawa kimia asamorganik yang dikenal sebagai pemberi
rasa asam dan aroma dalam makanan. Asam cuka memiliki rumus
empiris C2H4O2. Rumus ini seringkali ditulis dalam bentuk CH3–
COOH, CH3COOH, atau CH3CO2H. Asam asetat pekat (disebutasam
asetat glasial) adalah cairan higroskopis tak berwarna, dan memiliki titik
beku 16,7°C. Cuka mengandung 3–9% volume asam asetat,
menjadikannya asam asetat adalah komponen utama cuka selain air. Asam
asetat berasa asam dan berbau menyengat. Selain diproduksi untuk cuka
konsumsi rumah tangga, asam asetat juga diproduksi sebagai prekursor
untuk polivinil asetatdan selulosa asetat. Meskipun digolongkan
sebagai asam lemah, asam asetat pekat bersifat korosif dan dapat
menyerang kulit. Asam asetat merupakan salah satu asam
karboksilat paling sederhana, setelah asam format. Larutan asam asetat
dalam air merupakan sebuah asam lemah, artinya hanya terdisosiasi
sebagian menjadi ion H+ dan CH3COO–. Asam asetat merupakan pereaksi
kimia dan bahan baku industri yang penting. Asam asetat digunakan
dalam produksi polimer seperti polietilena tereftalat selulosa asetat,
dan polivinil asetat, maupun berbagai macam serat dan kain. Dalam
industri makanan, asam asetat, dengan kode aditif makanan E260,
digunakan sebagai pengatur keasaman. Di rumah tangga, asam asetat encer
juga sering digunakan sebagai pelunak air.
Rumus kimia : C2H4O2
Massa molar : 60.05 g mol−1
Penampilan : Cairan tak berwarna/kristal, bau menyengat seperti cuka
Densitas : 1,049 g cm−3
Titik lebur : 289 sampai 290 K
Titik didih : 391 sampai 392 K
Kelarutan di air : dapat dicampur
Log p : -0,3
119
1.3 PROSEDUR KERJA
1.3.1 Reaksi warna
a. Uji Borntrager
 Ekstrak sebanyak 0,3 gram di ekstraksi dengan 10 ml aquadest,
saring, lalu filtrat diekstraksi dengan toluene dalam corong pisah.
 Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian fase toluena
dikumpulkan dan dibagi menjadi dua bagian, disebut sebagai larutan
VA dan VB.
 Larutan VA sebagai blanko, larutan VB ditambahkan ammonia pekat
1 ml dan dikocok.
 Timbulnya warna merah menunjukkan adanya senyawa antrakinon.
b. Uji modifikasi Borntrager
 Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambahkan dengan 5 ml KOH 0,5 N
dan 1 ml H2O2 encer.
 Dipanaskan selama 5 menit dan disaring, filtrat ditambah asam asetat
glasial 1 tetes, kemudian diekstraksi dengan 5 ml toluena.
 Fase toluena diambil dan dibagi menjadi dua bagian sebagai larutan
VIA dan VIB.
 Larutan VIA sebagai blanko, larutan VIB ditambahkan ammonia
pekat 1 ml. Timbulnya warna merah atau merah muda pada lapisan
alkalis menunjukkan adanya antrakinon.
c. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

1. Sampel ditotolkan pada fase diam. Uji kromatografi lapis tipis ini
menggunakan:
Fase Diam : Kiesel Gel 254
Fase Gerak : toluena - etil asetat - asam asetat glasial (75:24:1)
Penampak noda : Larutan KOH 10% dalam methanol.
2. Timbulnya noda berwarna kuning, kuning coklat, merah ungu atau
hijau ungu menunjukkan adanya senyawa antrakinon
120
1.4 BAGAN ALIR
1.4.1 Reaksi Warna
a. Uji Borntrager
b. Uji Modifikasi Borntrager
121
c. Kromatografi Lapis Tipis
122
1.5 SKEMA KERJA
1.5.1 Reaksi Warna
a. Uji Borntrager
Ekstrak di ekstraksi dengan Filtrat, di ekstraksi dengan

0,3gram 10ml aquadest, saring, 5ml Toluena dalam
corong pisah
Ekstraksi Fase Toluena dibagi menjadi dua

dilakukan Dikumpulkan bagian. VA dan VB
2x
Timbulnya Senyawa merah

menunjukan adanya
VB + Amonia Pekat senyawa Antrakinon
VA blanko
1 ml dan dikocok
b. Uji Modifikasi Borntrager
Ekstrak + 5ml KOH 0,5N dan Dipanaskan 5

0,3gram 1ml H2O2 encer menit dan disaring
Filtrat + Asam asetat glasial 1 Fase Toluena diambil

tetes kemudaian diekstraksi dan dibagi menjadi 2
dengan 5ml Toluena bagian VIA dan VIB
timbulnya warna merah atau

VIA merah muda menunjukan
VIB + Amonia adanya ANTRAKINON
Blanko
pekat 1ml
123
Sampel ditotolkan pada Fase Diam
Pemeriksaan KLT
Fase Diam Kiesel Gel Fase gerak :
254 - Toluena 75
- Etil Asetat 24
- Asam asetat glasial 1
dieluasi
amati plat KLT pada sinar UV 254
Semprotkan penampak Noda

Larutan KOH 10% dalam etanol
amati plat KLT pada sinar UV

254nm dan 365nm
jika timbul warna KUNING, KUNING COKLAT, MERAH

UNGU atau HIJAU UNGU menunjukan adanya senyawa
ANTRAKINON pada sampel
124
1.6 HASIL PRAKTIKUM
1.6.1 Reaksi Warna
a. Uji Borntrager
Ekstrak yang telah ditambahkan oleh aquadest

+ toluena + amonia pekat ( VB ) dibandingkan
dengan blanko ( VA ), menunjukkan hasil
bahwa larutan uji ( VB ) terdapat warna merah
keunguan yang menujukkan adanya senyawa
antrakinon
b. Uji Modifikasi borntrager
Ekstrak yang telah ditambahkan oleh KOH + H2O2,

kemudian dipanaskan ditambahkan lagi asam asetat
glasial + toluena + amonia pekat ( VIB )
dibandingkan dengan blanko ( VIA ), menunjukkan
hasil bahwa larutan uji ( VIB ) terdapat warna merah
muda yang menunjukkan adanya senyawa antrakinon
125
Sampel setelah ditotolkan di Sampel setelah ditotolkan di

plat KLT dan diamati di plat KLT dan diamati di
sinar UV 254nm sinar UV 365nm
Sampel setelah dieluasi dan Sampel setelah dieluasi dan

diamati di sinar UV 254nm diamati di sinar UV 365nm
126
Sampel setelah dieluasi dan Sampel setelah dieluasi dan
diberi penampak noda diberi penampak noda
ketika diamati di sinar UV ketika diamati di sinar UV
254nm 365nm
Sampel setelah dieluasi, diberi penampak

noda dan diamati secara visual sehingga
bisa diketahui nilai Rf dari masing –
masing noda yang tampak
127
1.6.2 Perhitungan
a. Nilai Rf pada Sampel
 Letak totolan : 1,8
Nilai Rf : 1,8/8 = 0,23
Nilai Rf : 2,0/8 = 0,25
Nilai Rf : 0,9/8 = 0,11
Nilai Rf : 2,5/8 = 0,31
Nilai Rf : 4,0/8 = 0,5
Nilai Rf : 5,2/8 = 0,65
Nilai Rf : 7,3/8 = 0,91
Rf Warna Noda
1. 0,23 1. Kuning
2. 0,25 2. Kuning coklat
4. 0,31 4. Merah keunguan
b. Nilai Rf pada larutan uji borntrager

Nilai Rf : 4,0/8 = 0,5 ( warna noda merah keunguan )
128
c. Nilai Rf pada larutan uji modifikasi borntrager
Nilai Rf : 4,0/8 = 0,5
Nilai Rf : 7,3/8 = 0,91
Rf Warna Noda

129
1.7 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa
golongan antrakinon dalam ekstrak tanaman Rheum officinale. Kelembak
mempunyai kandungan antranoid, khususnya glikosida antrakinon seperti
rhein (semosida A dan B), aloe-emodin, Antrakinon terdapat sebagai
glikosida dengan bagian gula terikat dengan salah satu gugus hidroksil
fenolik (Robinson, 1995). Sama halnya dengan sifat glikosida lainnya,
glikosida antrakuinon juga mudah terhidrolisis. Bentuk uraiannya adalah
aglikon dihidroksi antrakuinon, trihidroksi antrakuinon, atau tetrahidroksi
antrakuinon. Sementara bagian gulanya tidak tertentu. Antrakinon
terhidroksilasi tidak sering terdapat dalam tumbuhan secara bebas tetapi
sebagai glikosida physcion. Juga mengandung asam oksalat, tanin yaitu
gallotanin, katekin dan prosianidin.
Untuk mengidentifikasi senyawa antrakinon dalam ekstrak tanaman
Rheum officinale adalah dengan cara pengujian reaksi warna uji Borntrager
dan uji modifikasi Borntrager serta KLT.
Uji yang pertama dilakukan yaitu Uji Borntrager. Dilakukan dengan cara
Ekstrak sebanyak 0,3 gram diekstraksi dengan 10 ml aquadest, Ekstraksi
dengan aqudest dilak ukan untuk menghilangkan senyawa-senyawa lain yang
bersifat polar karena keberadaan senyawa tersebut dapat mengganggu proses
ekstraksi antrakuinon. Setelah itu dilakukan ekstraksi dengan menggunakan
toluena untuk mengekstraksi senyawa antrakuinon saja Ekstraksi dilakukan
sebanyak dua kali yang bertujuan untuk menarik senyawa antrakuinon yang
ada pada larutan yang diuji diperoleh dalam jumlah yang cukup banyak
sehingga diperoleh hasil yang cukup valid. Kemudian fase toluena
dikumpulkan dan dibagi menjadi dua bagian, disebut sebagai larutan VA (
blanko ) dan VB ( latutan uji ) yang kemudian ditambah amonia pekat 1 ml
dan dikocok, pada larutan uji menunjukkan perubahan warna menjadi merah
keunguan yang menandakan bahwa larutan uji terdapat senyawa golongan
antrakuinon. Hal ini terjadi karena gugus phenol yang ada pada antrakuinon
jika bereaksi dengan ammonia akan membentuk komplek phenate yang
berwarna merah.
130
Uji untuk reaksi warna yang kedua yaitu Uji Modifikasi Borntrager. Pada
uji modifikasi borntrager pada larutan yang diuji ditambahkan dengan KOH
0,5 N yang bertujuan untuk menghidrolisis glikosida antron dan antranol serta
membentuk garam kalium dengan aglikon. Dan juga pada larutan uji
ditambahkan H2O2 yang digunakan untuk mempercepat oksidasi
antron/antranol menjadi antrakuinon. Setelah dilakukan penambahan dengan
KOH dan H2O2. Dipanaskan selama 5 menit dan disaring Pemanasan
bertujuan untuk menaikkan suhu larutan karena antrakuinon larut dalam
pelarut organik yang panas. Setelah dilakukan pemanasan larutan uji
ditambahkan dengan asam asetat glasial sebanyak 1 tetes. Penambahan Asam
asetat glasial digunakan untuk menetralkan larutan uji yang ada. Setelah itu
ditambahkan dengan 5ml toluena yang bertujuan untuk mengesktraksi
senyawa antrakinon saja. Fase toluena diambil dan dibagi menjadi dua
sebagai larutan VIA ( larutan blanko ) dan VIB sebagai larutan yang akan
diuji dan pada larutan ini ditambahkan dengan 1 ml amonia pekat yang
menunjukkan perubahan warna menjadi merah muda yang menandakan
adanya senyawa golongan antrakuinon. Hal ini terjadi karena gugus phenol
yang ada pada antrakuinon jika bereaksi dengan ammonia akan membentuk
komplek phenate yang berwarna merah.
Cara Identifikasi senyawa antrakinon yang terkahir yaitu Kromatografi
Lapis Tipis. Diambil sedikit ekstrak Rheum officinale kemudian dilarutkan
dalam ethanol sebanyak 0,5 ml. Fungsi penambahan ethanol adalah untuk
melarutkan ekstrak sehingga ekstrak yang digunakan berupa cairan bukan
padatan. Untuk identifikasi kali ini eluen yang digunakan adalah toluena-etil
asetat-asam asetat glasial dengan perbandingan 75:24:1. Eluen yang sudah
jadi dimasukkan ke dalam chamber sebagai fase gerak. Plat KLT yang sudah
dieluasi lalu disemprot dengan penampak noda larutan KOH 10% dalam
metanol untuk memperjelas noda yang tampak. Warna noda setelah
penyemprotan adalah merah keunguan. Selain merah keunguan noda yang
tampak yaitu kuning dan kuning kecoklatan dari pengamatan yang diperoleh
tersebut menunjukkan bahwa sampel yang diuji positif mengandung senyawa
antrakinon,
131
Penampak noda yang tampak diamati dengan sinar UV 254nm dan 365
nm. karena berdasarkan literatur, jika sinari UV 254 nm banyak senyawa
organik yang dapat berflouresensi. Pada lampu UV 254 nm noda yang
tampak berwarna gelap (ungu) karena yang berflouresensi adalah lempengnya
yang mengandung indikator sedangkan sampelnya tidak. Sedangkan pada
lampu UV 365 nm warna noda yang tampak adalah terang atau tampak jelas
karena lempengnya tidak berflouresensi tetapi sampelnya.
Saat disinari UV 365 nm dan 254 nm, warna noda tampak fluorescent
kuning, kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu. Semua aglikon
menunjukkan fluorescent pada 254 nm dan umumnya kuning atau fluorescent
orange-coklat pada UV 365 nm (Wagner dan Bladt, 1996). Warna kuning
yang tampak menunjukkan senyawa antrakinon yang dalam isomernya yaitu
senyawa antron sedangkan warna kuning kecoklatan yang tampak
menunjukkan adanya senyawa antranol yang juga merupakan isomer dari
senyawa antrakinon
Berdasarkan hasil dari uji KLT diperoleh nilai Rf pada masing – masing
noda yaitu pada sampel diperoleh nilai Rf dan warna noda sebagai berikut :
Rf Warna Noda
1. 0,23 1. Kuning
Sedangkan pada sampel dari uji borntrager diperoleh nilai Rf sebesar 0,5
dengan warna totolan merah keunguan. Dan pada sampel dari uji modifikasi
borntrager diperoleh nilai Rf sebesar 0,5 (warna noda merah keunguan) dan
0,91 (warna noda merah keunguan).
132
1.8 KESIMPULAN
 Pada saat uji borntranger ekstrak tanaman Rheum officinale menimbulkan
adanya perubahan warna dari kuning menjadi merah. Menunjukkan
positif mengandung senyawa antrakinon
 Pada saat uji modifikasi borntranger ekstrak tanaman Rheum officinale
menimbulkan adanya lapisan alkalis berwarna merah muda yang
menunjukkan positif mengandung senyawa antrakinon.
 Pada uji KLT adanya senyawa antrakinon pada ekstrak Rheum officinale
dibuktikan dengan adanya warna kuning, kuning coklat dan merah ungu
pada plat setelah diberi penampak noda dan dapat diperoleh nilai Rf dari
masing – masing noda yang tampak.
133
DAFTAR PUSTAKA
IV.Jakarta : Direktorat Pengawasan Obat dan Makanan
Depkes RI. 2010. Profil Kesehatan Indonesia. Jakarta: Depkes RI.
Depkes RI. 2010. Profil Kesehatan Indonesia. Jakarta: Depkes RI.
Hapsoh dan Hasanah, Y., 2011. Budidaya Tanaman Obat dan Rempah. USU
Press. Medan.
Harborne,J.B. 1987. Metode Fitokimia “Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan”. Terbitan Kedua. Penerbit ITB. Bandung
Heslem, E. (1989). Plant Polyphenol: Vegetal Tannin. Telisted-Chemstry and
Pharmacology of Natural products”. 1 st Edn. Cambridge University
press, Cambridge, Massachusetts. pp 169.
Kartasapoetra, G. 1992. Budidaya Tanaman Berkhasiat Obat. Jakarta: Penerbit
Rineka Cipta.
Kirk, R.E., and Othmer, D.F., 1978, “Encyclopedia of Chemical Technology”,
vol. 1, The Interscience Encyclopedia Inc., New York.
Masduki, I. (1996). Efek antibakteri ekstrak biji pinang (Areca catechu) terhadap
S. aureus dan E. coli. Cermin Dunia Kedokteran.
Nyiredy Sz. 2002. Planar Chromatographic Method Development Using The
Prisma Optimization System and Flow Charts. Jurnal Chromatografi
Scientific.
Sarker, S.D, Latif, Z. and Gray, A, I. 2006. Natural Products Isolation Second
Edition. Humana Press, New Jersey.
Sastroamidjojo, Seno. 2001.Obat Asli Indonesia. Dian rakyat.Jakarta
Stahl, E.. 1985. Analisis Obat Secara kromatografi dan Mikroskopi,
diterjemahkan oleh Kosasih.
Stanitsky, Conrad L. 2003. Chemistry in Context. New York: Mc Graw-Hill.
Wagner, H., and Bladt, S., 2001, Plant Drug Analyses: A Thin Layer
Chromatography Atlas, 2ndEd., 149-191, Springer-Verlag, Berlin.
134
UJI KLT DENGAN BERBAGAI ELUEN
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
135
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu menjelaskan tentang kaitan antara polaritas eluen
dengan harga Rf

1.2.1 Kolesterol
Kolesterol ada dalam diet semua orang, kolesterol merupakan lipid
berwarna kekuningan dan berupa seperti lilin yang diproduksi oleh tubuh
kita, terutama di dalam hati. Kolesterol merupakan zat antara yang
diperlukan dalam biosintesis hormon steroid. Kolesterol memiliki 2 gugus
metil yang terikat pada rantai C-13 dan C-10 dengan 5 ikatan rangkap.
Rantai cabang hidrokarbon terikat pada atom C-17, sedangkan gugus
hidroksil terdapat pada atom C-3. Kolesterol sangat larut dalam lemak
tetapi hanya sedikit larut dalam air. Kolesterol secara spesifik mampu
membentuk ester dengan asam lemak. Hampir 70% kolesterol dalam
lipoprotein plasma memang dalam bentuk ester kolesterol (Guyton, 2007)
Gambar 1 : Struktur molekul kolesterol

Kolesterol adalah salah satu sterol yang penting dan terdapat banyak
di alam. Dari rumus kolesterol dapat dilihat bahwa gugus hidroksil yang
terdapat pada atom nomor 3 mempunyai posisi beta oleh karena
dihubungkan dengan garis penuh. Kolesterol adalah lipida sturktural
(pembentuk struktur sel) yang berfungsi sebagai komponen yang
dibutuhkan dalam kebanyakan sel tubuh. Kolesterol merupakan bahan
yang menyerupai lilin, sekitar 80% dari kolesterol diproduksi oleh liver
dan selebihnya didapat dari makanan yang kaya akan kandungan
kolesterol seperti daging, telur dan produk berbahan dasar susu. Dari segi
136
kesehatan, kolesterol sangat berguna dalam membantu pembentukan
hormon atau vitamin D, membantu pembentukan lapisan pelindung
disekitar sel syaraf, membangun dinding sel, pelarut vitamin (vitamin A,
D, E, K) dan pada anak-anak dibutuhkan untuk mengembangkan jaringan
otaknya (Silalahi, 2006).
Kolesterol adalah metabolit yang mengandung lemak sterol (bahasa
Inggris: waxy steroid) yang ditemukan pada membran sel dan
disirkulasikan dalam plasma darah. Merupakan sejenis lipid yang
merupakan molekul lemak atau yang menyerupainya. Kolesterol ialah
jenis khusus lipid yang disebut steroid. Steroids ialah lipid yang memiliki
struktur kimia khusus. Struktur ini terdiri atas 4 cincin atom karbon.
Kolesterol dapat larut dalam pelarut lemak, misalnya eter, kloroform,
benzena dan alkohol panas. Apabila terdapat dalam konsetrasi tinggi,
kolesterol mengkristal dalam bentuk kristal yang tidak berwarna, tidak
berasa dan tidak berbau dan mempunyai titik lebur 150-151oC.
1.2.2 Biosintesis Kolesterol

Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi 5 tahap, yaitu:
 Sintesis mevalonat dari asetil-KOA.
 Unit isoprenoid dibentuk dari mevalonat melalui pelepasan CO
 Enam unit isoprenoid mengadakan kondensasi untuk membentuk
senyawa antara skualen.
 Skualen mengalami siklisasi untuk menghasilkan senyawa steroid
induk, yaitu lanosterol.
 Kolesterol dibentuk dari lanosterol setelah melewati beberapa tahap
lebih lanjut, termasuk pelepasan tiga gugus metil (Murray, 2003).
Kolesterol diabsorpsi di usus dan ditransport dalam bentuk kilomikron
menuju hati. Dari hati, kolesterol dibawa oleh VLDL untuk membentuk
LDL melalui perantara IDL (Intermediate Density Lipoprotein). LDL akan
membawa kolesterol ke seluruh jaringan perifer sesuai dengan kebutuhan.
Sisa kolesterol di perifer akan berikatan dengan HDL dan dibawa kembali
ke hati agar tidak terjadi penumpukan di jaringan. Kolesterol yang ada di
hati akan diekskresikan menjadi asam empedu yang sebagian dikeluarkan
137
melalui feses, sebagian asam empedu diabsorbsi oleh usus melalui vena
porta hepatik yang disebut dengan siklus enterohepatik.
Adanya kolesterol dapat ditentukan dengan menggunakan beberapa
reaksi warna. Salah satu diantaranya adalah reaksi Salkowski. Apabila
kolesterol dilarutkan dalam kloroform dan larutan ini dituangkan di atas
larutan asam sulfat pekat dengan hati-hati maka bagian asam berwarna
kekuningan dengan flouresensi hijau bila dikenai cahaya. Bagian
kloroform akan berwarna biru dan yang berubah menjadi merah dan ungu.
Larutan kolesterol dalam kloroform bila ditambahan anhidrida asam asetat
dan asam sulfat pekat, maka larutan tersebut mula-mula akan berwarna
merah, kemudian biru dan hijau. Ini disebut reaksi Lieberman Burchard.
Warna hijau yang terjadi ini ternyata sebanding dengan konsentrasi
kolesterol. Karenanya reaksi Lieberman Burchard dapat digunakan untuk
menentukan kolesterol secara kuantitatif.
1.2.3 Konstanta Dielektrik

Konstanta dielektrik merupakan perbandingan energi listrik yang
tersimpan pada bahan tersebut jika diberi sebuah potensial, relatif terhadap
vakum (ruang hampa). Konstanta dielektrik dapat dijadikan pengukur relatif
dari kepolaran suatu pelarut. Polaritas suatu senyawa juga dihubungkan
dengan konstanta dielektriknya ( E) dimana jika nilai E meningkat, maka
kepolaran dari suatu senyawa juga meningkat. Besarnya konstanta
dielektrik, menurut Moore, dapat diatur dengan menambahkan bahan pelarut
lain. Tetapan dielektrik suatu campuran bahan pelarut merupakan hasil
penjumlahan tetapan dielektrik masing-masing sesudah dikalikan dengan %
volume setiap komponen pelarut. Berikut ini adalah kontanta dielektrik
beberapa pelarut.
138
a. Kloroform
Kloroform adalah nama umum untuk triklorometana (CHCl₃).
Kloroform dikenal karena sering digunakan sebagai bahan pembius,
meskipun kebanyakan digunakan sebagai pelarut nonpolar di laboratorium
atau industri. Wujudnya pada suhu ruang berupa cairan, namun mudah
menguap. Pada suhu normal dan tekanan, kloroform adalah cairan yang
sangat mudah menguap, jernih, tidak berwarna, berat, sangat bias, tidak
mudah terbakar.
Sifat Kloroform (Fessenden dkk, 1982).
 Molekul berat : 113,4
 Titik didih : 61,15°C - 61,70°C.
 Melting point : -63,2 sampai -63,5°C pada atm
 Flash point : tidak ada.
 Kepadatan relatif uap (udara = 1): 4,1-4,36 kg/m pada 101 kPa,
0°C.
 Tekanan uap : 21,15 kPa pada 20°C.
 Kelarutan dalam air
Pada 0°C : 10.62g/kg
Pada 10°C : 95g/kg
Pada 20°C : 8.22g/kg .
 Specific gravity : 1,483 pada 20°C
b. n-Heksan
n-heksana adalah senyawa dengan rumus kimia C₆H₁₄ yang
merupakan hidrokarbon yang banyak digunakan sebagai pelarut organik
yang memiliki sifat mudah menguap. "n" pada n-heksana mengandung arti
normal yang artinya rantai hidrokarbonnya lurus atau linier yang dituliskan
CH₃-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₃. n-heksan relatif aman karena tidak
mengiritasi kulit dan tingkat toksisitasnya relatif rendah. Namun, n-
heksana akan mudah terbakar (flammable) jika n-heksana diletakkan di
dekat api karena titik didih n-heksana yang rendah yaitu 69°C (Fessenden
dkk., 1982).
139
Sifat-sifat n-heksana antara lain
 Bobot molekul : 86,18 gr mol-1
 Wujud : Cairan tidak berwarna
 Massa jenis : 0,6548 gr/mL
 Titik leleh :−95°C, 178K, -139°C
 Titik didih : 69°C, 342K, 156°F
 Kelarutan dalam air : 13 mg/L pada 20°C
 Viskositas : 0,294 cP
 Titik nyala : −23,3°C
c. Etil Asetat
Etil asetat adalah senyawa organic dengan rumus
CH₃CH₂OC(O)CH₃. Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam
asetat. Senyawa ini berwujud cairantak berwarna, memiliki aroma khas.
Senyawa ini sering disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan
OAc mewakili asetat. Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai
pelarut. Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatile (mudah
menguap), tidak beracun, dan tidak higroskopis.
Etil asetat merupakan penerima ikatan hydrogen yang lemah, dan
bukan suatu donor ikatan hidrogen karena tidak adanya proton yang
bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif seperti
flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat melarutkan air hingga 3%,
dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar. Kelarutannya
meningkat pada suhu yang lebih tinggi. Namun, senyawa ini tidak stabil
dalam air yang mengandung basa atau asam. Berikut ini adalah
karakteristik atau sifat fisika dan sifat kimia dari etil asetat (Fessenden
dkk, 1982).:
Sifat fisis
 Berat molekul : 88,1 kg/kmol
 Boiling point : 77,1ºC
 Flash point : -4ºC
 Melting point : - 83,6ºC
 Suhu kritis : 250,1ºC
140
 Tekanan kritis : 37,8 atm
 Kekentalan (25ºC) : 0,4303 cP
 Specific grafity (20ºC) : 0,883
 Kelarutan dalam air : 7,7% berat pada 20ºC
 Entalphy pembentukan (25ºC) gas : -442,92 kJ/mol
 Energi Gibbs pembentukan (25ºC) cair : -327,40 kJ/mol
d. Metanol
Metanol juga dikenal sebagai metil alkohol adalah senyawa kimia
dengan rumus kimia (CH₃OH). Ia merupakan bentuk alkohol paling
sederhana. Pada keadaan atmosfer ia berbentuk cairan yang ringan, mudah
menguap, tidak 9 berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau yang
khas (berbau lebih ringan daripada etanol). Metanol digunakan sebagai
bahan pendingin anti beku, pelarut, bahan bakar dan sebagai bahan additif
bagi etanol industry. Sifat Fisik dan Kimia Metanol (Fessenden dkk,
1982).
Sifat fisika Metanol (CH₃OH) :
 Massa molar 32.04 g/mol
 Berwarna bening
 Densitas 0.7918 g/cm³,
 Titik leleh –97°C, -142.9°F (176 K),
 Titik didih 64.7°C, 148.4°F (337.8 K).
 Kelarutan dalam air Fully miscible
 Keasaman (pKa) ~ 15.5
 Viskositas 0.59 mPa·s at 20°C
 Momen dipol 1.69 10
Sifat Kimia Methanol :
 Mudah terbakar,
 Beracun
 Mudah menguap
 Tidak berwarna
 Bau yang khas (berbau lebih ringan daripada etanol)
141
1.2.5 Tinjauan Polaritas
Polaritas sering diartikan sebagai adanya pemisahan kutub bermuatan
positif dan negatif dari suatu molekul sebagai akibat terbentuknya
konfigurasi tertentu dari atom-atom penyusunnya. Dengan demikian,
molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul yang lain yang juga
mempunyai polaritas yang kurang lebih sama. Besarnya polaritas dari
suatu pelarut proporsional dengan besarnya konstanta dielektriknya
(Adnan 1997).
Menurut Stahl (1985), konstanta dielektrik (ε) merupakan salah satu
ukuran kepolaran pelarut yang mengukur kemampuan pelarut untuk
menyaring daya tarik elektrostatik antara isi yang berbeda.
Ekstraksi berkesinambungan dilakukan secara berturut-turut dimulai
dengan pelarut nonpolar (misalnya n-heksan atau kloroform) dilanjutkan
dengan pelarut semipolar (etil asetat atau dietil eter) kemudian dilanjutkan
dengan pelarut polar (metanol atau etanol). Pada proses ekstraksi akan
diperoleh ekstrak awal (crude extract) yang mengandung berturutturut
senyawa nonpolar, semipolar, dan polar (Hostettmann et al., 1997).
142
1.2.6 Kromatografi Secara Umum
Kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase yaitu
fase gerak dan fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase
diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan
partikel-partikel atau terserap(Consden, Gordon dan Martin 1994).
Consden, Gordon dan Martin, memperkenalkan teknik kromatografi
kertas yang menggunakan kertas saring sebagai penunjang fase diam.
Lembaran kertas berperan sebagai penyangga dan air bertindak sebagai
fase diam yang terserap diantara struktur pori kertas (Consden et al.,
1994).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adakah suatu teknik yang sederhana
yang banyak digunakan,metode ini menggunakan lempeng kaca atau
lembaran plastik yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis dan kering
(Barseoni, 2005).
Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan
adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa.
Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan
dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada
polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan
yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen
KLT dipilih dengan cara trial and error.Kepolaran eluen sangat
berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Faktor retensi
(Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang
ditempuh oleh eluen. Rumus faktor retensi adalah:
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen

tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya
perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih
besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.
Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih
143
polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf
yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu
tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan
sebaliknya (Ewing Galen Wood, 1985).
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan
murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikiann juga
peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang
digunakan lebih sederhana dan hampir semua laboratorium melaksanakan
metode ini. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya berupa lapisan
seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh
lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik. Fase diam pada KLT
merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-
30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam, semakin baik
kinerja KLT dalam hal efisien dan resolusinya. Penjerap yang paling
sering digunakan adalah silica dan serbuk selulosa, sementara mekanisme
sorpsi yang utama adalah pada KLT yaitu adsorpsi dan partisi. Untuk
tujuan tertentu, pejerap atau fase diam dapat dimodifikasi dengan cara
pembaceman. Fase gerak dari pustaka dapat ditentukan dengan uji pustaka
atau dengan dicoba-coba karena pengerjaan KLT ini cukup cepat dan
mudah. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik
karena daya elusi campuran ini dapat diatur sedemikian rupa sehingga
pemisahan dapat terjadi dengan optimal. Dalam pembuatan dan pemilihan
fase gerak yang harus diperhatikan yaitu kemurnian dari eluen itu sendiri
karena KLT merupak teknik yang sensitif; daya elusi dari pelarut itu juga
harus diatur sedemikian rupa agar harga Rf berkisar antara 0,2-0,8 yang
menandakan pemisahan yang baik; polaritas dari pelarut juga harus
diperhatikan agar pemisahan terjadi dengan sempurna. Ada 2 cara yang
digunakan untuk menganalisis secara kuantitatif dengan KLT. Pertama,
bercak yang terbentuk diukur langsung pada lempeng dengan
menggunakan ukur luas atau dengan teknik densitometri. Cara kedua yaitu
dengan mengorek bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat
dalam bercak tersebut dengan menimbang hasil korekan.
144
Identifikasi secara kulitatif pada kromatografi kertas khususnya
kromatografi lapis tipis dapat ditentukan dengan menghitung nilai Rf.
Nilai Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa. Harga Rf
didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa titik awal dan
jarak tepi muka pelarut dari titik awal (Ibnu Gholib, 2007).

lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan.
Senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis,
tidak tetap jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi
kertas. Karena itu pada lempeng yang sama disamping kromatogram dari
zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda – beda.
Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan
harga Rf dan ukuran yang lebih kurang sama. Ukuran dan itensitas bercak
dapat digunakan untuk memperkirakan kadar. Penetapan kadar yang lebih
teliti dapat dilakukan dengan cara spektrofotometri. Pada kromatografi
lapis tipis dua dimensi, lempeng yang telah dieluasi diputar 90°C dan
dieluasi lagi, umumnya menggunakan bejana lain yang berisi pelarut lain
(Depkes RI Materia Medika jilid VI)
1.2.8 Faktor yang Mempengaruhi KLT

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang
juga akan mempengaruhi nilai Rf adalah:
a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
b. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan
mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan
145
dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang
besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat
terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang
sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan
jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
c. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi
perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan
menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang
kecil dari plat.
d. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut
digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul
diperhatikan.
e. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
f. Teknik percobaan arah pelarut bergerak di atas plat.
g. Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil
penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek
tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-
kesalahan pada harga-harga Rf.
h. Suhu.
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini
terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut
yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.
i. Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana
jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak
jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi
146
pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis, yaitu :
 Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
 Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
 Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
 Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif sediaan obat.
j. Alat
 Lempeng kaca: tebal seluruh permukaan lempeng kaca sama, umunya
berukuran 20cm x 20cm; sebagai lempeng tapi digunakan lempeng kaca
berukuran 5cm x 20cm.
lempeng tang telah dilapisi zat penyerap pada waktu pengeringan atau
pemindahan. Rak mempunyai ukuran yang cocok sehingga dapat masuk
kedalam lemari pengering. Dapat memuat lebih kurang 10 lempeng
dengan jarak tertentu.
 Zat penyerap. Zat penyerap yang terdiri dari zat penyerap kromatografi
yang halus. Zat penyerap yadapat dilapiskan langsung pada lempeng
kaca atau dengan pertolongan zat perekat, misalnya kalsium sulfat
anhidrat 5% sampai 15% atau kanji. Kalsium sulfat tidak dapat
memberikan permukaan yang keras seperti kanji, tetapi tidak
terpengaruh pereaksi semprot yang bersifat oksidator kuat.
 Alat pembuat lapisan. Berbentuk bak panjang yang dibuat dengan teliti
mempunyai celah memanjang pada dasarnya. Bobot alat sedemikian
rupa, sehingga jika digerakkkan ke atas lempeng kaca, akan
memberikan lapisan zat penyerap pada seluruh permukaan lempeng
147
setebal 0m25 mm. Untuk memperoleh tebal lapisan yang lain,
digunakan alat pembuat lapisan yang dapat diatur.
kaca sebelah menyebelah. Bagian atas bejana terasah halus dan rata dan
dapat ditutup rapat dengan tutup kaca dengan pertolongan lemak
penutup
tempat penutulan dengan jarak tertentu dan untuk membantu memberi
tanda – tanda lain pada lempeng.
dengan panjang gelombang pendek (254 nm) dan dengan panjang
k. Cara kerja
lap bersih. Pada waktu melapiskan zat penyerap, lempeng harus bebas
dari serat atau debu. Atur lempeng kaca di atas baki lempeng, letakkan
lempeng tepi berukuran 5 cm x 20 cm pada ujung dan pangkal baki
148
umumnya 30 g zat penyerap dan 60ml air cukup untuk 5 lempeng
berukuran 20 cm x 20 cm. Pekerjaan melapisi ini harus selesai dalam
waktu 2 menit sejak penambahan air, karena setelah 2 menit campuran
mulai menjadi keras. Geser hati – hati alat pembuat lapisan diatas
lemepng kaca ke arah sisi pendek baki yang berbingkai. Jika telah sampai
pada lempeng tepi terakhir, angkat alat pembuat lapisan. Cuci segera alat
pembuat lapisan. Biarkan lempeng selama 5 menit kemudian pindahkan
lempeng, dengan lapisan menghadap ke atas, pada rak penyimpanan,
keringkan pada suhu 105° selama 30 menit. Setelah lempeng kering,
biarkan dingin hingga suhu kamar dan amati serba ratanta pembagian dan
susunan zat penyerap. Cahaya yang ditransmisikan akan menunjukkan
keserba rataan susunan. Simpan lempeng yang baik dalam eksikator yang
cocok. Kecuali dinyatakn lain pada masing – masing monografi
tempatkan pada sisi bejana kromatografi, 2 helai kertas saring, tinggi
18cm lebar sama dengan panjang bejana.
Masukkan lebih kurang 100 ml pelarut kedalam bejana kromatografi
jarak lebih kurang 1,4 cm larutan zat yang diperiksa dan larutan
dan terletak lebih kurang 2 cm dari tepi bawah lempeng, biarkan kering.
149
l. Fase Diam
Fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa.
Partikel silika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang
akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Pada
kromatografi lapis tipis, sebuah garis digambarkan dibagian atas dan
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna di
tempatkan pada garis yang telah ditentukan. Diberikan penandaan pada
garis dilempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika
dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya
kromatogram di bentuk (Roy, 1991).
Alumina (Al2O3) dan silika gel (SiO2). Alumina lebih polar daripada
silika gel, dan senyawa ini sering dinyatakan lebih aktif daripada silika
gel. Alumina lebih cocok untuk analisis senyawa-senyawa yang nonpolar
atau kurang polar (seperti hidrokarbon, eter, aldehida, keton, dan alkil
halida) karena senyawa-senyawa polar sangat kuat teradsorbsi pada
adsorbent ini. Analisis KLT senyawa-senyawa polar pada alumina
umumnya menghasilkan harga Rf yang rendah dan pemisahan yang
minimal. Sebaliknya silika gel dipilih sebagai adsorbent untuk senyawa-
senyawa polar (asam karbokislat, alkohol, amina) karena senyawa-
senyawa non polar teradsorbsi lemah pada silika gel. Analisis KLT
150
senyawa-senyawa nonpolar pada silika gel umumnya memberikan harga
Rf yang tinggi dan pemisahan yang maksimal (Firdaus, 2011).
m. Fase Gerak
Fase gerak dapat digolongkan menurut ukan kekuatan teradsorbsinya
pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini
yang banyak digunakan adalah jenis adsoberben alumina atau sebuah
lapis tipis silica, Penggolongan ini dikenal sebagai deret elutropik pelarut.
Suatu pelarut yang bersifat larutan relative polar, dapat mengusir pelarut
yang relative tak polar dari ikatannyadengan alumina / silica gel. Fasa
gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen.
n. Nilai Rf
Nilai Rf didefinisikan sebagi perbandingan jarak yang ditempuh oleh
senyawa pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh
oleh pelarut sebagai fase gerak. Semakin besar nilai Rf dari sampel maka
semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut
pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang
berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar
bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi
dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis ( Handayani,
2008)
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa.
Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama dengan nilai Rf
Standart dari senyawa tersebut maka senyawa tersebut dapat dikatakan
memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya
berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang
berbeda. Namun perbedaan perlakuan dalam percobaan kromatografi
lapis tipis juga akan mempengaruhi nilai Rf sampel yang diidentifikasi
(Parmeswaran, 2013). Nilai Rf Standart dari piperin adalah 0,42 + 0,03
(Vyas et all, 2011)
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen
tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya
151
perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih
besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.
Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih
polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf
yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu
tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan
sebaliknya (Ewing Galen Wood, 1985).
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu (Underwood,
1999) :
 Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-
perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat
menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
 Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga
kecepatan aliran.
 Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas
dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari
komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan,
ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi
pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga.
Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
 Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan
ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas
mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan
partisi.
 Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara
volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka
hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap
lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.
o. Polaritas dalam KLT

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering
dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.
Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena
152
daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian
rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal (Gholib, 2007).
Kemampuan suatu analit terikat pada permukaan silika gel dengan
adanya pelarut tertentu dapat dilihat sebagai pengabungan 2 interaksi
yang saling berkompetisi. Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat
berkompetisi dengan analit untuk terikat pada permukaan silika gel.
Dengan demikian, jika pelarut yang sangat polar digunakan, pelarut akan
berinteraksi kuat dengan permukaan silika gel dan hanya menyisakan
sedikit tempat bagi analit untuk terikat pada silika gel. Akibatnya, analit
akan bergerak cepat melewati fasa diam dan keluar dari kolom tanpa
pemisahan. Dengan cara yang sama, gugus polar pada pelarut dapat
berinteraksi kuat dengan gugus polar dalam analit dan mencegah interaksi
analit pada permukaan silika gel. Pengaruh ini juga menyebabkan analit
dengan cepat meninggalkan fasa diam. Kepolaran suatu pelarut yang
dapat digunakan untuk kromatografi dapat dievaluasi dengan
memperhatikan tetapan dielektrik (ε) dan momen dipol (δ) pelarut.
Semakin besar kedua tetapan tersebut, semakin polar pelarut tesebut.
Sebagai tambahan, kemampuan berikatan hidrogen pelarut dengan fasa
diam harus dipertimbangkan (Tim Penyusun, 2010)
153
1.3 PROSEDUR KERJA
a. Larutkan sedikit kolesterol ke dalam kloroform
b. Totolkan pada 4 plat KLT (Kiesel Gel 254)
c. Siapkan 4 macam eluen (fase gerak) yaitu:
n-Heksan-etil asetat (1:1)
n-Heksan-etil asetat (4:1)
Kloroform-metanol (4:1)
Kloroform-etil asetat (4:1)
d. Eluasi 4 plat KLT tersebt dengan eluen yang dibuat
e. Semprot dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat
f. Panaskan 100C sampai timbul noda berwarna merah ungu/ungu
g. Hitung harga Rf pada masing-masing plat KLT
h. Diskusikan, mengapa harga Rf pada masing-masing plat berbeda
154
1.4 BAGAN ALIR
155
1.5 SKEMA KERJA
A
Dilarutkan
dengan
kloroform B
Kolesterol
C
Di totolkan pada
masing-masing plat
KLT
Siapkan 4 macam eluen :

Eluasi 4 plat KLT dengan 1. n-Heksan-etil asetat
eluen yang dibuat (1:1)
Plat A → eluen 1
2. n-Heksan-etil asetat
Plat B → eluen 2
Plat C → eluen 3 (4:1)
Plat D → eluen 4 3. kloroform-metanol
(4:1)
4. kloroform-etil asetat
(4:1)
Semprot tiap plat Dipanaskan 100°C dan diamati
masukkan dalam masing-
dengan penampak noda pada UV 254nm dan 365 nm,
anisaldehid asam sulfat masing fase diam (chamber)
hitung nilai Rf
156
1.6 HASIL PRAKTIKUM
A B C D
Sampel setelah ditotolakn pada plat

KLT dan diamati pada sinar UV 254
nm
A B C D
Sampel setelah ditotolakan pada plat

KLT dan diamti pada sinar UV 365 nm
157
Sampel setelah ditotolkan
A B C D pada plat KLT dan setelah
dieluasi kemudian diamati
pada sinar UV 254nm
A B C D Sampel setelah ditotolkan

pada plat KLT dan setelah
dieluasi kemudian diamati
pada sinar UV 254nm
A B D C
C A B D
Sampel setelah dieluasi kemudian diberi penampak noda anisaldehid

asam asetat yang kemudian dipanaskan, sehingga timbul noda pada
masing – masing plat KLT dan dapat diperoleh nila Rfnya masing -
masing
Keterangan :
Plat A :n-Heksan : etilasetat (1:1)
Plat B : n – Heksan : etilasetat (4:1)
Plat C :Kloroform : methanol (4:1)
Plat D :Kloroform : etiasetat (4:1)
158
1.7 PERHITUNGAN
1.7.1 Perhitungan Konstanta Dieletrik
Konstanta dielektrik ( kd ) : kd pelarut x volume pelarut
volume eluen yang dibuat
1) N-Heksan : etilasetat ( 1 : 1 )
Pada praktikum dibuat sebanyak 20 ml, jadi :
N-Heksan : ½ x 20 ml = 10ml
Etilasetat : ½ x 20ml = 10ml
Konstanta dielektrik : (2 x10 ml) + (6 x10 ml)
20 ml
: 4,0
2) N-Heksan : etilasetat ( 4:1 )
Pada praktikum dibuat sebanyak 20 ml, jadi
N-Heksan : 4/5 x 20ml = 16ml
Etilasetat : 1/5 x 20ml = 4 ml
Konstanta dielektrik : ( 2 x16 ml ) + ( 6 x 4 ml )
20 ml
: 2,8
3) Kloroforn : methanol ( 4 : 1 )
Kloroform : 4/5 x 20ml = 16ml
Methanol : 1/5 x 20ml = 4 ml
Konstanta dielektrik : (4,8 x16 ml) + (33,6 x 4 ml)
20 ml
: 10,56
4) Kloroform : etilasetat ( 4 : 1 )
Kloroform : 4/5 x 20ml = 16ml
Etilasetat : 1/5 x 20ml = 4 ml
Konstanta dielektrik : ( 4,8 x16 ml ) + ( 6 x 4 ml )
20 ml
: 5,04
159
1.7.2 Perhitungan Nilai Rf
1) Plat A
Letak totolan : 6,4 cm
Nilai Rf : 6,4/8 = 0,8
2) Plat B
Nilai Rf : 2,9/8 = 0,36
3) Plat C
Nilai Rf : 7,4/8 = 0,98
4) Plat D
Nilai Rf : 5,1/8 = 0,64
160
1.8 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan pengujian Kromatografi Lapis Tipis
dengan berbagai eluen. Tujuan dilakukan pengujian ini yaitu untuk mengetahui
keterkaitan antara polaritas eluen dengan harga Rf yang dihasilkan. Selain itu
dilakukan pengoptimasian berbagai macam eluen ini bertujuan untuk
menentukan suatu eluen yang dapat memisahkan berbagai senyawa dalam
suatu ekstrak tanaman. Hal ini dikarenakan berbagai senyawa fitokimia
memberikan nilai Rf yang berbeda pada sistem eluen yang berbeda. Variasi
nilai Rf pada fitokimia memberikan petunjuk penting dalam memahami
polaritas senyawa fitokimia serta membantu untuk memilih sistem pelarut yang
sesuai untuk pemisahan senyawa murni dengan menggunakan kromatografi
kolom.
Senyawa yang diuji pada praktikum kali ini yaitu kolesterol. Pada
pengerjaanya, kolesterol dilarutkan terlebih dahulu dengan menggunakan
kloroform sebanyak 20 tetes. Pelarut yang digunakan kloroform karena pelarut
tersebut bersifat non polar sehingga memiliki kemampuan untuk melarutkan
senyawa yang tidak larut dalam air seperti lipid. Kolesterol yang digunakan
dalam praktikum kali ini merupakan lipid sterol, sehingga jika dilarutkan
menggunakan kloroform sampel tersebut dapat larut.
Pada praktikum kali ini digunakan 4 jenis kombinasi eluen yaitu n-heksan :
etil asetat ( 1 : 1 ), n-heksan : etil asetat ( 4 : 1 ), kloroform : methanol ( 4 : 1 )
dan kloroform : etil asetat ( 4 : 1 ). Masing – masing plat yang sudah
ditotolkan dengan sampel kemudian dilakukan eluasi dengan menggunakan
keempat eluen tersebut. Kemudian dapat diamati noda yang muncul setelah
diberikan penampak noda anisladehid asam sulfat dengan pemanasan. Karena
senyawa yang diuji merupakan kolesterol sehingga dapat diketahui adanya
steroid atau terpenoid dalam ekstrak bila timbul warna merah atau ungu.
Pada noda yang diperoleh dari masing – masing plat KLT yang diamati
maka dapat diketahui nilai Rf masing – masing. Dan pada praktikum kali ini
diperoleh nilai Rf yang berbeda – beda antar plat yang dieluasi pada 4
kombinasi eluen yang digunakan. Berdasarkan litelatur, jika pelarut berubah
dari polaritas rendah ( seperti n-heksan ) ke polaritas yang lebih tinggi ( seperti
161
etil asetat ), maka kekuatan eluasi akan meningkat dan akan meningkatka nilai
Rf. Plat yang memiliki nilai Rf tertinggi adalah yang paling polar ( bergerak
cepat ), dan yang memiliki nilai Rf terendah adalah yang paling non polar (
bergerak lambat ).
Suatu senyawa yang mempunyai nilai lipofilitas tinggi berarati mudah larut
dalam lipid atau pelarut non polar, maka akan mempunyai harga Rf yang
rendah sedangkan senyawa yang mempunyai nilai lipofilitas rendah berarti
senyawa tersebut tidak mudah larut dalam lipid atau pelarut non polar, maka
harga Rf-nya bernilai tinggi. Fase gerak yang digunakan dilakukan pemilihan
beberapa campuran fase gerak atau eluen dengan berbagai perbandingan untuk
mendapatkan campuran fase gerak yang optimum (Gunardi dkk., 2009).
Telah disebutkan sebelumnya bahwa polaritas sampel dan laju pergerakan
berbanding terbalik. Semakin tinggi polaritas senyawa, semakin meningkat
ikatannya dengan fase diam yang berupa plat silica gel yang bersifat polar
sehingga mempunyai nilai Rf yang semakin kecil, dan sebaliknya . Sedangakan
jika dilihat dari pengaruh eluen yang digunakan, semakin tinggi polaritas eluen
maka nilai Rf nya juga semakin tinggi. (Serma and Bernard, 2003).
Pada praktikum kali ini dari keempat eluen yang berfungsi sebagai fase
gerak dengan masing – masing eluen terdiri dari kombinasi dengan memilki
nilai konstanta dielektrik yang berbeda- berbeda. Dimana pada eluen 1 terdiri
dari n-heksan : etilasetat ( 1 : 1 ) yang digunakan untuk plat KLT 1 memiliki
konstanta dielektrik sebesar 4.0, sedangkan pada eluen 2 terdiri dari n – heksan
: etilasetat ( 4 : 1 ) yang digunakan untuk plat KLT 2 memiliki konstanta
dielektrik sebesar 2,8. Untuk eluen 3 terdiri dari kloroform : metanol ( 4 : 1 )
yang digunakan untuk plat KLT 3 memiliki konstanta dielektrik sebesar 10,56
dan untuk eluen 4 terdri dari kloroform : etil asetat ( 4 : 1 ) yang digunakan
untuk plat KLT 4 memiliki konstanta dielektrik sebesar 5,04. Jika dilihat nilai
konstanta dielektrik yang dimiliki pada masing – masing eluen dan berdasarkan
lietaltur yang telah dijelaskan sebelumnya maka urutan eluen dari yang polar
ke non polar yaitu eluen 3, 4, 1 dan 2.
Dari hasil percobaan pada 4 eluen yang berbeda didapatkan nilai Rf
tertinggi ialah eluen no 3 yaitu 0,98. Hal ini dikarenakan kepolaran eluen yang
162
digunakan tinggi. Ini dapat dibuktikan dengan nilai konstanta dielektriknya
yang besar. Yaitu konstanta dielektriknya sebesar 10,56. Semakin besar
konstanta dielektrik maka eluen tersebut bersifat polar. Nilai Rf terendah pada
eluen no. 2 yaitu 0,36. Hal ini dikarenakan kepolaran eluen yang rendah. Ini
dapat dibuktikan dengan nilai konstanta dielektriknya yang rendah. Yaitu
konstanta dielektriknya sebesar 2,8. Semakin rendah nilai konstanta dielektrik
maka semakin non polar eluen tersebut.
Fase diam yang digunakan adalah silica gel yang bersifat polar. Sedangkan
kolesterol merupakan senyawa non polar sehingga ikatan antara kolesterol
dengan fase diamnya yang berupa silica gel lemah. Jika eluen yang digunakan
lebih polar daripada suatu komponen sampel, molekul-molekul eluen akan
menggantikan molekul-molekul sampel pada silica gel sehingga harga Rf
tinggi (Underwood, 1988). Dari perhitungan Rf pada praktikum kali ini,
diketahui bahwa kolesterol memiliki nilai Rf yang lebih tinggi pada fase gerak
yang lebih polar dan paling rendah pada fase gerak yang bersifat paling non
polar dimana hal tersebut sesuai dengan teori di atas.
Campuran pelarut dengan polaritas yang bervariasi pada perbandingan yang
berbeda-beda dapat digunakan untuk memisahkan senyawa murni tertentu dari
ekstrak tanaman. Pemilihan sistem pelarut yang sesuai untuk ekstrak tanaman
tertentu hanya dapat dicapai dengan menganalisa nilai Rf senyawa pada sistem
pelarut yang berbeda-beda. Dengan demikian informasi ini dapat membantu
untuk pemilihan sistem pelarut yang sesuai untuk pemisahan senyawa lebih
lanjut dari ekstrak tanaman.
163
1.9 KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan, maka dapat ditarik
kesimpulan bahwa hasil secara teoritis sesuai dengan hasil secara praktis yang
menunjukkan bahwa semakin tinggi polaritas senyawa, semakin tinggi
ikatannya dengan fase diam yang berupa plat silica gel yang bersifat polar
sehingga mempunyai nilai Rf yang semakin kecil, dan sebaliknya.
Sedangakan jika dilihat dari pengaruh eluen yang digunakan, semakin tinggi
polaritas eluen maka nilai Rf nya juga semakin tinggi dan sebaliknya. Serta
nilai Rf senyawa dipengaruhi oleh sifat polar pelarut, fase diam, sampel yang
digunakan dan kondisi percobaan itu sendiri.
164
DAFTAR PUSTAKA
Bernaseoni,G. 2005. Teknologi Kimia. PT Padya Pranita. Jakarta.
Consden, Gordon dan Martin 1994. Kamus Kimia Arti dan Penjelasan Istilah.
Gramedia, Jakarta.
Ewing, Galen Wood. 1985. Instrumental of Chemical Analysis Fifth edition.
McGraw-Hill. Singapore.
Gholib, Ibnu.2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
Gunardi, Ratna Asmah S, Bambang Tri Purwanto, Edy Sulistyowati, Siti
Musinah., Metode RPTLC dan Optimasi Fase Gerak Dalam Penetapan
Harga Rm Sebagai Salah Satu Parameter Lipofilisitas Dalam Rancangan
Obat. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro dan Ikatan
Dokter Indonesia Wilayah Jawa Tengah, 2009; 5(43), 254-259
Stahl, E.. 1985. Analisis Obat Secara kromatografi dan Mikroskopi,
diterjemahkan oleh Kosasih.
Tim Penyusun. 2010. Penuntun Praktikum Kimia Organik Farmasi. Lab. Kimia
Organik FMIPA ITB. Bandung
Underwood, AL dan JR. Day R.A. 1988. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi
Keempat. Jakarta: Erlangga.
Vyas et al., Orient. J. Chem., TLC Densitometric Method for the Estimation of
Piperine in Ayurvedic Formulation Trikatu Churna. Vol. 27(1), 301-304
(2011)
165
FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM
OLEH :
KELAS : FARMASI B

DOSEN PEMBIMBING :
PRODI FARMASI
2018
166
1.1 TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi suatu ekstrak menggunakan
kromatografi kolom

1.2.1 Tanaman Psidium Guajava ( Jambu biji )
Bagian tanaman jambu biji yang berkhasiat sebagai obat tradisional
adalah daun dan buahnya. Daun jambu biji menurut resep obat-obatan
tradisional dapat dimanfaatkan sebagai antiinflamasi, hemostatik dan
adstringensia. Buahnya dapat digunakan sebagai obat disentri dan kecing
manis (Soedibyo, 1998).
Jambu biji atau jambu klutuk mengandung pektin tinggi sehingga
dapat menurunkan kolesterol serta mengandung tanin yang berfungsi
untuk memperlancar sistem pencernaan. Senyawa kimia yang terkandung
di dalam buah jambu salah satunya adalah quersetin, yaitu senyawa
golongan flavonoid jenis flavonol dan flavon, yang berkhasiat diantaranya
untuk mengobati kerapuhan pembuluh kapiler pada manusia (Yuliani,
dkk.2003).
a. Klasifikasi Tanaman
( Gambar tanaman Psidium guajava )

Sistematika dan klasifikasi tanaman jambu biji adalah sebagai berikut:
Subdivisi : Angiosperma
Kelas : Dicotyledona
Bangsa : Myrtales
Suku : Myrtaceae
167
Marga : Psidium
Jenis : Psidium guajava L ( Yulinar, 2011 )
b. Diskripsi Tanaman
Jambu biji merupakan tanaman semak atau perdu, tingginya dapat
mencapai 9 m (Nakasone & Paull 1999). Batang muda berbentuk
segiempat (Popenoe 1974), berwarna hijau atau merah muda, dengan
rambut berwarna keabu-abuan 5 (Rismunandar 1989). Batang tua bulat
dan keras, kulit batang licin berwarna coklat kemerahan dengan
lapisan yang tipis dan mudah terkelupas jika sudah mengering. Bila
kulitnya dikelupas akan terlihat bagian dalam batangnya berwarna
hijau dan berair.
Gambar batang jambu biji

Tanaman jambu biji memiliki kanopi yang pendek,
percabangannya bebas dari bawah ke atas, sering tumbuh tunas liar di
dekat pangkal batang. Tunas tersebut dapat digunakan sebagai bahan
tanam atau bibit. Pertumbuhan tunas tanaman jambu biji bersifat
indeterminan, dan batang/cabang jambu biji dapat tumbuh terus
memanjang yang kadang-kadang dapat menekan pertumbuhan tunas
lateral (Ashari 2006).
Daun jambu biji mengeluarkan aroma jika diremas, berwarna hijau,
mempunyai daun tunggal dan bertangkai pendek. Kedudukan daunnya
dapat bersilangan, letak daunnya berhadapan dan bertulang daun
menyirip. Bentuk daunnya bulat atau bulat telur dengan pinggiran rata
melingkar dan ujung meruncing. Menurut Rismunandar (1989) ada
korelasi antara bentuk daun dengan bentuk buahnya jambu biji yang
berdaun kecil-kecil buahnya pun kecil (jambu kerikil). Jika bentuk
168
daunnya bulat, buahnya pun bulat. Pohon yang daunnya memanjang
dan agak lancip ujungnya, buahnya berbentuk buah pir.
Gambar daun jambu biji

Bunga jambu biji berwarna putih, berbau agak wangi, tumbuh di
ketiak daun atau pada pucuk ranting, tunggal atau dalam kelompok
kecil (Morton 1987). Bunga merupakan bunga sempurna yaitu benang
sari (sekitar 250 helai) dan putik terdapat pada satu bunga. Mahkota
bunga jumlahnya 4-5 (Morton 1987), menurut Sujiprihati (1985)
mahkota bunga jambu biji Bangkok berjumlah 4-10 helai, dengan
bentuk daun mahkota bulat telur.
Gambar bunga jambu biji

Bunga akan mekar penuh pada pagi hari. Waktu yang diperlukan
dari kuncup hingga mekar penuh antara 14-29 hari (Sujiprihati 1985).
Penyerbukan bunga tanaman jambu biji bersifat menyerbuk sendiri
maupun menyerbuk silang (Nakasone & Paull 1999), berlangsung
dengan sendirinya atau dibantu oleh faktor luar yaitu angin, serangga,
dan manusia (Rismunandar 1989). Buah jambu biji memiliki variasi
yang besar baik dalam ukuran buah, bentuk buah, maupun warnanya
(Panhwar 2005). Buah berdompolan, bentuknya globose, bulat telur,
169
lonjong atau berbentuk buah pir, dengan ukuran beragam 6 diameter
sekitar 2,5-10 cm (Nakasone & Paull 1999) bergantung pada sifat
bawaan, umur pohon, kesuburan tanah, dan ketersediaan air
(Rismunandar 1989). Kulit buahnya halus atau tidak rata, berwarna
hijau tua ketika masih muda dan berubah menjadi hijau sampai hijau
kekuning-kuningan setelah masak.
Gambar buah jambu biji

Daging buahnya berwarna putih, kuning, pink atau merah dengan
sel-sel batu sehingga bertekstur kasar, berasa asam sampai manis, dan
beraroma “musky” ketika masak (Soetopo 1992). Daging dalamnya
bertekstur lunak, dan berwarna lebih gelap dan berasa lebih manis
dibanding daging luarnya, secara normal dipenuhi biji-biji yang keras
berwarna kuning (Morton 1987), sekitar 1-2% (Panhwar 2005). Ada
korelasi antara ukuran buah dengan jumlah biji yang dikandungnya,
kisaran biji pada jambu biji Bangkok yaitu 150-750 biji (Sujiprihati
1989).
Biji jambu biji dapat bertahan lama (± 12 bulan) dalam
penyimpanan pada kondisi suhu rendah (8 °C) dalam kelembaban
rendah (Soetopo 1992; Ashari 2006). Buah jambu biji matang 90
sampai 150 hari setelah pembungaan (Morton 1987), menurut
Nakasone & Paull (1999) buah jambu biji matang 120-220 hari setelah
pembungaan bergantung pada temperatur selama perkembangan buah.
Periode pematangan buah buah setelah antesis juga bervariasi pada
setiap varietas. Jambu biji Bangkok memerlukan waktu 5-6 bulan
sejak antesis sampai buah dapat dipanen (Sujiprihati 1985).
170
Gambar biji jambu
c. Morfologi dan Karakterisitik Tanaman
Jambu biji berasal dari Amerika tropik, tumbuh pada tanah yang
gembur maupun liat, pada tempat terbuka, dan mengandung air yang
cukup banyak. Tanaman jambu biji (P. Guajava L.) ditemukan pada
ketinggian 1m sampai 1.200 m dari permukaan laut. Jambu biji
berbunga sepanjang tahun. Perdu atau pohon kecil, tinggi 2 m sampai
10 m, percabangan banyak. Batangnya berkayu, keras, kulit batang
licin, berwarna coklat kehijauan ( Septia, 2010 )
Jambu biji (P. Guajava L.) tersebar meluas sampai ke Asia
Tenggara termasuk Indonesia, sampai Asia Selatan, India dan Sri
Lanka. Jumlah dan jenis tanaman ini cukup banyak, diperkirakan kini
ada sekitar 150 spesies di dunia. Tanaman ini (P. Guajava L.) mudah
dijumpai di seluruh daerah tropis dan subtropis. Seringkali ditanam di
pekarangan rumah. Tanaman ini sangat adaptif dan dapat tumbuh
tanpa pemeliharaan. Di Jawa sering ditanam sebagai tanaman buah,
sangat sering hidup alamiah di tepi hutan dan padang rumput ( Nety,
2008 )
d. Nama Daerah
Setiap daerah di Indonesia memiliki kekhasan dalam penyebutan
nama jambu biji, diantaranya, Sumatra: glima breueh (Aceh), glimeu
beru (Gayo), galiman (Batak Karo), masiambu (Nias), biawas, jambu
biji, batu, jambu klutuk (Melayu). Jawa: jambu klutuk (sunda), jambu
klutuk, petokal, petokal, jambu krikil, jambu krutuk (jawa), jhambu
bhender (Madura). Nusa Tenggara: sotong (Bali), guawa (Flores),
goihawas (Sika). Sulawesi: Gayawas (Manado), boyawat
(Mongondow), koyamas (Tansau), dambu (Gorontalo), jambu
paratugala (Makassar), jambu paratukala (Bugis), jambu (Baree),
Kujabas(Roti), biabuto (Buol). Maluku: kayawase (Seram Barat),
171
kujawase (Seram Selatan), laine hatu, lutuhatu (Ambon), gayawa
(Ternate, Halmahera) ( Septia, 2010 ).
e. Morfologi Tanaman
Daun jambu biji tergolong daun tidak lengkap karena hanya terdiri
dari tangkai (Petiolus) dan helaian (Lamina) saja yang disebut daun
bertangkai. Dilihat dari letak bagian terlebarnya pada daunnya bagian
terlebar daun jambu biji (P. Guajava L.) berada ditengah-tengah dan
memiliki bagian jorong karena perbandingan panjang : lebarnya adalah
1,5 - 2 : 1 (13 - 15 : 5,6 - 6 Cm). Daun jambu biji (P. Guajava L.)
memiliki tulang daun yang menyirip yang mana daun ini memiliki 1
ibu tulang yang berjalan dari pangkal ke ujung dan merupakan terusan
tangkai daun dari ibu tulang ke samping,keluar tulang-tulang cabang,
sehingga susunannya mengingatkan kita pada susunan sirip ikan.
Jambu biji memiliki ujung daun yang tumpul, pada umumnya warna
daun bagian atas tampak lebih hijau jika dibandingkan sisi bawah
daun. Tangkai daun berbentuk selindris dan tidak menebal pada bagian
tangkainya ( Renata, 2012 )
1.2.2 Kandungan Kimia Tanaman
Daun jambu biji memiliki kandungan flavonoid yang sangat tinggi,
terutama quercetin. Senyawa tersebut bermanfaat sebagai antibakteri,
kandungan pada daun Jambu biji lainnya seperti saponin, minyak atsiri,
tanin, anti mutagenic, flavonoid, dan alkaloid ( Anonim, 2013 )
Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon

yang umumnya tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis
flavonoid yang ditemukan dalam buah-buahan, sayuran, daun dan
bijibijian. Hal ini juga dapat digunakan sebagai bahan dalam suplemen,
minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida yang
banyakditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa
buih. Sehingga ketika direaksikan dengan air dan dikocok maka akan
terbentuk buih yang dapat bertahan lama. Minyak atsiri adalah kelompok
besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu ruang namun
mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri
172
merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau minyak gosok (untuk
pengobatan) alami.
Tanin merupakan substansi yang tersebar luas dalam tanaman
dan digunakan sebagai energi dalam proses metabolisme dalam bentuk
oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada buah. Alkaloid adalah
sebuah golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan heterosiklik
dan terdapat didunia tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan senyawa
yang berasal dari hewan).
Daun jambu biji mengandung flavonoid, tanin (17,4%), fenolat
(575,3 mg/g) dan minyak atsiri. Daun jambu biji digunakan sebagai
sumber antioksidan alami, karena di dalam daun jambu biji terkandung
tanin dimana tanin merupakan senyawa polifenol yang berfungsi sebagai
antioksidan. (Sudarsono dkk, 2002)
Sudah sejak lama daun jambu biji merah digunakan untuk
pengobatan secara tradisional dan sudah banyak produk herbal dari
sediaan jambu biji. Daun jambu biji merah mengandung metabolit
sekunder, terdiri dari tanin, polifenolat, flovanoid, menoterpenoid,
siskulterpen, alkaloid, kuinon dan saponin, minyak atsiri (Kurniawati,
2006).
Senyawa seperti phenolic, terpenoid, flavonoid, dan alkaloid
memilki aktivitas juvenil hormone sehingga memiliki pengaruh pada
perkembangan serangga. Saponin termasuk ke dalam senyawa terpenoid.
Aktivitas saponin ini di dalam tubuh serangga adalah mengikat sterol
bebas dalam saluran pencernaan makanan dimana sterol itu sendiri adalah
zat yang berfungsi sebagai prekursor hormon ekdison, sehingga dengan
menurunnya jumlah sterol bebas dalam tubuh serangga akan
mengakibatkan terganggunya proses pergantian kulit (moulting) pada
serangga. Saponin memiliki efek lain menurunkan tegangan permukaan
selaput mukosa traktus digestivus larva sehinga dinding traktus digetivus
larva menjadi korosif (Aminah dkk, 2001).
Flavonoid merupakan senyawa kimia yang memiliki sifat
insektisida. Flavonoid menyerang bagian syaraf pada beberapa organ vital
173
serangga sehingga timbul suatu perlemahan syaraf, seperti pernapasan dan
menimbulkan kematian (Dinata, 2009).
Tanin akan menghambat masuknya zat-zat makanan yang
diperlukan oleh serangga, sehingga kebutuhan nutrisi serangga tidak
terpenuhi. Polifenol akan menghambat masuknya zat-zat makanan yang
diperlukan oleh serangga, sehingga kebutuhan nutrisi serangga tidak
terpenuhi. Alkaloid merupakan senyawa organik detoksikan berfungsi
menetralisir racun di dalam tubuh. Minyak Atsiri adalah senyawa yang
memberikan bau khas tumbuhan. Minyak atsiri hanya ditemukan pada
tumbuhan yang memiliki sel glandula (Dinata, 2009).
1.2.3 Manfaat dari Tanaman
Daun jambu biji ternyata memiliki khasiat tersendiri bagi tubuh
kita, baik untuk kesehatan ataupun untuk obat penyakit tertentu. Dalam
penelitian yang telah dilakukan ternyata daun jambu biji memiliki
kandungan yang banyak bermanfaat bagi tubuh kita. Diantaranya, anti
inflamasi, anti mutagenik, anti mikroba dan analgesik (Setiawan, 2000)
Pada umumnya daun jambu biji (P. Guajava L.) digunakan untuk
pengobatan seperti diare akut dan kronis, perut kembung pada bayi dan
anak, kadar kolesterol darah meninggi, sering buang air kecil, luka,
sariawan, larutan kumur atau sakit gigi dan demam berdarah (Retno, 2013)
Berdasarkan hasil penelitian, telah berhasil diisolasikan suatu zat

flavonoid dari daun jambu biji yang dapat memperlambat penggandaan
(replika) Human Immunodeficiency Virus (HIV) penyebab penyakit AIDS.
Zat ini bekerja dengan cara menghambat pengeluaran enzim reserved
transriptase yang dapat mengubah RNA virus menjadi DNA di dalam
tubuh manusia.
Bagian tanaman jambu biji yang berkhasiat sebagai obat tradisional

adalah daun dan buahnya. Daun jambu biji menurut resep obat-obatan
tradisional dapat dimanfaatkan sebagai antiinflamasi, hemostatik dan
adstringensia. Buahnya dapat digunakan sebagai obat disentri dan kecing
manis (Soedibyo, 1998).
174
Jambu biji atau jambu klutuk mengandung pektin tinggi sehingga
dapat menurunkan kolesterol serta mengandung tanin yang berfungsi
untuk memperlancar sistem pencernaan. Senyawa kimia yang terkandung
di dalam buah jambu salah satunya adalah quersetin, yaitu senyawa
golongan flavonoid jenis flavonol dan flavon, yang berkhasiat diantaranya
untuk mengobati kerapuhan pembuluh kapiler pada manusia (Yuliani,
dkk.2003).
Jambu biji (P. Guajava L.) tersebar meluas sampai ke Asia

Tenggara termasuk Indonesia, sampai Asia Selatan, India dan Sri Lanka.
Jumlah dan jenis tanaman ini cukup banyak, diperkirakan kini ada sekitar
150 spesies di dunia. Tanaman ini (P. Guajava L.) mudah dijumpai di
seluruh daerah tropis dan subtropis. Seringkali ditanam di pekarangan
rumah. Tanaman ini sangat adaptif dan dapat tumbuh tanpa pemeliharaan.
Di Jawa sering ditanam sebagai tanaman buah, sangat sering hidup
alamiah di tepi hutan dan padang rumput ( Nety, 2008 )
1.2.4 Fraksinasi
Fraksinasi merupakan proses pemisahan antara zat cair dengan zat cair.
Fraksinasi dilakukan secara bertingkat berdasarkan tingkat kepolarannya
yaitu dari non polar, semi polar, dan polar. Senyawa yang memiliki sifat non
polar akan larut dalam pelarut non polar, yang semi polar akan larut dalam
pelarut semi polar, dan yang bersifat polar akan larut kedalam pelarut polar
(Harborne 1987). Fraksinasi ini umumnya dilakukan dengan
menggunakan metode corong pisah atau kromatografi kolom. Kromatografi
kolom merupakan salah satu metode pemurnian senyawa dengan
menggunakan kolom (Trifany 2012). Corong pisah merupakan peralatan
laboratorium yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen
dalam campuran antara dua fase pelarut yang memiliki massa jenis berbeda
yang tidak tercampur (Haznawati 2012).
Fraksinasi adalah suatu prosedur pemisahan yang bertujuan untuk
memisahkan kandungan senyawa yang satu dengan yang lainnya. Senyawa
yang bersifat polar terdapat dalam pelarut polar dan senyawa non polar
terdapat dalam pelarut non polar (Harbone, 1987).
175
Fraksinasi adalah proses pemisahan suatu kuantitas tertentu dari
campuran (padat, cair, terlarut, suspensi atau isotop) dibagi dalam beberapa
jumlah kecil (fraksi) komposisi perubahan menurut kelandaian. Pembagian
atau pemisahan ini didasarkan pada bobot dari tiap fraksi, fraksi yang lebih
berat akan berada paling dasar sedang fraksi yang lebih ringan akan berada
diatas. Fraksinasi bertingkat biasanya menggunakan pelarut organik seperti
eter, aseton, benzena, etanol, diklorometana, atau campuran pelarut tersebut.
Asam lemak, asam resin, lilin, tanin, dan zat warna adalah bahan yang
penting dan dapat diekstraksi dengan pelarut organik (Adijuwana dan Nur
1989).
Ekstraksi cair-cair merupakan salah satu metode yang digunakan untuk
fraksinasi. Ekstraksi cair-cair adalah teknik pemisahan komponen kimia
dengan menggunakan pelarut yang tidak campur dimana sebagian
komponen larut pada fase pertama dan sebagian lagi larut pada fase kedua
(Sudjadi, 1986).
Ekstraksi cair-cair terbagi menjadi tiga metode dasar yaitu ekstraksi
bertahap (batch), ekstraksi kontinue, dan ekstraksi counter current. Ekstraksi
bertahap merupakan cara yang paling sederhana yaitu dengan menambahkan
pelarut yang tidak bercampur pada pelarut pertama kemudian dikocok
sehingga terjadi kesetimbangan konsentrasi zat yang akan diekstraksi pada
kedua lapisan pelarut tersebut. Lapisan didiamkan dan selanjutnya
dipisahkan (Khopkar, 1990).
176
Ekstrak yang telah dilarutkan dalam aquades, nantinya akan
dimasukkan ke dalam corong pisah dan dicampur dengan pelarut
berdasarkan tingkat kepolarannya. Setelah itu corong pisah dikocok. Setelah
dikocok, akan terbentuk dua lapisan seperti pada gambar 10. Pelarut yang
memiliki massa jenis lebih tinggi akan berada di lapisan bawah, dan yang
memiliki massa jenis lebih kecil akan berada di lapisan atas. Senyawa yang
terkandung dalam ekstrak nantinya akan terpisah sesuai dengan tingkat
kepolaran pelarut yang digunakan. Senyawaakan tertarik oleh pelarut yang
tingkat kepolarannya sama dengan dengan senyawa tersebut.
1.2.5 Macam – macam proses fraksinasi:
a. Proses Fraksinasi Kering (Winterization)
Fraksinasi kering adalah suatu proses fraksinasi yang didasarkanpada
berat molekul dan komposisi dari suatu material. Proses ini lebih murah
dibandingkan dengan proses yang lain, namun hasil kemurnian
fraksinasinya rendah.
b. Proses Fraksinasi Basah (Wet Fractination)
Fraksinasi basah adalah suatu proses fraksinasi denganmenggunakan
zat pembasah (Wetting Agent) atau disebut jugaproses Hydrophilization
atau detergent proses. Hasil fraksi dari proses ini sama dengan proses
fraksinasi kering.
c. Proses Fraksinasi dengan menggunakan Solvent (pelarut)/Solvent
Fractionation
Ini adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan pelarut.Dimana
pelarut yang digunakan adalah aseton. Proses fraksinasi ini lebih mahal
dibandingkan dengan proses fraksinasi lainnyakarena menggunakan bahan
pelarut.
d. Proses Fraksinasi dengan Pengembunan (FractionalCondentation)
Proses fraksinasi ini merupakan suatu proses fraksinasi yangdidasarkan
pada titik didih dari suatu zat / bahan sehingga dihasilkan suatu produk
dengan kemurnian yang tinggi. Fraksinasi pengembunan ini membutuhkan
biaya yang cukup tinggi namun proses produksi lebih cepat dan
kemurniannya lebih tinggi.
177
1.2.6 Kromatografi
Kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase yaitu
fase gerak dan fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam
terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-
partikel atau terserap(Consden, Gordon dan Martin 1994).
Kromatografi adalah teknik pemisahan dari zat campuranberdasarkan
perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh fase
gerak. Pemisahan ini dilakukan berdasarkan sifat kimia umum dari molekul
seperti:
a) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan).
b) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus
(absorpsi).
c) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap.
serba rata pada lempeng kaca. Elmpeng yang dilapis, dapat dianggap sebagi
“kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan didasarkan pada penyerapan,
pembagian, atau gabungnya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara
oembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis
dengan penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis dengan
penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan. Senyawa polar.
Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis, tidak tetap jika
dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Karena itu
pada lempeng yang sama disamping kromatogram dari zat pembanding
kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda – beda. Perkiraan identifikasi
diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan harga Rf dan ukuran yang
lebih kurang sama. Ukuran dan itensitas bercak dapat digunakan untuk
memperkirakan kadar. Penetapan kadar yang lebih teliti dapat dilakukan
dengan cara spektrofotometri. Pada kromatografi lapis tipis dua dimensi,
lempeng yang telah dieluasi diputar 90° dan dieluasi lagi, umumnya
178
menggunakan bejana lain yang berisi pelarut lain ( Depkes RI Materia
Medika jilid VI )
a. Faktor yang Mempengaruhi KLT
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga
akan mempengaruhi nilai Rf adalah:
1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini
akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat
serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan
perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase
bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang
dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama,
ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga
homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya,
tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan
menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang
kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak
dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila
campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus
betul-betul diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang
digunakan.
6) Teknik percobaan arah pelarut bergerak di atas plat.
7) Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan
hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor
179
dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan
kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8) Suhu
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal
ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi
pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan
fase.
9) Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting
dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer
dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer
dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut
campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut
yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian
tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis, yaitu :
 Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
 Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
 Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
 Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif sediaan
obat.
b. Alat
 Lempeng kaca: tebal seluruh permukaan lempeng kaca sama,
umunya berukuran 20cm x 20cm; sebagai lempeng tapi digunakan
lempeng kaca berukuran 5cm x 20cm.
lempeng tang telah dilapisi zat penyerap pada waktu pengeringan
180
atau pemindahan. Rak mempunyai ukuran yang cocok sehingga
dapat masuk kedalam lemari pengering. Dapat memuat lebih kurang
10 lempeng dengan jarak tertentu.
 Zat penyerap. Zat penyerap yang terdiri dari zat penyerap
 Alat pembuat lapisan. Berbentuk bak panjang yang dibuat dengan
penutup
tempat penutulan dengan jarak tertentu dan untuk membantu
memberi tanda – tanda lain pada lempeng.
181
dengan panjang gelombang pendek ( 254nm ) dan dengan panjang
gelombang panjang ( 366nm ).
c. Cara Kerja
lap bersih. Pada waktu melapiskan zat penyerap, lempeng harus bebas dari
serat atau debu. Atur lempeng kaca di atas baki lempeng, letakkan
berukuran 20cm x 20cm. Pekerjaan melapisi ini harus selesai dalam waktu
2 menit sejak penambahan air, karena setelah 2 menit campuran mulai
menjadi keras. Geser hati – hati alat pembuat lapisan diatas lemepng kaca
ke arah sisi pendek baki yang berbingkai. Jika telah sampai pada lempeng
tepi terakhir, angkat alat pembuat lapisan. Cuci segera alat pembuat
lapisan. Biarkan lempeng selama 5 menit kemudian pindahkan lempeng,
dengan lapisan menghadap ke atas, pada rak penyimpanan, keringkan pada
suhu 105° selama 30 menit. Setelah lempeng kering, biarkan dingin hingga
suhu kamar dan amati serba ratanta pembagian dan susunan zat penyerap.
Cahaya yang ditransmisikan akan menunjukkan keserba rataan susunan.
Simpan lempeng yang baik dalam eksikator yang cocok. Kecuali
dinyatakn lain pada masing – masing monografi tempatkan pada sisi
bejana kromatografi, 2 helai kertas saring, tinggi 18cm lebar sama dengan
panjang bejana.
Masukkan lebih kurang 100ml pelarut kedalam bejana
kromatografi hingga tinggi pelarut 0,5 cm sampai 1 cm, tutup rapat,
182
biarkan sistem mencapai kesimbangan, kertas saring harus basah
seluruhnya. Keempat sisi bejana dapat juga dilapisi dengan kertas saring.
Kertas saring pada dasar bejana harus tercelup kedalam pelarut. Tutulkan
terpisah dengan jarak lebih kurang 1,4cm larutan zat yang diperiksa dan
larutan pembanding, menurut cara yang tertera pada masing – masing
monografi pembanding, menurut cara yang tertera pada masing – masing
monografi dan terletak lebih kurang 2cm dari tepi bawah lempeng,
biarkan kering. Tepi bawah lempeng adalah bagian lempeng yang
terdahulu dilalui alat pembuat lapisan pada waktu melapiskan zat
penyerap. Sablon untuk membantu menentukkan titik tempat penutulan
dan jarak yang harus dilalui pelarut. Tempatkan lempeng pada rak
penyangga, hingga tempat penutulan terletak disebalah bawah, masukkan
rak penyangga ke dalam bejana. Pelarut yang ada didalam bejana harus
mencapai tepi bawah lapisan penyerap, tempat penutulan tidak boleh
terendam. Tutup rapat dengan pertolongan zat lemak penutup, biarkan
hingga pelarut merambat lebih kurang 10cm di atas titik penutulan;
umumnya berlangsung selama 15 menit sampai 1 jam; keluarkan
lempeng.
Keringkan diudara, amati bercak mula – mula dengan sinar
ultraviolet gelombang pendek ( 254 nm ) kemudian dengan sinar
ultraviolet gelombang panjang ( 366 nm ).
d. Fase Diam
Fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa.
Partikel silika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang
akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Pada
kromatografi lapis tipis, sebuah garis digambarkan dibagian atas dan
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna di
183
tempatkan pada garis yang telah ditentukan. Diberikan penandaan pada
garis dilempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika
dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya
kromatogram di bentuk (Roy J. 1991).
Alumina (Al2O3) dan silika gel (SiO2). Alumina lebih polar
daripada silika gel, dan senyawa ini sering dinyatakan lebih aktif
daripada silika gel. Alumina lebih cocok untuk analisis senyawa-senyawa
yang nonpolar atau kurang polar (seperti hidrokarbon, eter, aldehida,
keton, dan alkil halida) karena senyawa-senyawa polar sangat kuat
teradsorbsi pada adsorbent ini. Analisis KLT senyawa-senyawa polar
pada alumina umumnya menghasilkan harga Rf yang rendah dan
pemisahan yang minimal. Sebaliknya silika gel dipilih sebagai adsorbent
untuk senyawa-senyawa polar (asam karbokislat, alkohol, amina) karena
senyawa-senyawa non polar teradsorbsi lemah pada silika gel. Analisis
KLT senyawa-senyawa nonpolar pada silika gel umumnya memberikan
harga Rf yang tinggi dan pemisahan yang maksimal (Firdaus. 2011).
e. Fase Gerak
Fase gerak dapat digolongkan menurut ukan kekuatan
teradsorbsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan
dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsoberben alumina
atau sebuah lapis tipis silica, Penggolongan ini dikenal sebagai deret
elutropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relative polar, dapat
mengusir pelarut yang relative tak polar dari ikatannyadengan alumina /
silica gel. Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan
eluen.
1.2.8 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif.
Metode ini memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang
berupa campuran dengan berat beberapa gram. Alat yang digunakan berupa
pipa gelas yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk
mengendalikan aliran zat cair, ukuran kolom bergantung dari banyaknya zat
yang akan dipindahkan. Secara umum perbandingan panjang dan diameter
184
kolom sekitar 8 : 1, sedangkan daya penyerapannya adalah 25-30 kali berat
bahan yang akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam pemisahan
senyawa-senyawa organic atau konstituen-konstituen yang sukar menguap,
sedangakn untuk pemisahan jenis logam-logam atau senyawa organic yang
jarang dipakai (Iazid, Estien, Kimia Fisika Parameter, 2005).
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif.
Metode ini memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang
berupa campuran dengan berat beberapa gram. Pada prinsipnya
kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada
peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan
pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada sampel dijerap
oleh fase diam yang telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang
terdapat pada kolom, namun apabila dialirkan pelarut secara kontinyu maka
akan terjadi migrasi senyawa dan senyawa tersebut terbawa oleh pelarut
sesuai dengan polaritasnya. Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat konstan. Jika
kecepatan eluasi terlalu kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke
dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin melebar yang akibatnya
pemisahan tidak dapat berlangsung dengan baik. Dan apabila kecepatan
eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang baik dan tidak berdasarkan
tingkat polaritasnya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan
menyebabkan fase diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkan terjadi
cracking. Permukaan adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini
dilakukan untuk menghindari terjadinya cacat yang dapat terjadi selama
proses eluasi berjalan.
Kromatografi Kolom merupakan Metode pemisahan yang di
dasarkan padapemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu
senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya.Seberapa jauh
komponen itu dapat diserap absorben tergantunpada sifat fisika komponen
tersebut.Prinsip kerja kromatografi kolom perbedaan daya serap dari
masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam
sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir
kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat
185
sehingga turun lebihlambat dari senyawa non polarterserap lebih lemah dan
turun lebih cepat. Zat yang diserap dari larutan secara sempurnaoleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa
tekanan udara masing-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan
khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom (Sastrohamidjojo, 2004).
Cara kerja kromatografi kolom adalah komponen tunggal ditahan
pada fasa diam berupa adsorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan,
maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan
kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen
mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama
proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi
kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya,
fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi
dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama.
Fraksi dapat diamati lebih lanjut meggunakan spektroskopi.
Kromatografi kolom atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik
bumi (gravitasi) atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca
yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur
aliran pelarut. Persyaratan penting dalam penggunaan KLT adalah bahwa
zat atau campuran zat yang akan dianalisis harus larut dalam pelarut atau
campuran pelarut. Jenis-jenis kromatografi antara lain :
1) Kromatografi padatan cair (LSC)
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben
yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC)
adalah salah satu bentuk dari LSC. Sebagian besar dari KCKT sekarang ini
dibuat untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari
20μ. Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam
pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk
pemisahan isomer-isomer.
2) Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang
tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam
186
dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Fasa diam (polar atau nonpolar)
dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom.
Kemudian fasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi
partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC). Bentuk kromatografi partisi
ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase
Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling
populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase
normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila
fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
3) Kromatografi penukar ion (IEC)
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase
gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin
berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya
telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin
pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah
digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal
untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk
keduanya kation dan anion.
4) Kromatografi eksklusi
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran
molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan
berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil
dapat masuk dalarn jaringan danditahan dalam fase gerak yang menggenang
(stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat
masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum
disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel.
5) Kromatografi pasangan ion (IPC)
Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT
termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970.
Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill
dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang
187
IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan
penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini
mempunyai dasar yang sama.
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah sebagai berikut:
1. Didasarkan pada absorpsi komponen-komponen campuran dengan
afinitas yang berbeda terhadap permukaan fase diam.
2. Absorban bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan
yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom.
3. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorban akan secara
selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran
partikel
Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan
yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa
larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang
ada pada sampel dijerap oleh fase diam yang telah dibentuk atau biasa
digunakan silica gel yang terdapat pada kolom, namun apabila dialirkan
pelarut secara kontinyu maka akan terjadi migrasi senyawa dan senyawa
tersebut terbawa oleh pelarut sesuai dengan polaritasnya. Kecepatan
eluasi sebaiknya dibuat konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu kecil maka
senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan menyebabkan
pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung
dengan baik. Dan apabila kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan
kurang baik dan tidak berdasarkan tingkat polaritasnya sehingga akan
diperoleh fraksi yang sama dan menyebabkan fase diam cepat menjadi
kering dan dikhawatirkan terjadi cracking. Permukaan adsorben harus
benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya
cacat yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan.
188
1.2.9 Metode Pemisahan Kromatografi Kolom
Pengamatan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara
kering. Cara basah lebih mudah untuk memperoleh packing yang
memberikan pemisahan yang baik. Sedangkan cara kering umunya
dilakukan untuk alumina. Metode tersebut antara lain:
a. Metode Basah
Disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fase diam dan
dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benar-
benar hati-hati supaya tidak ada gelembung udara. Larutan senyawa
organic dipipet bagian atas fase diam kemudian eluen dituangkan pelan-
pelan melewati kolom. Kedalam ujung kolom kromatografi (tempat
keluarnya fase diam) diatas kran diletakkan gelas Wool diatasnya
ditaburkan posir sehingga membentuk lapisan tebal lebih dari 1 cm.
selanjutnya dimasukkan petroleum eter sambil mencoba kecepatan
menetes fase gerak dengan memutar kanan. Di dalam beaker glass dibuat
fase diam dengan petroleum eter. Dengan bantuan batang pengaduk bubur
dimasukkan ke dalam kolom berisi petroleum eter sambil diketuk-ketuk
kemudian butir-butir fase diam akan turun dan tersusun rapi didalam
kolom. Bila kolom yang dengan petroleum eter kran dibuka untuk
menurunkan permukaannya dan petroleum eter yang keluar dapat
digunakan lagi untuk membuat bubur fase diam.
189
b. Metode Kering
Cara kering Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian fase
gerak dimasukkan lapis demi lapis sampil ditekan dengan karet atau alat
penekan lain. Selain ditekan dapat juga dibantu dengan dihisap, sehingga
dihasilkan packing fase diam yang mampat. Diatas fase diam diletakkan
kertas saring dan diatasnya lagi sdapis pasir. Pada posisi keran terbuka
fase gerak dituangkan dan dibiarkan mengalir keluar. Packing kolom
disimpan dengan mempertahankan selapis fase gerak berada diatas
lapisan pasir.
Komponen-komponen tunggal tertahan oleh fasa diam secara
berbeda satu sama lain pada saat mereka bergerak bersama eluen dengan
laju yang berbeda melalui kolom. Di akhir kolom, mereka terelusi satu
per satu. Selama keseluruhan proses kromatografi, eluen dikumpulkan
sesuai fraksi-fraksinya. Fraksi-fraksi dapat dikumpulkan secara otomatis
oleh pengumpul fraksi. Produktivitas kromatografi dapat ditingkatkan
dengan menjalankan beberapa kolom sekaligus. Di sini, diperlukan
pengumpul multi aliran. Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan
masing-masing fraksi dianalisa senyawa terlarutnya, misalnya dengan
kromatografi, absorpsi sinar UV atau fluoresensi. Senyawa berwarna
(atau senyawa berfluoresensi di bawah lampu UV) dapat terlihat di dalam
kolom sebagai pita-pita bergerak.
Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau
beberapa pelarut. Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya
kapiler. Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak hanyalah pelarut
bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen
ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang terdiri
atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam
bagian volume total 100 (Nyiredy 2002).
Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan oleh
Snyder’s berdasarkan kekuatan pelarutnya. Menurut Stahl (1985) eluen atau
fase gerak yang digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2
190
kelompok, yaitu untuk pemisahan senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk
pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, metanol, asam asetat, etanol,
isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, dan n-butano l
sedangkan untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter,
kloroform, benzena, toluena, sikloheksana, dan petroleum eter.
a. Etil Asetat
Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH₃CH₂OC(O)CH₃.
Senyawa ini merupakan ester darietanol dan asam asetat. Senyawa ini
berwujud cairan tak berwarna, memiliki aroma khas. Senyawa ini sering
disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan OAc mewakili asetat.
Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai pelarut. Etil asetat adalah
pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap), tidak beracun, dan
tidak higroskopis. Etil asetat merupakan penerima ikatan hidrogen yang
lemah, dan bukan suatu donor ikatan hydrogen karena tidak adanya proton
yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif
seperti flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat melarutkan air hingga
3%, dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar.
Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih tinggi. Namun demikian,
senyawa ini tidak stabil dalam air yang mengandung basa atau
asam(Anonim,2013).
Sifat fisis
Berat molekul : 88,1 kg/kmol
Boiling point : 77,1ºC
Flash point : -4ºC
Melting point : - 83,6ºC
Suhu kritis : 250,1ºC
Tekanan kritis : 37,8 atm
Kekentalan (25oC) : 0,4303 cP
Specific grafity ( 20ºC) : 0,883
Kelarutan dalam air : 7,7% berat pada 20 oC
Entalphy pembentukan (25ºC) gas : -442,92 kJ/mol
Energi Gibbs pembentukan (25ºC) cair : -327,40 kJ/mol
191
Sifat Kimia
Etil asetat adalah senyawa yang mudah terbakar dan mempunyai
resiko peledakan (eksplosif).
b. n-Heksan
n-heksana adalah senyawa dengan rumus kimia C₆H₁₄ yang merupakan
hidrokarbon yang banyak digunakan sebagai pelarut organik yang memiliki
sifat mudah menguap. "n" pada n-heksana mengandung arti normal yang
artinya rantai hidrokarbonnya lurus atau linier yang dituliskan CH₃-CH₂-
CH₂-CH₂- CH₂-CH₂.. n-heksan relatif aman karena tidak mengiritasi kulit
dan tingkat toksisitasnya relatif rendah. Namun, n-heksana akan mudah
terbakar (flammable) jika n-heksana diletakkan di dekat api karena titik
didih n-heksana yang rendah yaitu 69 °C.
Sifat-sifat n-heksana antara lain
Bobot molekul : 86,18 gr mol-1
Wujud : Cairan tidak berwarna
Massa jenis : 0,6548 gr/mL
Titik leleh : -95 °C, 178 K, -139 °F
Titik didih : 69 °C, 342 K, 156 °F
Kelarutan dalam air : 13 mg/L pada 20°C
1.2.11 Indeks Polaritas
Ada berbagai kondisi KLT yang bertujuan untuk menaikkan
kemampuan teknik kromatografi, salah satunya adalah sistem fasa normal
(normal phase sistems). Sistem fasa normal yaitu penggunaan fasa diam
polar yang dikombinasikan dengan berbagai fasa gerakm non air (non
aqueous mobile phases) . Tipikal fasa diam yang sering dikatakan bersifat
polar antara lain silica gel, alumina dan berbagai material fasa terikat
polar lainnya seperti siano-silika, amino-silika dan diol silika dimana
proses adsorpsi memainkan peranan penting dalamn pemisahan.
Karakter yang diinginkan dalam pemilihan fasa gerak yang kompetitif
untuk KLT antara lain adalah parameter kelarutan (solubility parameter)I,
indeks polaritas (polarity index) dan kekuatannya sebagai solvent (solvent
strength) . Parameter kelarutan menunjukkan kemampuannya untuk
192
berkombinasi dengan beragam pelarut lain. Indeks polaritas menunjukkan
besaran empiris yang digunakan untuk mengukut ketertarikan antar
molekul dalam solute dengan molekul solvent pada parameter kelarutan
solvent yang bersangkutan dalam keadaan murninya. Sementara kekuatan
pelarut dinyatakan sebagai bilangan yang berkisar antara -0,25 sampai
+1,3 yang ditentukan melalui energi adsorpsi oleh molekul solvent pada
solvent yang bersangkutan.
Indeks polaritas pelarut (Sholeh, 2009) :
193
1.3 PROSEDUR KERJA
1. Lakukan optimasi ekstrak dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan
mengganti-ganti eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen
tersebut akan digunakan untuk fraksinasi.
2. Siapkan kurang lebih 83 gram silica gel.
3. Siapkan eluen dari butir (1) sebanyak 300 ml
4. Silika gel dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan
sedikit eluen, kocok selama 15 menit.
5. Campur butir (4) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm
dari atas.
6. Tuangkan ke dalam kolom sampai penuh, tutup dengan aluminium foil,
biarkan semalam.
7. Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan,
kemudian ekstrak ditambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut
dicampur denga silica gel sama banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas
pengaduk sampai homogen dan kering.
8. Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel
9. Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan kedalam
kolom (diatas permukaan silica gel), lalu ditambahkan eluen kira-kira
setinggi 3 cm. eluen dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru
sampai kolom terisi penuh dengan eluen, sementara penetesan tetep
dilakukan. Kecepatan penetesan diatur.
10. Penempungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml.
11. Dilakukan uji KLT untuk setiap kelipatan 10 vial (vial no. 1, 10, 20, 30,
40 dst). Pada uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan
fase gerak pada kromatografi kolom.
12. Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diantaranya dapat
digabung.
13. Bila uji KLT memberikan noda yang berbeda, maka uji KLT dilakukan
pada vial diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no 15
dilakukan uji KLT)
194
14. Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada
analisis dengan KLT
15. Hasil penggabungan berdasarkan kemiripan profil kromatogram,
dianalisis dengan teknik kromatografi lapis tipis dan dihitung rf masing –
masing spot noda
16. Dokumentasikan pada UV 254, UV 365 dan visual
17. Plat KLT ( no.15 ) diderivatisasi dengan pereaksi dragendorf, uap
amonia, anisaldehid-asam sulfat, FeCl3 dan KOH 10%
195
1.4 BAGAN ALIR
Setelah melakukan optimasi eluen dengan cara uji KLT terhadap
ekstrak dengan mengganti-ganti eluen sampai diperoleh pemisahan
yang baik.
Eluen tersebut akan digunakan untuk fraksinasi.

Siapkan ± 83 gram silica gel.

Siapkan eluen dari butir (1) sebanyak 300ml.

Silica gel dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan
sedikit eluen, kocok selama 15 menit

Campurkan butir (4) tersebut tuang ke dalam kolom sampai setinggi 10 cm
dari atas.

Tuang eluen ke dalam kolom sampai penuh, tutup dengan aluminium
foil, biarkan semalam

Timbang ekstrak sebanyak 1 % dari jumlah silica gel yang digunakan.
Kemudian ekstrak di tambahkan sedikit pelarut ( etanol/ methanol) ad larut
dicampur dengan silica gel sama banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas
pengaduk sampai homogen dan kering

Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5cm diatas permukaan silica gel.

Ekstrak yang sudah dikeringkan engan silica gel, dimasukkan kedalam
kolom (diatas permukaan silica gel), lalu ditambah eluen kira-kira setinggi 3
cm. eluen dialirkan/ diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom
terisi penuh dengan eluen, sementara penetesan tetap dilkukan kecepatan
penetesan di atur
196

Penampung eluen siap setiap vial sebanyak 5 ml

Dilakukan uji KLT untuk setian kelipatan 10 ( vial No. 1,10,20,30,40, dst).
Pada uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase erak
pada kromatografi kolom

Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksinasi diataranya
dapat digabung

Bila uji KLT memberikan nod ayng berbeda, maka uji KLT dilakukan pada
vial diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no 15 dilakukan
uji KLT.

Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada
analisis dengan KLT

Hasil penggabungan berdasarkan kemiripan profil kromatografi, dianalisis
dengan teknik kromatografi lapis tipis dan dihitung rf masing-masing spot
noda

Dokumentasi kan pada UV 254, UV 365 dan visual

Plat KLT (no.15) di derivatisasi dengan pereaksi dragendorf, uap ammonia,
anisaldehid asam sulfat, FeCl3 dan KOH 10%
197
1.5 SKEMA KERJA
Siapkan
eluen 300ml
eluen
Siapkan ±83
Masukkan silika gel ke dalam
gram silica gel
erlenmeyer, tambah sedikit
eluen, kocok 15 menit
Tuang campuran
diatas kedalam kolom
eluen
hingga setinggi 10cm
dari atas
Tuang eluen ke dalam kolom

hingga penuh, dan tutup dengan
alumunium foil, biarkan semalam
Timbang
ekstrak 1% Ditambah sedikit
dari silika etanol/metanol
gel ad larut
Dan tambah silica gel
sama banyak, diaduk ad
homogen dan kering
Eluen dialirkan sampai

permukaannya 0,5 cm diatas
permukaan silica gel
Ekstrak yg sudah kering,
dimasukkan di dalam kolom,
lalu ditambah eluen 3 cm. Eluen
diteteskan sambil dituangi eluen
baru sampai kolom terisi penuh
dengan eluen
198
Penampungan eluen setiap
vial sebanyak 5 ml dilakukan uji klt untuk tiap
kelipatan 10 vial (vial
no.1,10,20,30,40,dst)
Penetesan dihentikan bila vial Bila uji KLT memberikan noda

terakhir sudah tidak memberikan sama, fraksinya dapat digabung.
noda pada analisis dengan KLT Bila noda berbeda, maka duji
lagi pada vial diantaranya atau
tengah-tengahnya.
Hasil penggabungan berdasar

kemiripan kromatogram,
dihitung nilai Rfnya dan
dokumentasikan pada UV 254,
UV 365 dan visual
Plat KLT (no.15) di derivatisasi

dengan pereaksi dragendorf, uap
ammonia, anisaldehid asam
sulfat, FeCl3 dan KOH 10%
199
1.6 HASIL PRAKTIKUM
Sampel 1, 10, 20, 30, 40, 50,

Sampel 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, dan
60, dan 70 setelah dilakukan
70 setelah dilakukan eluasi dan
eluasi dan diamati pada sinar
diamati pada sinar UV 365 nm
UV 254 nm
Sampel 5, 15, 25, 35, 45, 55, Sampel 5, 15, 25, 35, 45, 55,
dan 65 sebelum dilakukan dan 65 setelah dilakukan eluasi
eluasi dan diamati pada sinar dan diamati pada sinar UV 254
UV 254 nm nm
200
Sampel 5, 15, 25, 35, 45, 55, dan 65 Sampel 7, 27, 32, 42 dan 52
setelah dilakukan eluasi dan diamati sebelum dilakukan eluasi dan
pada sinar UV 365 nm diamati pada sinar UV 254 nm
Sampel 7, 27, 32, 42 dan 52 Sampel 7, 27, 32, 42 dan 52

setelah dilakukan eluasi dan setelah dilakukan eluasi dan
diamati pada sinar UV 254 nm diamati pada sinar UV 365 nm
201
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
Sampel 1 - 6 sebelum dilakukan Sampel 1 - 6 setelah dilakukan

eluasi dan diamati pada sinar UV eluasi dan diamati pada sinar UV
254 nm 254 nm
1 2 3 5 6 1 2 3 4 5 6
4
Sampel 1 - 6 setelah dilakukan Sampel 1 - 6 setelah dilakukan

eluasi dan diamati pada sinar UV eluasi kemudian diberi penampak
365 nm noda anisaldehid asam sulfat dan
diamati pada sinar UV 365 nm
202
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Sampel 1 - 6 setelah dilakukan eluasi kemudian diberi penampak noda

anisaldehid asam sulfat dan diamati secara visual sehingga dapat
diketahui noda yang tampak pada setiap sampel maka nila Rf pada masing
– masing noda dapat diketahui
Keterangan :
Sampel 1 : Campuran sampel nomor 1 – 6
Sampel 6 : Campuran sampel nomor 52 - 70
203
1.7 PERHITUNGAN
1.7.1 Perhitungan Nilai Rf
a. Totolan pertama ( hasil yang diperoleh dari campuran sampel nomor 1 -
6)
Nilai Rf : 7,1 / 8 = 0,89
b. Totolan kedua ( hasil yang diperoleh dari campuran sampel nomor 7 –
26 )
1) Letak totolan : 7 cm
Nilai Rf : 7/8 = 0,88
2) Letak totolan : 6,2 cm
Nilai Rf : 6,2/8 = 0,78
c. Totolan ketiga ( hasil yang diperoleh dari campuran sampel nomor 27 –
31 )
Nilai Rf : 7,2/8 = 0,9
Nilai Rf : 5,2/8 = 0,65
Nilai Rf : 4,1/8 = 0,51
d. Totolan keempat ( hasil yang diperoleh dari campuran sampel nomor 32
– 42 )
Nilai Rf : 4,2/8 = 0,53
e. Totolan kelima ( hasil yang diperoleh dari campuran sampel nomor 43 –
51 )
Nilai Rf : 3,8/8 = 0,48
Nilai Rf : 3,2/8 = 0,40
204
f. Totolan keenam ( hasil yang diperoleh dari campuran sampel nomor 52 –
70 )
Nilai Rf : 3,3/8 = 0,41
Nomor
Letak totolan Nilai Rf Warna Noda
Sampel
1-6 7,1 cm 0,88 Merah kecoklatan
7 - 26 a. 7 cm a. 0,88 a. Merah kecoklatan

b. 6,2 cm b. 0,78
27 – 32 a. 7,2 cm a. 0,9 a. Violet
b. 5,2 cm b. 0,65 b. Coklat
c. 4,1 cm c. 0,51 c. Coklat
32 – 42 4,2 cm 0,53 Violet
43 – 51 a. 3,8 cm a. 0,48 a. Violet

b. 3,2 cm b. 0,40 b. Hijau
52 - 70 3,3 cm 0,41 Hijau
205
1.8 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk dapat melakukan fraksinasi suatu
ekstrak mengguanakan kormatografi kolom Fraksinansi merupakan suatu
proses pemisahan antara zat cair dengan zat cair. Fraksinasi dilakukan secara
beringkat berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu dari non – polar, semi
polar, dan polar. Fraksinasi umumnya dilakukan dengan menggunakan
corong pisah atau kromatografi kolom. Kromatografi kolom adalah salah satu
metode yang digunakan utnk pemurnia senyawa dari campuran deengan
memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparatif. Pada
praktikum kali ini digunakan ekstrak Psidium guajava. . Dipilih bagian daun
sebagai ekstrak dikarenakan daunnya diketahui mengandung senyawa tanin
9-12%, minyak atsiri, minyak lemak dan asam malat (Depkes, 1989).
Pada praktikum kali ini digunakan metode kromatografi kolom basah,
dimana silika gel tersebut dilarutkan terlebih dahulu kedalam pelarutnya.
Silika gel dimasukkan secara perlahan dan dipastikan tidak ada gelembung
udara yang masuk agar tidak terjadi cracking. Pelarut harus ditambahkan
untuk mencegaha terjadinya kerusakan atau pecahnya kolo karena adanya
gelembung udara. Karena jika suatu silica gel yang dibuat crakcking atau
rusak sehingga tidak dapat digunakan maka proses selanjutnya juga tidak
dapat dilakukan. Pelarutan silika gel menggunakan campuran n-heksan : etil
asetat ( 4 : 1 ). Setelah silika gel dicampur dengan eluennya kemudian
dimasukkan kedalam kolom sedkit demi sedkit sambil kran kolom dibuka.
Silika gel dimasukkan kedalam kolom sampai pada batas kolom yaitu 2 cm
dari atas kolom. Kemudian ditutup dengan aluminium foil, setelah itu kolom
disirkulasi dengan cairan eluen selama 15 menit.
Setelah dilakukan penyiapan fase diam, selanjutnya dilakukan preparasi
sampel. Sampel ditimbang seberat 1% dari berat silika gel. Ekstrak Psidium
guajava ditambahakn dengan etanol sampai tepat larut, setelah itu
dikeringkan dengan silika gel sama banyak. Setelah itu dimasukkan ekstrak
kering tersebut sedikit demi sedikit kedalam kolom dengan merata. Mulut dan
dinding kolom harus dipastikan kering terlebih dahulu sebelum ekstrak
206
dimasukkan. Kemudian dimasukkan eluen sedikit demi sedikit kedalam
kolom sambil dilakukan penampungan tetesan dalam via masing – masing 5
ml sampai didapatkan 70 vial.
Setelah seminggu ekstrak yang tersisa dalam vial dilakukan dengan
pelarutan dengan eluen yang terbuat dari n-heksan : etil aseta ( 4 : 1 ). Bagian
yang dilarutkan hanya membutuhkan sedikit eluen, tidak boleh terlalu banyak
agar noda yang tampat bisa diamati dengan jelas. Jika eluen yang dilarutkan
terlalu banyak maka akan terlalu encer sehingga bisa mempengaruhi proses
penotolan dan pengamatan dimana penotolan akan semakin banyak karena
ekstrak tidak pekat lagi yang nantinya mempengaruhi proses pengamatan UV.
Polaritas suatu pelarut yang digunakan pada kromatografi kolom juga
berpengaruh dalam proses fraksinasi pada kolom, karena haltersebut
berpengaruh pada tingkat kepolaran fraksi yang dihasilkan. Polaritas suatu
eluen dapat mempengaruhi harga Rf suatu noda pada lempeng KLT.
Setelah itu fraksi yang diperoleh dan telah dilarutkan maka dapat mulai
dilakukan penotolan pertama. Kemudian uji fraksi pertama dilakukan pada
vial nomor 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60 dan 70. Fraksi ditotolkan pada plat KLT
dan dieluasi dengan eluen. Setelah dieluasi dilakuakn oengamatn pada UV
365 nm dan 254nm. Tiap setelah eluasi, noda yang tampak diamati dan noda
yang sama berarti akan dikumpulkan menjadi satu fraksi. Sedangkan noda
yang tidak sama diambil angka tengahnya dan diamati, apakah nodanya lebih
mirip kesisi yang satu atau yang lainnya. Begitu seterusnya hingga semua vial
bergabung dalam beberapa fraksi. Dan sekuruh penotolan :
a. Penotolan 1 : 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60 dan 70
b. Penotolan 2 : 5, 15, 25, 35, 45, 55, dan 65
c. Penotolan 3 : 7, 27, 32, 42, dan 52
d. Penotolan 4 : 1-6, 7-26, 27-31, 32-42, 43-51, dan 52-70
Setelah pengumpulan, fraksi yang diperoleh adalah sejumalh 6 fraksi, yaitu :
Nomor Sampel Letak totolan Nilai Rf Warna Noda
1 – 6 (fraksi 1) 7,1 cm 0,88 Merah kecoklatan
7 – 26 (fraksi 2) c. 7 cm c. 0,88 b. Merah kecoklatan
207
d. 6,2 cm d. 0,78
27 – 32 (fraksi 3) d. 7,2 cm d. 0,9 d. Violet
e. 5,2 cm e. 0,65 e. Coklat
f. 4,1 cm f. 0,51 f. Coklat
32 – 42 (fraksi 4) 4,2 cm 0,53 Violet
43 – 51 (fraksi 5) c. 3,8 cm c. 0,48 c. Violet

d. 3,2 cm d. 0,40 d. Hijau
52 – 70 ( fraksi 6) 3,3 cm 0,41 Hijau
Pada praktikum kali ini eluen yag digunakan adalah n-heksan : etil asetat
(4:1). N-heksan memiliki konstanta dielektrik ( kd )2,0 sedangkan etil asetat
mempunyai konstanta dielektrik 6,0, maka tetapan dielektrik pelarut atau
eluen adalah :
= ( %eluen 1 x kd eluen 1 ) + ( %eluen II x kd eluen II )
100
= ( 80% x 2 ) + ( 20% x 6 ) = 2,8
100
Secara teori semakain tinggi konstanta dielektrik semakin tinggi
kepolarannya dam sebaliknya. Hasil tetapan dielektrik tersebut adalah 2,8
yang menunjukkan bahwa eluen tersebut mempunyai nilai konstanta
dielektrik rendah berarti kepolarannyapun rendah yang artinya bahwa eluen
tersebut non polar. Sedangkan untuk fase diamnya yaitu silika gel yang
bersifat polar.
Pemilihan pelarut ekstraksi sangan penting sebagai fase gerak. Jika
terlalu lemahpelarut yang dipilih dari eluting maka akan menahan waktu yang
lebih lama dan volume pelarut yang digunakan sangan besar untuk
mengeluasi senyawa.jika pelarut yang digunakan kuat maka semua senyawa
akan segera dieluasi. Penggunaan kombinasi eluen dapat memberikan nilai Rf
yang berbeda. Nilai Rf memberikan informasi penting utnuk membantu
memilih sistem pelarut yang sesuai untuk pemisahan senyawa murni dengan
menggunakan kromatografi kolom
208
Alasan menggunakan pelarut atau eluen n-heksan : etil asetat. Karena
kombinasi tersebut menghasilkan suatu eluen menarik senyawa yang
memiliki polaritas yang mirip. Pada fase diam digunakan silika gel yang
sifatnya polar, dimana silika gel akan lebih mudah menarik senyawa yang
sifatnya polar. Dengan demikian senyawa polar akan terikat kuat pada silika
gel dan senyawa non polar terikat lemah pada silika gel dan akan terbawa
eluen terlebih dahulu untuk keluar kolom dan senyawa polar akan keluar
terakhir dan membutuhkan waktu yang lama.
Berdasarkan penjelasan mengenai fase diam dan fase gerak yang
digunakan pada praktikum kali ini dan jika dilihat dari fraksi – fraksi yang
diperoleh dimana setiap fraksi memberikan nilai yang berbeda – beda yang
menunjukkan senyawa yang terkandung dalam ekstrak yang diuji berbeda –
beda pula. Dan jika dilihat dari fraksi 1,2,3,4,5, dan 6 bahwa senyawa yang
didapat mulai dari senyawa yang bersifat polar ke senyawa yang bersifat non
polar hal ini ditunjukkan dari nilai Rf yang mulai dari fraksi 1 sempai fraksi
ke 6 memiliki nilai Rf dari terbesar ke nilai Rf yang terkecil. Maka nilai Rf
yang diperoleh menunjukkan kepolaran dari setiap fraksi yang didapat.
Selain dilihat dari nilai Rfnya senyawa yang bermacam – macam yang
terkandung didalam ekstrak yang diuji ditunjukkan pula melalui warna noda
yang tampak setelah diberi penampak noda anisaldehid asam sulfat. Pada
kelompok fraksi yang timbul warna merah kecoklatan diduga terdapat
senyawa kuersetin jika ditambah dengan penampak noda anisaldehida asam
sulfat akan timbul warna merah kecoklatan. Pada kelompok fraksi yang
timbul warna coklat dan noda violet diduga terdapat senyawa terpenoid dan
saponin jika ditambah dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat
209
1.9 KESIMPULAN
1. Hasil fraksinasi dari ekstrak Psidium guajava menggunakan kromatografi
kolom menghasilkan 6 fraksi dengan penotolan yang dilakukan sebanyak 4
kali.
2. Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom didapatkan beberapa fraksi
dimana pemisahan komponen – komponen berdasarkan perbedaan
kepolaran yang tergantung dari jenis senyawa yang terkandung dalam
tumbuhan. Dimana sifat kepolaran ditunjukkan dari nilai Rf dan senyawa
yang terkandung dapat dilihat dari warna noda yang tampak.
210
DAFTAR PUSTAKA
Abdul Rohman dan Ibnu Gholib Gandjar, 2007, Metode Kromatografi Untuk
Analisis Makanan. Yogyakarta : Pustaka Pelajar.
Adijuwana, Nur M.A. 1989.Teknik Spektroskopi dalam Analisis Biologi . Bogor:
Pusat Antar Universitas IPB.
Consden, Gordon dan Martin 1994. Kamus Kimia Arti dan Penjelasan Istilah.
Gramedia, Jakarta.
Dewanti, T.W. 1997. Teknologi Pengolahan Hasil Ternak. Malang: Fakultas
Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya.
Nety Nurazizah, Isolasi dan Identifikasi Jamur Endofit Dari Daun Jambu Biji
(Psidium Guajava L.) sebagai Anti bakteri Dari Bakteri E.Coli dan
Staphylococus Aureus, UIN Malang, Malang, 2008
Renata Ayuni, Khasiat Selangit Daun-Daun Ajaib Tumpas Beragam Penyakit,
Alaska, Yogyakarta, 2012. hlm.130.
Retno AriaNingrum, Pemanfaatan Tumbuhan Jambu biji Sebagai Obat
Tradisional, Universitas Negeri Yogyakarta, Jogjakarta, 2013
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi keenam.
Terjemahan K. Padmawanita. ITB. Bandung;191-192.
Sastrohamidjojo, H. 1991.Kromatografi Edisi ke-1. Penerbit Liberty. Yogyakarta.
Septia Anggraini, Optimasi Formula Fast Disintegrating Tablet Ekstrak Daun
Jambu Biji (Psidium Guajava L.) Dengan Bahan Penghancur Sodium
Starch Glycolate Dan Bahan Pengisi Manitol, Universitas Muhammadiyah
Surakarta, Surakarta, 2010.
Setiawan Dalimartha, Atlas Tumbuhan Obat di Indonesia, Trubus Agriwidya,
Jakarta, 2000, hlm. 73.
Soedibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan, Manfaat dan Kegunaan , Balai
Pustaka, Jakarta
Yulinar Rochmasari, Studi Isolasi Dan Penentuan Struktur Molekul Senyawa
Kimia Dalam Fraksi Netral Daun Jambu Biji Australia (Psidium Guajava
L.), Universitas Indonesia, Depok, 2011, hlm. 3
211
ccxii

Laporan 1 - 7 Kelompok 8

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Laporan 1 - 7 Kelompok 8

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Praktikum Fitokimia

1. Titan Octavia Kurnia Putri 201410410311070

IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ALKALOID

(Ekstrak Piper nigrum L)

1. Titan Octavia Kurnia Putri 201410410311070

1.2 TINJAUAN PUSTAKA

1.2.2 Kandungan Senyawa Tanaman Lada Hitam

1.2.5 Klasifikasi Senyawa Alkaloid

Hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya

Alkaloid mengandung atom nitrogen yang mempunyai pasangan

Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer, diperkirakan nitrogen

Gambar 2. Reaksi Alkolid dengan Reagen Mayer

Hasil positif alkaloid pada uji Wagner ditandai dengan terbentuknya

kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Dragendorff, bismut nitrat

Pada uji alkaloid dengan pereaksi Dragendorff, nitrogen digunakan

Gambar 4 . Reaksi Alkoloid dengan Reagen Dragendorff

Dengan sinar biasa Dengan sinar UV 366 nm

1.3.2 Reaksi Pengendapan

1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak sebanyak 0,9 Ditambah etanol ad Ditambah 5 ml HCl

Filtrat ditambah 5 ml HCl 2N, Setelah dingin, ditambah 0,3

Larutan IA ditambah Adanya alkaloid

Larutan ID Lalu dicek menggunakan Direaksikan

Kemudian siap untuk

Jika timbul warna jingga menunjukan adanya alkaloid dalam ekstrak.

Ekstrak sebanyak 0,9 gram

Ditambah etanol ad tepat larut

Dipanaskan diatas penangas air selama 2-3

Setelah dingin, ditambah 0,3 gram NaCl, diaduk rata

1.5.2 Reaksi Pengendapan

Adanya alkaloid ditunjukan dengan

1.5.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Filtrat diuapkan sampai 1/3 bagian

Kemudian siap untuk pemeriksaan KLT :

Setelah penambahan Setelah eluasi,

Sebelum eluasi, Garis titik noda

IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN GLIKOSIDA SAPONIN,

1. Titan Octavia Kurnia Putri 201410410311070

1.2 TINJAUAN PUSTAKA

Gambar 1 : Buah lerak

Tumbuhan lerak berbentuk pohon dan rata-rata memiliki tinggi 10m

1.2.2Kandungan Senyawa Tanaman

1.2.4 Identifikasi Senyawa Saponin

Gambar 4 : Reaksi Liebermann Burchard pada Steroid

1.2.5 Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis

 Ekstrak sebanyak 0,2 gram dimasukkan tabung reaksi, kemudian

1.3.2 Reaksi Warna

1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis

1.4.2 Reaksi Warna

1 – 2 ml H2SO4 pekat, Timbulnya cincin warna

1.4.3 Kromatografi Lapis Tipis

Dididihkan dan ditutup

Setelah dingin ditambahkan Ammonia sampai basa, kemudian

Diuapkan sampai 0,5 ml Ditotolkan pada plat KLT

b. Identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT

Ekstrak ditambah n-heksan 1-2ml, diaduk sampai larut kemudian

Masukkan 0,2 gram ekstrak kedalam tabung reaksi

Tambahkan aquadest 10 ml lalu dikocok kuat selama 30 detik

1.5.2 Reaksi Warna

Dibagi menjadi 3 bagian (IIA, IIB, IIC) masing-

IIA = sebagai blanko

Warna hijau : Warna merah Kuning muda :

IIA = sebagai blanko