Prosedur Operasi Baku

Uji Apoptosis dengan Annexin V - PI

Intro:
Apoptosis, atau kematian sel terprogram, memainkan sebuah peran fundamental pada banyak proses
biologis normal sebaik pada beberapa penyakit (Wyllie dkk., 1980; Ellis dkk., 1991). Apoptosis dapat
diinduksi oleh berbagai stimulasi yang semuanya menghasilkan hasil akhir yang sama: kematian sel yang
sistematik dan disengaja.
Salah satu metode untuk mempelajari perubahan deteksi apoptosis adalah mendeteksi perubahan pada
posisi Phosphatidyl Serine (PS) pada membran sel. Pada sel non-apoptosis, sebagian besar molekul PS
terlokalisasi pada permukaan dalam dari membran plasma, tapi segera setelah terinduksi apoptosis, PS
mengalami redistribusi pada permukaan luar dari membran plasma, dan menjadi terpapar pada lingkungan
ekstraseluler. PS yang terpapar tersebut dapat dengan mudah terdeteksi dengan annexin V, sebuah
protein 35.8 kDa yang memiliki afinitas kuat pada PS. Spesifisitas dari interaksi annexin V-PS direfleksikan
oleh studi ikatan kompetitif yang mana annexin V mengikat pada sel apoptosis secara spesifik dihambat
oleh liposom PS, tapi tidak berdampak oleh liposom yang mengandung fosfolipid lain (Martin dkk., 1995).
Translokasi PS mendahului peristiwa apoptosis lain, jadi dapat untuk deteksi awal dari apoptosis. Selama
apoptosis, membran sel masih utuh; sedangkan, selama nekrosis, sel menjadi bocor dan kehilangan
integritasnya. Annexin V merupakan sebuah penanda sensitif untuk paparan permukaan sel dari PS untuk
quantifikasi dari apoptosis sel. Propidium iodida (PI) berikatan pada DNA dengan melakukan penambahan
di antara basa dengan sedikit atau tanpa preferensi urutan dan dengan stoikiometri satu pewarna per 4,5
pasang basa DNA. PI adalah senyawa floresens yang bersifat membran impermeant, jadi itu merupakan
sebuah penanda untuk memisahkan antara sel viabel/apoptosis dan nekrosis.
Uji ini sesuai untuk deteksi dari sel awal apoptosis dengan metode Flow Cytometry.

Alat:
1. Tabung Polypropylene 15 ml
2. Micro tube 1.5 ml
3. Mikropipet + tip
4. Centrifuge
5. Well-plate atau flask culture
6. Flow Cytometer (FCM)

Bahan:
1. 0.25% Trypsin-EDTA
2. Medium kultur lengkap (medium + 10%FCS + P/S)
3. Phosphat Buffer Saline (PBS) 1X
4. Larutan stok Annexin V (2.5 mg/ml)
5. Larutan stok Propidium Iodida (2.5 mg/ml)

Cara kerja:
- Preparasi sampel
Sel Adherent
1. Tripsinasi sel pada well-plate atau flask culture dengan 0.25% Trypsin-EDTA
2. Resuspensi pada Medium kultur lengkap & pindahkan pada tabung polypropylene 15 ml
3. Sentrifugasi (2500 rpm, 5 menit, 10 oC), buang supernatan
4. Resuspensi pelet sel pada PBS (1 ml)

Laboratorium Fisiologi, Struktur dan Perkembangan Hewan

Jurusan Biologi
Fakultas MIPA
 Sel Non-Adherent/Suspensi
1. Resuspensi sel pada well-plate pindahkan pada tabung polypropylene 15 ml. Jika sampel dari isolasi
sel primer, resuspensi sel dari larutan isolasi sel & pindahkan pada tabung polypropylene 15 ml
2. Sentrifugasi (2500 rpm, 5 menit, 10 oC), buang supernatan
3. Resuspensi pelet sel pada PBS (1 ml)

- Pewarnaan
1. Ambil 50 µl dari 1 ml larutan sampel & masukkan pada micro tube 1.5 ml yang berisi 500 µl PBS
2. Peletkan sel dengan 2500 rpm, selama 5 menit, pada 10 oC
3. Resuspensi sel pada 50 μl larutan pewarna AnnV-PI
Pada PBS: 1 μl larutan stok Annexin V (2.5 mg/ml)
1 μl larutan stok PI (2.5 mg/ml)
50 μl PBS 1X
4. Inkubasi selama 40 min pada 37 oC
5. Tambahkan 3 ml PBS, peletkan sel (1500 rpm, 5 menit) dan buang supernatan
6. Resuspensi sel pada 500 μl PBS untuk analisis pada FCM

Catatan : Untuk menghindari hilangnya sampel, mungkin tinggalkan ~500 μl dari larutan pewarna terdilusi
tersebut pada pelet untuk meresuspensi sel. Pewarna yang tersisa tidak mengganggu analisis
Flow cytometry.

Pustaka
Ellis, R. E., Yuan, J.Y. & Horvitz, H. R. (1991) Mechanisms and function of cell death. Ann. Rev. Cell Biol.
7:663–698.
Martin, S. J., Reutelingsperger, C. P., McGahon, A. J., Rader, J. A., van Schie, R. C., LaFace, D. M. & Green, D.
R. (1995) Early redistribution of plasma membrane phophatidylserine is a general feature of apoptosis
regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med.
182:1545–1556.
Wyllie, A. H., Kerr, J. F. & Currie, A. R. (1980) Cell death: The significance of apoptosis. Intl. Rev. Cytol.
68:251–306.

Laboratorium Fisiologi, Struktur dan Perkembangan Hewan

Jurusan Biologi
Fakultas MIPA