Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Artikel ini tersedia melaluiBagian ACS COVID-19untuk PENELITIAN yang tidak dibatasi
penggunaan kembali dan analisisnya dalam bentuk apa pun atau dengan cara apa pun dengan
sepengetahuan sumber aslinya. Izin ini diberikan selama Organisasi Kesehatan Dunia (WHO)
mendeklarasikan COVID-19 sebagai pandemi global.

pubs.acs.org/jmc Artikel

Stabilisasi Berbasis Struktur dari Interaksi Protein−Protein Non-asli dari

Protein Nukleokapsid Virus Corona dalam Desain Obat Antiviral

Shan-Meng Lin,○Shih-Chao Lin,○Jia-Ning Hsu,○Chung-ke Chang,○Ching-Ming Chien, Yong-

Sheng Wang, Hung-Yi Wu, U-Ser Jeng, Kylene Kehn-Hall, dan Ming-Hon Hou*

Kutip ini:J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141 Membaca online

MENGAKSES Metrik & Lainnya Rekomendasi Artikel *SSayainformasi pendukung

Lihat https://pubs.acs.org/sharingguidelines untuk opsi tentang cara membagikan artikel yang diterbitkan secara sah.
Diunduh melalui 101.128.98.2 pada 19 November 2023 pukul 14:31:08 (UTC).

ABSTRAK:Stabilisasi interaksi protein-protein (PPI) berbasis struktur adalah strategi yang menjanjikan untuk penemuan obat. Namun,
pendekatan ini terutama berfokus pada stabilisasi PPI asli, dan PPI non-asli kurang mendapat perhatian. Di sini, kami mengidentifikasi
antarmuka interaksi non-asli pada struktur dimerik tiga dimensi dari domain N-terminal protein nukleokapsid MERS-CoV (MERS-CoV N-
NTD). Antarmuka membentuk rongga hidrofobik yang dilestarikan yang cocok untuk skrining obat yang ditargetkan. Dengan
mempertimbangkan komplementaritas hidrofobik selama langkah penyaringan virtual, kami mengidentifikasi 5-benzyloxygramine
sebagai penstabil ortosterik protein N PPI baru yang menunjukkan aktivitas penstabil protein antivirus dan N-NTD. Kristalografi sinar-
X dan hamburan sinar-X sudut kecil menunjukkan bahwa 5-benzyloxygramine menstabilkan dimer N-NTD melalui interaksi hidrofobik
simultan dengan kedua pasangan, menghasilkan oligomerisasi protein N abnormal yang selanjutnya dikonfirmasi di dalam sel.
Pendekatan unik yang didasarkan pada identifikasi dan stabilisasi PPI protein N non-asli ini dapat diterapkan dalam penemuan obat
untuk penyakit CoV.

■ PERKENALAN
Stabilisasi molekul kecil dari interaksi protein-protein (PPI) adalah
antarmuka PPI asli antara dua trimer nukleoprotein yang
bertetangga dalam virus influenza, yang mengakibatkan
strategi yang sangat menjanjikan dalam penemuan obat. Dapat oligomerisasi protein abnormal dan hilangnya viabilitas virus.11
digunakan untuk mengobati kanker dan infeksi virus.1-3 Virus corona sindrom pernapasan Timur Tengah (MERS-CoV) termasuk
Menstabilkan PPI dengan molekul kecil mungkin bersifat alosterik dalam keluarga betacoronavirus (β-CoVs). Penyakit ini menyebabkan
atau langsung (juga disebut ortosterik). Proses ini mengubah gangguan pernapasan yang parah dengan angka kematian yang tinggi
keseimbangan oligomerisasi protein dan memungkinkan molekul pada manusia.12-14Baru-baru ini, virus corona baru yang terkait erat,
kecil memodulasi fungsi fisiologisnya.4-7Obat antikanker paclitaxel, penyakit virus corona 2019 (COVID-19), menyebabkan wabah pneumonia
misalnya, secara alosterik meningkatkan perakitan struktur di Wuhan, yang semakin mempertegas risiko CoV terhadap kesehatan
mikrotubulus dengan mengikat β-tubulin.8,9Di sisi lain, rapamycin,
masyarakat global.15,16Namun, tidak ada
agen antikanker lainnya, berikatan langsung dengan antarmuka
antara FKBP12 dan mTOR dan menstabilkan struktur kompleks.10PPI
yang paling berkarakteristik cocok sebagai target pengembangan Diterima:19 November 2019
obat terbentuk secara alami dalam kondisi fisiologis. Namun, Diterbitkan:27 Februari 2020
interaksi non-asli, yang dapat terbentuk dalam keadaan ekstrim
seperti di dalam kisi kristal, juga merupakan target obat yang
potensial. Misalnya, nukleozin melakukan aktivitas antivirusnya
dengan menstabilkan non-

© 2020 Masyarakat Kimia Amerika https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913

3131 J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat pubs.acs.org/jmc Artikel

Gambar 1.Struktur dan Urutan MERS-CoV N-NTD. (A) Struktur keseluruhan dimer MERS-CoV N-NTD yang mengandung monomer 1 dan 2 digambarkan
sebagai kartun dan masing-masing berwarna kuning dan hijau. Residu yang terlibat dalam dimerisasi ditampilkan sebagai batang dan disorot dalam (B).
(B) Interaksi antar MERS-CoV N-NTD. Dimerisasi terutama dimediasi oleh interaksi residu fusi vektor dengan kawasan hidrofobik yang dilestarikan pada
struktur inti (area pertama) bersama dengan residu di sekitarnya (area kedua). Residu yang berinteraksi pada monomer 1 dan 2 masing-masing diberi
label hitam dan biru. Daerah fusi vektor dan daerah hidrofobik yang dilestarikan masing-masing berwarna cyan dan merah. Warna semua residu yang
berinteraksi adalah sama dengan warna setiap monomer di (A). Kontak kutub ditandai dengan garis putus-putus berwarna merah. (C) Panel atas:
tampilan dekat dari wilayah interaksi residu fusi vektor. Permukaannya diwarnai sesuai dengan tingkat hidrofobisitas pada permukaan protein. Residu
vektorfusi (hitam) ditampilkan sebagai tongkat untuk menekankan kantong hidrofobik. Panel bawah: Diagram 2D interaksi antara kantong hidrofobik
dan residu fusi vektor. Yang terakhir diberi label berwarna hitam. Kontak hidrofobik ditandai dengan garis putus-putus hitam. (D) Penyelarasan urutan
berbagai protein CoV N di wilayah N-terminal. Huruf merah menunjukkan residu yang dilestarikan secara ketat. Cyan menunjukkan situs substitusi yang
konservatif. Daerah hidrofobik yang terlibat dalam dimerisasi yang tidak biasa ditandai dengan segitiga hitam.

pengobatan yang efektif untuk CoV. Oleh karena itu, terdapat kebutuhan
mendesak untuk mengembangkan agen antivirus baru untuk melawan
CoVs.14,17MERS-CoV mengemas genomnya dalam protein nukleokapsid
(N) dan membentuk kompleks ribonukleoprotein (RNP). RNP sangat
penting untuk transkripsi dan perakitan virus. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa modulasi oligomerisasi protein CoV N oleh molekul
kecil merupakan strategi pengembangan obat antivirus yang layak.18,19
Protein CoV N disusun menjadi domain N-terminal (NTD)
dan domain C-terminal (CTD), dengan kedua domain
berpartisipasi dalam pengikatan RNA.20,21Semua struktur
CoV N-NTD dilipat dalam konformasi monomer.
Sebaliknya, CoV N-CTDs selalu dimer dan bertanggung
jawab atas oligomerisasi protein N melalui interaksi
protein−protein.22,23
Di sini, kami melaporkan struktur kristal MERS-CoV N-NTD dalam
konfigurasi dimer non-asli. Kami menggunakan antarmuka dimer non-
asli sebagai target dalam penyaringan virtual untuk penstabil ortosterik.
Untuk tujuan ini, kami mempertimbangkan skor pengikatan dan
komplementaritas hidrofobik dari pose yang diperoleh, dan selanjutnya
memilih lead potensial P1−P3 dari database obat Acros dan ZINC. Dari
jumlah tersebut, hanya 5-benzyloxygramine (P3) yang memiliki aktivitas
antivirus dan penstabil pada protein N. Hamburan sinar-X sudut kecil
(SAXS) dan berbasis sel
pengujian menunjukkan bahwa P3 menginduksi oligomerisasi protein N
full-length yang abnormal secara in vitro dan pada tingkat sel. Kami juga
menjelaskan struktur MERS-CoV N-NTD yang dikomplekskan dengan 5-
benzyloxygramine dan mengungkapkan mekanisme stabilisasinya.
Temuan kami memberikan wawasan tentang pengembangan
pendekatan terapi baru berdasarkan stabilisasi antarmuka interaksi
protein non-asli. Hal ini dapat mengarah pada penemuan dan
pengembangan pengobatan baru untuk berbagai penyakit menular.
■ HASIL
Struktur Domain N-Terminal Protein N MERS-CoV.Kami
menentukan struktur kristal MERS-CoV N-NTD dengan metode
penggantian molekuler (MR) menggunakan struktur HCoV-
OC43 N-NTD (PDB ID: 4J3K) sebagai model pencarian.24Struktur
akhir disempurnakan menjadi nilai faktor R dan bebas R
masing-masing sebesar 0,26 dan 0,29, pada resolusi 2,6 Å (Tabel
S1). Setiap unit asimetris berisi empat molekul N-NTD yang
dirangkai menjadi dua dimer identik dengan RMSD keseluruhan
0,28 Å antar dimer (Gambar S1A,B). Monomer berbagi inti
struktural serupa yang didahului oleh wilayah fleksibel (Gambar
S1D). Inti terdiri dari lembaran β antiparalel beruntai lima yang
diapit di antara loop yang disusun dalam struktur berbentuk
kepalan tangan kanan yang dilestarikan.

3132 https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat
Gambar 2.Senyawa P3 adalah penstabil kuat protein N MERS-CoV. (A) Skema yang menggambarkan alasan yang digunakan dalam merancang penstabil
alosterik penelitian ini. Penstabil ortosterik dapat digunakan untuk mengikat antarmuka interaksi non-asli protein N dan menstabilkan interaksi abnormal
antar protein. (B) Analisis konformasi dan (C) stabilitas dilakukan berdasarkan spektrum FL NTD (1 μM) yang diinkubasi dengan P1−P3 (10 μM) selama 1
jam dengan buffer yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl (pH 8,3) dan 150 mM NaCl.
di antara CoV.25Namun, dalam struktur kami, tidak ada loop yang
menghubungkan untaian β2 dan β3 yang menonjol keluar dari inti
ke protein CoV N lainnya. Berbeda dengan struktur yang dilaporkan
yang memiliki konformasi monomer, struktur kami bersifat dimer
atipikal.
Gambar 1B menunjukkan rincian interaksi dalam dimer
protein MERS-CoV N. Kami menamai satuan tersebut monomer
1 dan monomer 2 (Gambar 1A). Menurut komposisi asam amino
dari situs pengikatan pada monomer 2, kami membagi
antarmuka dimer menjadi dua area: satu terletak di daerah
fleksibel Nterminus dan yang lainnya di loop antara β4 dan β5
dari protein N. Di area pertama, W43, N66, N68, Y102, dan F135
dari monomer 1 menghasilkan kantong hidrofobik yang
dilestarikan yang memungkinkan rantai samping M38 dari
monomer 2 memasuki lubang ini melalui kontak hidrofobik (
Gambar 1CD). H37 dan N39 dari monomer 2 masing-masing
dikemas melawan W43 dan F135 dari monomer 1, dan
berkontribusi terhadap interaksi hidrofobik. Rantai samping
N39 dari monomer 2 membentuk satu ikatan hidrogen dengan
tulang punggung N68 pada monomer 1 pada jarak 2,6 Å.
Daerah kedua relatif lebih hidrofilik. Oksigen rantai utama
G104, F135, dan T137 dari monomer 2 membentuk tiga ikatan
hidrogen dengan rantai samping Q73 dan T134 dari monomer 1
pada jarak masing-masing 3,8, 3,2, dan 3,7 Å. Itu
3133
pubs.acs.org/jmc Artikel
rantai samping N139 pada monomer 2 membentuk ikatan hidrogen
dengan oksigen rantai utama T137 pada monomer 1 pada jarak 3,6
Å. Interaksi area pertama dan kedua terdiri dari area permukaan
terkubur (BSA) sebesar 289 dan 103 Å2, masing-masing. Luas
permukaan kecil yang terkubur di antarmuka bertanggung jawab∼5
kkal mol−1energi pengikat,26yang diterjemahkan menjadi konstanta
disosiasi∼200 mm. Jadi, dimer yang dijelaskan di sini unik karena
bukan asli dan bergantung pada residu fusi vektor (H37 dan M38)
untuk mempertahankan status dimernya. Properti ini juga dapat
menjelaskan mengapa struktur saat ini memiliki status oligomer
yang berbeda dari struktur protein CoV N yang dilaporkan
sebelumnya.24,27-30Kami menggunakan eksperimen ikatan silang
untuk menganalisis kapasitas oligomer MERS N-NTD yang
mengandung residu fusi vektor dalam larutan. MERS N-NTD
memiliki konformasi dimer dalam larutan. Struktur kami
menunjukkan bahwa W43 memainkan peran penting dalam
membentuk kantong hidrofobik yang menampung residu fusi
vektor dan, oleh karena itu, memediasi pembentukan dimer N-NTD.
Mutasi W43A secara signifikan mengurangi kecenderungan
oligomer N-NTD (Gambar S1C). Hal ini semakin mendukung bahwa
“residu eksogen” yang dikodekan oleh tulang punggung vektor
memediasi pembentukan dimer non-asli. Kami juga melapisi
struktur MERS-CoV N-NTD yang diterbitkan sebelumnya (ID PDB:
4ud1)27berisi penduduk asli
https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat
Wilayah fleksibel N-terminal dengan struktur dimer kami. Rantai
samping N38 dalam struktur asli tidak dapat berinteraksi dengan
kantong hidrofobik karena kantong N38 bersifat hidrofilik dan
pendek (Gambar S1E). Dengan demikian, dimungkinkan untuk
memanfaatkan senyawa kecil untuk menggantikan residu fusi
vektor dan menstabilkan PPI melalui interaksi hidrofobik.
Penargetan Langsung Antarmuka Dimer Non-asli untuk Skrining
Antiviral.Kami melakukan penyaringan virtual berbasis struktur dengan
menargetkan W43 di kantong hidrofobik antarmuka dimerik N-NTD. H37
dan M38 dikeluarkan dari cetakan untuk mengidentifikasi senyawa yang
dapat menggantikan residu fusi vektor dan, oleh karena itu,
berkontribusi pada efek stabilisasi (Gambar 2A danS2A,B). Kami memilih
hit dengan skor tertinggi, yang tercantum dalamTabel S2, berdasarkan
bentuk yang saling melengkapi, keberadaan gugus aromatik, dan
kemampuan untuk menumpuk pada W43 dari N-NTD. Karena
pembentukan dimer non-asli terutama dimediasi oleh interaksi
hidrofobik dalam struktur kita (Gambar 1C,D), kami selanjutnya
mempertimbangkan komplementaritas hidrofobik antara ligan yang
diperoleh dan N-NTD dalam bentuk permukaan kecocokan lipofilik (SII).31
Kami juga memperhitungkan kemampuan obat untuk menembus sel
dengan menargetkan area permukaan kutub topologi yang lebih rendah
(TPSA). Berdasarkan kriteria di atas, akhirnya dipilih tiga senyawa untuk
diteliti lebih lanjut. Benzil-2- (hidroksimetil)-1-indolinekarboksilat (P1) dan
5-benzyloxygramine (P3) memiliki konsentrasi yang lebih tinggiSIIdan
skor docking dan TPSA yang lebih rendah. Obat klinis etodolac (P2)
memiliki efek yang sebandingSII
namun skor dockingnya lebih rendah. Itu juga terpilih sebagai
kandidat. Namun, hanya P3 yang menginduksi pergeseran biru
yang relatif lebih besar pada spektrum fluoresensi N-NTD intrinsik,
yang menunjukkan bahwa lingkungan mikro di sekitar triptofan
protein meningkat dalam kekakuan dan hidrofobisitas dengan
adanya P3.32Hasilnya juga menunjukkan bahwa P3 terikat lebih erat
pada protein N dibandingkan P1 atau P2 melalui interaksi dengan
kantong W43 (Gambar 2B). Uji stabilitas termal fluoresen
mengungkapkan bahwa suhu leleh denaturasi N-NTD telah
meningkat dari 42 menjadi 45°C ketika P3 ditambahkan. Kurva leleh
sigmoidal untuk MERS-CoV N-NTD berubah dengan adanya P3.
Keterlambatan denaturasi protein menunjukkan bahwa P3
menstabilkan struktur dimer MERS-CoV N-NTD (Gambar 2C). Kami
kemudian mengukur konsentrasi sitotoksik (CC50) dan konsentrasi
efektif (EC50) untuk setiap senyawa menggunakan sel Vero E6 yang
terinfeksi MERS-CoV.Tabel 1menunjukkan bahwa P3 memiliki indeks
terapeutik yang baik di antara senyawa timbal yang diuji dalam
penelitian ini. Oleh karena itu, P3 merupakan kandidat inhibitor
yang sangat baik terhadap MERS-CoV.
Model Struktur Agregasi Protein MERS-CoV N yang Diinduksi
P3.Kami menggunakan SAXS untuk menilai efek P3 pada
struktur protein MERS-CoV N secara keseluruhan. Fungsi
distribusi jarak yang sesuai dari protein dengan dan tanpa P3
ditunjukkan padaGambar 3A. P3 ditingkatkan secara maksimal
Tabel 1. CC50dan EC50dan Indeks Terapi Senyawa
Timbal
hubungan dosis-respons kuantal (μM)
menggabungkan CCA50 EC 50B TI C (CC50/EC50)
P1 459.69 > 100 TIDAKD
hal2 569.77 > 100 TIDAKD
hal3 805.32 32.1 25.1
ACC50:Setengah konsentrasi
konsentrasi toksisitas
efektif maksimum. maksimal.BEC50: Setengah
CTI: Indeks terapeutik.DNA: Tidak
tersedia.
3134
pubs.acs.org/jmc Artikel
dimensi (Dmaks) dan radius girasi (RG) protein masing-masing dari
207 hingga 230 Å dan dari 58 hingga 65 Å. Dengan demikian,
ukuran protein MERS-CoV N dalam larutan diubah saat berikatan
dengan P3.
Kehadiran beberapa daerah yang secara intrinsik tidak teratur
pada protein N menghalangi penentuan strukturnya dengan
kristalografi sinar-X. Sebagai gantinya, kami menggunakan
pemodelan benda tegar dari data SAXS dengan domain N-terminal
(NTD; diselesaikan dalam penelitian ini) dan domain C-terminal
(CTD, PDB ID: 6G13).23Dengan cara ini, kami memperoleh model
struktural untuk protein N bebas dan kompleksnya dengan P3 (
Gambar 3B,C). Kesesuaian yang sangat baik diperoleh. Model
struktural representatif untuk protein full-length tanpa dan dengan
P3 ditunjukkan pada Gambar 3D,E, masing-masing. Protein N bebas
membentuk tetramer melalui CTD dengan NTD tergantung bebas
dalam larutan (Gambar 3D). Konformasi larutan konsisten dengan
struktur yang dilaporkan sebelumnya untuk protein CoV N lainnya.33
Kompleks N-P3 membentuk hexadecamer kompak dengan
konfigurasi sunburst (Gambar 3E). CTD membentuk cincin pusat dan
dimer NTD non-asli membentuk “paku” yang menonjol dari cincin.
Konsisten dengan agregasi yang diinduksi ligan, kami mengamati
“pergeseran biru” dalam spektrum fluoresensi protein MERS-CoV N
full-length dengan adanya P3 (Gambar 3F). Penambahan P3 juga
menunda denaturasi termal protein N dan mengubah bentuk kurva
denaturasi, lebih lanjut menunjukkan bahwa agregat protein besar
terbentuk dengan adanya P3 (Gambar 3G). Struktur tersebut
menjelaskan bagaimana dimerisasi N-NTD menurunkan viabilitas
MERS-CoV. Protein N mengemas genom virus menjadi kompleks
RNP. Beberapa model perakitan dimer N-CTD telah diusulkan untuk
pembentukan RNP berfilamen.33
Semua antarmuka yang diusulkan antara dimer N-CTD terjadi pada
sisi sisi kubus CTD yang tegak lurus dengan permukaan pengikatan
RNA yang diusulkan (Gambar 3H). Penggunaan kombinatorial pada
wilayah mana pun pada sisi sisi kubus dimer CTD dapat
memfasilitasi manipulasi panjang dan kelengkungan RNP tanpa
menghalangi permukaan pengikatan RNA.28,34
Namun, hasil SAXS menunjukkan bahwa agregasi N-CTD terjadi
pada lantai β-sheet balok CTD. Karena alasan ini, permukaan
pengikatan RNA pada CTD tersumbat oleh CTD yang berdekatan
pada cincin dan oleh dimer NTD non-asli yang melakukan kontak
langsung dengan CTD (Gambar 3Tangan S3). Selain itu, kuboid CTD
dalam agregasi secara alami membentuk oktamer yang tertutup
secara topologi, tanpa meninggalkan ujung terbuka untuk
penambahan kuboid CTD lebih lanjut untuk membentuk RNP
berfilamen panjang. Hilangnya permukaan pengikatan RNA dan
ketidakmampuan untuk menggabungkan molekul protein N lebih
lanjut di luar oktamer dapat menghambat pembentukan RNP. Oleh
karena itu, P3 dapat menghambat pembentukan RNP MERS-CoV
dengan menginduksi agregasi protein N.
P3 Menghambat MERS-CoV dengan Menginduksi Agregasi
Protein N.Kami menunjukkan bahwa P3 memiliki karakteristik
terbaik sebagai kandidat terapi. Untuk menentukan aktivitas
anti-MERS-CoV P3 di dalam sel, efek inkubasi P3 pada titer virus
ekstraseluler dan tingkat RNA virus intraseluler dinilai dengan
uji plak pada sel Vero E6 (Gambar 4A) dan dengan RT-qPCR (
Gambar 4B), masing-masing. Pada 50 μM, P3 sedikit
mempengaruhi titer virus setelah 48 jam tetapi menekan
replikasi RNA virus sebesar 40%. Pada 100 μM, P3
menghentikan produksi dan replikasi virus setelah 48 jam. Hasil
ini membuktikan kapasitas P3 sebagai senyawa antivirus. Kami
kemudian memeriksa distribusi dan ekspresi protein MERS-CoV
N dalam sel yang terinfeksi dengan atau tanpa pengobatan P3
https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat pubs.acs.org/jmc Artikel

Gambar 3.Agregasi abnormal yang diinduksi P3 pada protein MERS-CoV N full-length. (A−E) Analisis SAXS dari protein MERS-CoV N full-length.
(A) Hasil normalisasi dari GNOM menunjukkan distribusi jarak berpasanganP(r)dan jarak maksimum. Jari-jari girasi disesuaikan menjadi 207
dan 230 Å untuk protein N dan kompleks N-P3. “R"mewakili jarak berpasangan. (B, C) Profil hamburan protein N (B) dan kompleks N-P3 (C) dan
normalisasi sesuai dengan GNOM (garis putus-putus). (D, E) Model representatif dari protein N (D) dan kompleks N-P3 (E) yang dihasilkan oleh
simulasi CRYSOL dari data SAXS. Hanya karbon α yang ditampilkan. NTD (kuning), CTD (hijau), dan wilayah kelainan (cyan). (F, G) Analisis
konformasi (F) dan stabilitas (G) berdasarkan spektrum FL protein MERS-CoV N (1 μM) yang diinkubasi dengan P3 (10 μM) selama 1 jam dalam
buffer yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl , 150 mM NaCl (pH 8,3). (H) Skema mekanisme penghambatan P3. Panel kiri: tanpa adanya RNA, protein
N tersusun sebagai bahan penyusun dimer yang disumbangkan oleh dimerisasi N-CTD. Panel tengah: P3 mendorong dimerisasi N-NTD dari
blok penyusun yang berbeda, sehingga jarak antara kuboid CTD diperpendek dan terjadi agregasi protein N. Panel kanan: konformasi
oktamerik dari blok penyusun yang terkubur di permukaan pengikat RNA N-CTD. Ini menghambat pembentukan ribonukleokapsid berfilamen.

3135 https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat pubs.acs.org/jmc Artikel

Gambar 4.Senyawa P3 berpotensi menghambat MERS-CoV. (A, B) Titer virus (A) dan RNA (B) MERS-CoV yang diukur dengan uji plak dan RT-qPCR, masing-
masing, menurun setelah pengobatan P3 selama 48 jam. Tingkat RNA relatif ditentukan dengan membandingkan MERS saja pada setiap titik waktu.
GAPDH RNA adalah kontrol internal. Semua nilai disajikan sebagai mean±SE (kesalahan standar rata-rata). Anova satu arah digunakan untuk statistik (*
hal <0,05, **hal <0,01, ***hal <0,001). (C) Protein nukleokapsid MERS-CoV menurun setelah 48 jam pengobatan P3. Ekspresi protein nukleokapsid (merah)
diperiksa di bawah mikroskop confocal di×680. Inti diberi warna biru dengan DAPI.

untuk mengkonfirmasi temuan SAXS kami. Mikroskopi
imunofluoresensi (Gambar 4C) menunjukkan kondensasi sinyal
fluoresensi protein N intraseluler pada sel Vero E6 yang terinfeksi
yang diobati dengan 50 μM P3. Dengan demikian, P3 dapat
menginduksi agregasi protein N intraseluler. Pada 100 μM, P3
menekan ekspresi protein N di sebagian besar sel. Namun,
beberapa menunjukkan sinyal protein N yang kuat. P3 mungkin
telah menahan protein N MERS-CoV di dalam sel yang terinfeksi
sehingga mendorong pembentukan virion baru yang tidak dapat
dilepaskan. Dengan cara ini, sel-sel di dekatnya tidak dapat
terinfeksi MERS-CoV. Oleh karena itu, data menunjukkan bahwa P3
dapat menghambat MERS-CoV dengan menginduksi agregasi
abnormal protein N di dalam sel. Temuan ini konsisten dengan hasil
pengujian berbasis struktur kami.
Struktur Kristal MERS-CoV N-NTD Dikomplekskan dengan
Senyawa Ampuh.Kami berusaha mendapatkan kristal MERS-
CoV N-NTD dalam kompleks dengan senyawa P1, P2, dan P3
melalui kokristalisasi atau perendaman ligan. Dengan
pengecualian P2, struktur kompleks N-NTD dengan P1 dan
P3 diselesaikan masing-masing pada resolusi 3,09 dan 2,77
Å (Tabel S1). Struktur keseluruhan kompleks ini mirip
dengan apo-MERS-CoV. Kedua kompleks menunjukkan
kepadatan tidak bias yang terdefinisi dengan baik pada
antarmuka dimer dan memungkinkan analisis rinci interaksi
antara senyawa dan MERS-CoV N-NTD (Gambar 5). Interaksi
antara protein N dan masing-masing senyawa dihitung
interaksi terdeteksi antara P1 dan monomer. Terdapat
interaksi π-anion antara cincin benzena dari gugus indolin
P1 dan D143 dari monomer 1. Terdapat juga ikatan
hidrogen donor π antara cincin benzena P1 lainnya dan
rantai samping monomer 2 T137 (Gambar 5B). Sehubungan
dengan P1, P3 terikat lebih dalam ke antarmuka dimer dan
berinteraksi dengan sejumlah besar residu pada kedua
monomer N-NTD. Komposisi asam amino daerah
pengikatan ini adalah W43, N66, N68, S69, T70, N73, dan
F135 pada monomer 1 dan V41, G104, T105, G106, A109,
dan T137 pada monomer 2. Residu ini bersama dengan P3
menghasilkan a kekuatan pendorong hidrofobik yang besar
memungkinkan protein dan ligan saling menempel dan
menstabilkan konformasi dimerik protein N (Gambar 5C).
Beberapa interaksi non-ikatan juga diamati di situs
pengikatan P3. Ini termasuk interaksi antara cincin benzena
P3 dan N68 dari monomer 1 dan A109 dari monomer 2
melalui pasangan elektron bebas dan interaksi π-alkil.
Bagian dimetilaminometil P3 adalah sumber utama interaksi
nonikatan. Tiga interaksi kation π terbentuk antara gugus
ini dan gugus aromatik W43 dan F135 pada monomer 1.
Gugus ini juga membentuk interaksi pasangan elektron
bebas dengan N66 dan interaksi π-sigma dengan W43 pada
monomer 1 (Gambar 5D). Analisis struktural menjelaskan
pengikatan P3 ke N-NTD yang relatif lebih kuat (Gambar 2B)
dan menguatkan efek stabilisasi termal (Gambar 2C) dan
aktivitas antivirus (Tabel 1) dari senyawa tersebut.

dengan Discovery Studio Client (v19.1.0.18287). Sebagian
besar interaksi adalah kontak hidrofobik, yang konsisten
dengan alasan pemilihan kami. Pada kompleks P1, N68,
F135, dan D143 pada monomer 1 dan V41, G106, P107, dan
T137 pada monomer 2 dikemas melawan P1 untuk
membuat dimer (Gambar 5A). Selain itu, dua nonbonding
■
DISKUSI DAN KESIMPULAN
Penggunaan molekul kecil untuk menstabilkan antarmuka PPI telah
terbukti menjadi pendekatan yang layak untuk pengembangan
terapi baru. Kebanyakan senyawa tercipta berdasarkan struktur

3136 https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat pubs.acs.org/jmc Artikel

Gambar 5.Struktur MERS-CoV N-NTD dikomplekskan dengan senyawa kuat. Struktur diselesaikan menggunakan HCoV-OC43 N-NTD (PDB:4J3K) sebagai
model pencarian.24Panel kiri: superimposisi struktural (atas) dari kompleks MERS-CoV N-NTD:P1 (masing-masing monomer 1 dan 2 berwarna ungu dan
merah muda) dan kompleks MERS-CoV N-NTD:P3 (monomer 1 dan 2 berwarna coklat dan hijau, masing-masing) dengan senyawa yang digambarkan
sebagai struktur tongkat. (Bawah) Interaksi yang melibatkan residu fusi vektor dalam dimer non-asli apoprotein ditunjukkan untuk perbandingan dengan
(A) dan (B). Warnanya sama seperti diGambar 1A. Panel kanan: rincian interaksi antara MERS-CoV N-NTD dan P1 (A, B) dan P3 (C, D). Peta Fo−Fc yang
berbeda dibuat konturnya∼2,5σ. (A) Stereoview rinci tentang interaksi di situs pengikatan P1. Warna masing-masing monomer sama seperti pada panel
kiri. Residu yang membentuk kantong pengikat P1 diberi label dan ditunjukkan sebagai batangan. (B) Skema P1 terikat pada MERS-CoV N-NTD. Kontak
hidrofobik antara P1 dan masing-masing monomer ditampilkan sebagai garis putus-putus. Interaksi non-ikatan ditunjukkan dengan panah sian. (C)
Stereoview rinci tentang interaksi di situs pengikatan P3. Warna masing-masing monomer sama seperti pada panel kiri. Residu yang termasuk dalam
kantong pengikat P3 diberi label dan ditampilkan sebagai batangan. (D) Skema P3 yang terikat pada MERS-CoV N-NTD. Kontak hidrofobik antara P3 dan
masing-masing monomer ditampilkan sebagai garis putus-putus. Interaksi non-ikatan ditunjukkan dengan panah merah.

desain untuk memanipulasi PPI bergantung pada pengetahuan
terperinci tentang antarmuka interaksi asli.35-37Sebaliknya, sebagian
besar senyawa dengan potensi terapeutik yang menstabilkan antarmuka
PPI non-asli ditemukan secara kebetulan.38Nukleozin senyawa
antiinfluenza awalnya ditemukan menggunakan pendekatan genetika
kimia, dan kemampuannya untuk menstabilkan oligomer nukleoprotein
non-asli dijelaskan kemudian.39,40
Swinholide A, makrolida laut sitotoksik, telah diketahui mengganggu
sitoskeleton aktin dan bertindak sebagai agen antikanker, tetapi
butuh sepuluh tahun untuk menemukan bahwa ia menstabilkan G-
aktin sebagai kompleks homodimer non-asli.41-43Namun, contoh-
contoh ini menggarisbawahi pentingnya hidrofobisitas sebagai
faktor penting yang menstabilkan hubungan protein-protein dan
protein-ligan.44Di sini, kami menunjukkan kemungkinan
menggunakan interaksi hidrofobik pada antarmuka non-asli sebagai
target penyaringan virtual. Dikombinasikan dengan kriteria seleksi
yang sesuai yang berfokus pada bentuk dan komplementaritas
hidrofobik antara ligan dan reseptor, senyawa molekul kecil yang
menstabilkan PPI non-asli dapat diidentifikasi dengan cara yang
rasional. Dengan menggunakan pendekatan di atas, kami berhasil
mengidentifikasi senyawa P3 yang memengaruhi aktivitas biokimia
protein target kami dan menunjukkan kemanjuran melawan
patogen target kami MERS-CoV (Gambar 2Dan4). Dimerisasi MERS-
CoV N-NTD non-asli yang dimediasi P3 menginduksi N
agregasi protein dengan mempengaruhi perilaku oligomer N-CTD
dan akhirnya menghentikan fungsinya dalam pembentukan RNP.
Sejauh pengetahuan kami, strategi berbasis struktur untuk
menargetkan antarmuka non-asli belum pernah diusulkan untuk
desain terapeutik. Dengan demikian, antarmuka interaksi non-asli
dalam protein dapat terdiri dari kelas target pengembangan obat
baru. Untuk virus β-corona seperti MERS-CoV, asam amino yang
membentuk antarmuka interaksi non-asli pada N-NTD relatif kekal.
Kantong hidrofobik yang mengelilingi W43 dan F135 pada monomer
1 juga dimiliki oleh β-virus corona lainnya.24,28Permukaan yang
berinteraksi pada monomer 2, yang meliputi G104, T105, G106, dan
A109, juga sangat kekal (Gambar S4). Konservasi ini dapat
memberikan keuntungan tertentu ketika mengembangkan senyawa
dengan aktivitas spektrum luas terhadap kelompok patogen target,
termasuk COVID-19. Ketika kami menguji P3 pada virus hepatitis
tikus (MHV), kami mengamati penurunan titer virus, yang
menunjukkan bahwa P3 juga dapat menghambat replikasi MHV (
Gambar S5). Di sisi lain, menargetkan antarmuka interaksi non-
pribumi bukanlah hal yang sepele. Karena pembentukan antarmuka
disebabkan oleh agen eksternal, perhitungan yang bertujuan untuk
memprediksi struktur PPI asli mungkin tidak dapat mengidentifikasi
potensi antarmuka non-asli. Namun demikian, beberapa strategi
dapat membantu dalam mengidentifikasi potensi antarmuka
interaksi non-asli. Salah satu strateginya adalah dengan

3137 https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat
mencari struktur protein target dengan kontak pengepakan kristal yang
diketahui tidak relevan secara biologis. Pendekatan lain adalah dengan
mengidentifikasi situs-situs yang berinteraksi secara lemah melalui gangguan
pergeseran kimia NMR dan pertukaran hidrogen-deuterium MS.45
Setelah potensi antarmuka interaksi non-asli ini diidentifikasi,
penyaringan standar dan kemudian karakterisasi fungsional
dapat dilakukan untuk senyawa kecil yang berikatan dengan
antarmuka.
Singkatnya, kami menunjukkan bahwa antarmuka interaksi non-asli
mungkin terbentuk ketika protein mengalami oligomerisasi yang tidak normal.
Dengan menggunakan protein N MERS-CoV sebagai contoh, kami
menunjukkan bahwa antarmuka non-asli mungkin berfungsi sebagai target
untuk penyaringan berbasis molekul kecil dan berbasis struktur. Kami juga
mengusulkan beberapa strategi untuk mengidentifikasi potensi target
antarmuka non-asli secara rasional untuk penyaringan. Kami yakin bahwa
kami telah menemukan dan menguji paradigma penemuan obat alternatif
yang dapat membantu memperluas daftar senyawa timbal dalam melawan
berbagai patogen.
■
BAGIAN EKSPERIMENTAL
Bahan kimia.Senyawa P1, P2, dan P3 masing-masing dibeli dari
Maybridge Chemical Company, TCI Chemicals, dan Sigma-Aldrich
Corporation. Reagen yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kemurnian semua senyawa
lebih tinggi dari 95% dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Kloning, Ekspresi Protein, dan Pemurnian.Protein MERS-CoV N dibuat
sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya.46Singkatnya,
fragmen cDNA dari protein MERS-CoV N diklon ke dalam vektor ekspresi
pET-28a (Merck, Darmstadt, Jerman) yang mengandung rangkaian
pengkodean tag histidin. Vektor yang mengkode mutan tunggal N39A,
N39G, dan W43A dihasilkan menggunakanPerubahan Cepatprotokol
mutagenesis terarah situs dengan primer yang tercantum dalamTabel S3
. Vektor diubah menjadi Escherichia colisel pLysS BL21 (DE3). Sel-sel
ditumbuhkan hingga kisaran kepadatan optik 0,6−0,8 pada 600 nm pada
37°Ekspresi C dan protein diinduksi dengan 1,0 mM isopropil β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG), dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 10°
C selama 24 jam. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi (6000G,12 menit, 4°
C) dan diresuspensi dalam buffer lisis (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 15
mM imidazol, dan 1 mM PMSF; pH 7,5). Sel-sel tersebut dilisiskan dengan
sonikasi dan disentrifugasi (10.000G,40 menit, 4°C) untuk menghilangkan
kotoran. Supernatan dimurnikan dengan injeksi ke dalam kolom Ni−NTA
(Merck, Darmstadt, Jerman) dan dielusi dengan buffer yang mengandung
imidazol pada kisaran gradien 15−300 mM. Fraksi protein murni
dikumpulkan, didialisis dengan buffer rendah garam, dipekatkan, dan
diukur dengan metode Bradford (BioShop Canada Inc., Burlington, ON,
Kanada).
Kristalisasi dan Pengumpulan Data.Kristal MERS-CoV N-NTD
ditanam seperti yang dijelaskan sebelumnya:46MERS-CoV N-NTD
dikristalisasi pada suhu kamar (∼25°C) dengan metode difusi uap
duduk-tetes. Larutan protein (2 μL; 10 mg mL−1) dicampur dengan
larutan kristalisasi volume yang sama yang terdiri dari 75 mM
amonium sulfat, 2 mM NaBr, dan 29% PEG 3350 (Sigma-Aldrich
Corp., St. Louis, MO) dan diseimbangkan dengan larutan 300 μL. Ko-
kristal MERS-CoV N-NTD:P3 diperoleh dengan menggunakan larutan
kristalisasi yang mengandung 2 mM P3. Kristal MERS-CoV N-NTD
dalam kompleks dengan P1 diperoleh dengan merendam kristal
MERS-CoV N-NTD asli selama 90 detik pada suhu kamar dalam
larutan kristalisasi yang mengandung 2 mM P1. Kumpulan data
difraksi untuk MERS-CoV N-NTD saja dan dalam kompleks dengan
P1 dikumpulkan pada beamline 13B1 dari Taiwan Light Source (TLS)
dari National Synchrotron Research Center (NSRRC; Kota Hsinchu,
Taiwan). Difraksi kompleks MERS-CoV N-NTD:P3 dilakukan pada
beamline SP44XU SPring-8 (Hyogo, Jepang).
Penentuan dan Penyempurnaan Struktural.Data difraksi diproses
dan diskalakan dengan perangkat lunak HKL-2000. Strukturnya
3138
pubs.acs.org/jmc Artikel
diselesaikan dengan penggantian molekuler (MR) di Phenix47
menggunakan HCoV-OC43 N-NTD (PDB:4J3K) sebagai model pencarian.24
Model awal dibangun kembali dan disempurnakan oleh Coot48dan
Phenix. Struktur divisualisasikan menggunakan PyMOL (The PyMOL
Molecular Graphics System, versi 2.3.0).49
Uji Cross-Link Kimia.Larutan protein yang mengandung 40 μM
MERS-CoV N-NTD tipe liar atau termutasi diinkubasi dengan
glutaraldehid pada konsentrasi akhir 1% v/v. Reaksi dilakukan pada
suhu kamar selama 10 menit dan didinginkan dengan penambahan
1 M Tris-HCl (pH 7,5). Sampel kemudian disimpan dalam es dan
dianalisis dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-
poliakrilamida (SDS-PAGE).
Penemuan Penstabil PPI Ortosterik untuk Protein MERS N. Untuk
menyaring senyawa yang menginduksi PPI hidrofobik antara MERS
N-NTD, model MERS-CoV N-NTD dimerik tanpa residu H37 dan M38
digunakan dalam skrining obat virtual. Basis data obat Sigma-
Aldrich, Acros Organics, dan ZINC disaring dengan perangkat lunak
docking molekuler LIBDOCK untuk mendapatkan senyawa yang
bekerja pada protein N. Kantong pengikat protein N diwakili oleh
satu set bola. Setiap senyawa dalam database dimasukkan ke dalam
saku yang berisi W43. Komplementaritas hidrofobik antara ligan dan
reseptor dihitung dengan PLATI-NUM.31Senyawa dengan skor
docking lebih tinggi tercantum dalamTabel S2.
Pengukuran Fluoresensi.Uji fluoresensi dilakukan dalam
buffer yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl (pH 8,3) dan 150 mM
NaCl. Satu protein N mikromolar diinkubasi dengan buffer
kontrol atau setiap senyawa (10 μM) pada suhu 4°C selama 1
jam. Fluoresensi triptofan diperoleh dengan spektrometer
fluoresensi Jasco FP-8300 (JASCO International Co. Ltd., Tokyo,
Jepang) pada panjang gelombang eksitasi 280 nm dan rentang
panjang gelombang emisi 300−400 nm.
Pengukuran Termostabilitas.Uji termostabilitas dilakukan
dalam buffer yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) dan 150
mM NaCl dan dengan spektrometer fluoresensi JASCO FP-8300
(JASCO International Co. Ltd., Tokyo, Jepang). Satu protein N
mikromolar diinkubasi dengan buffer kontrol atau setiap
senyawa (10 μM) pada suhu 4°C selama 2 jam. Profil serapan UV
vs suhu diperoleh dengan menaikkan suhu dari 4−95°C pada 1°
C mnt−1dan mencatat serapan pada 280 nm setiap 0,5 menit.
Menentukan CC50dan EC50dari Hit Compound.Sel Vero E6
terinfeksi MERS-CoV dengan MOI = 0,1 dan diobati dengan senyawa
timbal selama 48 jam. Viabilitas sel ditentukan dengan uji serapan
merah netral. CC50dan EC50ditentukan oleh% viabilitas sel. CC50
ditentukan untuk sel yang diobati dengan obat saja. EC50ditentukan
untuk sel yang terinfeksi MERS setelah perawatan obat.
Eksperimen Hamburan Sinar-X Sudut Kecil (SAXS).Eksperimen SAXS
dilakukan pada garis pancaran BL23A SAXS di TLS NSRRC, menggunakan
sinar sinar-X monokromatik (λ = 0,828 Å), dengan sistem HPLC
terintegrasi dari kolom Agilent-Bio SEC-3 300 Å (Agilent Technologies,
Inc. .Santa Clara, CA). Sampel protein (kompleks 44 μM MERS-CoV N dan
MERS-CoV N:P3 dibuat dengan menginkubasi 44 μM protein asli dengan
440 μM P3) disiapkan dalam buffer yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl (pH
8,5) dan 150 mM NaCl di atas es selama 1 jam. Kemudian, 100 μL alikuot
disuntikkan ke dalam kolom dengan laju alir 0,02 mL min-−1. Setelah
melewati kolom, larutan sampel diarahkan ke kapiler kuarsa (diameter 2
mm) untuk buffer selanjutnya dan pengukuran sampel SAXS pada 288 K.
Jarak sampel ke detektor 2,5 m yang digunakan mencakup vektor
hamburan.Qkisaran 0,01−0,20 Å−1. Di Sini,Qdidefinisikan sebagaiq = (4π/
λ) sin θ, dengan sudut hamburan 2θ. Tiga puluh enam frame
dikumpulkan untuk setiap elusi sampel dengan waktu pemaparan frame
sinar-X 30 detik. Kerangka data yang baik yang tumpang tindih (yaitu,
efek kerusakan radiasi rendah) digabungkan untuk meningkatkan
statistik data dan dianalisis untuk menentukan data awal.RG
menggunakan PRIMUS (versi 3.1). ItuP(r)distribusi jarak danDmaks
dihitung dari kurva hamburan eksperimental menggunakan GNOM (versi
4.1). Analisis metode optimasi ansambel (EOM) dilakukan melalui
antarmuka web EMBL Hamburg.50Pemodelan struktur kristal benda
tegar dihitung dan dihasilkan menggunakan CRYSOL (ATSAS Program
Suite v. 2.8.2).51Itu
https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat
struktur kristal MERS-CoV NTD (PDB ID: 4UD1)27dan MERS-CoV NTD:P3
(diselesaikan dalam penelitian ini) dan domain CTD dari protein MERS-
CoV N (PDB ID: 6G13)23digunakan sebagai benda tegar dalam analisis
EOM. Dengan analisis EOM, 1000 model dihasilkan pada awalnya sebagai
kumpulan struktural. Dipilih dari profil SAXS dari kumpulan struktural
adalah kumpulan model yang dapat menyesuaikan kurva hamburan
eksperimental dengan kombinasi liniernya. Konformasi Tetramerik
MERS-CoV NP dan konformasi 16-mer MERS-CoV:P3 dipilih karena kurva
yang dihasilkan ansambelnya paling sesuai dengan hasil eksperimen
SAXS.
Infeksi virus.Sel Vero E6 (ATCC No: CRL-1586) diunggulkan ke piring
kultur dengan medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM)
lengkap dan diinkubasi semalaman sebelum infeksi. MERS-CoV (HCoV-
EMC/2012) dengan multiplisitas infeksi (MOI) 0,1 ditambahkan ke dalam
sel dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam, diikuti dengan
pencucian tiga kali dengan larutan salin fosfat (PBS) untuk
menghilangkan virus yang tidak menempel. Media kultur lengkap yang
segar kemudian ditambahkan ke piring.
Uji Plak.Sel Vero E6 diunggulkan dalam 12 lubang dan diinkubasi
semalaman sebelum pengujian. Sampel yang mengandung MERS-CoV
diencerkan secara serial 10×dengan MEM, ditambahkan ke dalam sumur,
dan diinkubasi selama 1 jam dengan agitasi setiap 15 menit. Setelah
inkubasi, inokula dikeluarkan dan dicuci dengan PBS. Media overlay yang
terdiri dari 2×MEM dan 1,5% (b/v) agarosa (1:1) ditambahkan ke dalam
sumur diikuti dengan inkubasi pada suhu 37°C dan 5% CO2untuk 3 hari.
Pelat difiksasi dengan formalin 10% (v/v) yang mengandung kristal violet
0,2% (b/v), dan plak dihitung.
RT-qPCR.Total RNA sel Vero E6 yang terinfeksi diekstraksi dengan
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai dengan instruksi
pabrik. Transkripsi terbalik dan amplifikasi PCR dilakukan dengan Kit
iTaq Universal One-Step RT-qPCR (Laboratorium Bio-Rad, Hercules,
CA). PCR waktu nyata dilakukan dalam Sistem PCR Waktu Nyata
StepOnePlus (Biosystems Terapan, Foster City, CA). Pasangan primer
yang digunakan untuk mengamplifikasi RNA virus adalah sebagai
berikut: GAPDH-F:5'-GAAGGTGAAGGTCG-GAGTC-3';GAPDH-R: 5'-
GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';52
MERS-CoV-F: 5'-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3';MERS-CoV-R:
5'-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3'.53Tingkat MERS
RNA dinormalisasi ke GAPDH dan dibandingkan antara
kelompok MERS-CoV pada 24 hpi dan 48 hpi
Uji Imunofluoresensi.Sel Vero E6 diunggulkan dalam slide delapan
ruang dan diinkubasi semalaman sebelum infeksi MERS-CoV pada MOI =
0,1. Sel-sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% (v/v) selama 20 menit
pada suhu 4°C, diikuti permeabilisasi dalam 0,1% (v/v) Triton X-100
selama 10 menit. Kemudian, 7,5% (v/v) BSA digunakan sebagai buffer
pemblokiran selama 30 menit pada 37°C. Antibodi primer Anti-MERS-CoV
N (pengenceran 1:500; Sino Biological Inc., Beijing, Cina) digunakan
untuk menodai virus. Sel-sel diinkubasi semalaman, dicuci tiga kali
dengan PBS, dan diinkubasi dengan antibodi sekunder anti-kelinci Alex
Fluor 568 (pengenceran 1:1000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)
selama 1 jam pada suhu kamar. 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)
ditambahkan selama pencucian PBS. Ekspresi nukleokapsid MERS
diperiksa di bawah mikroskop confocal LSM-700; Carl Zeiss AG,
■
Oberkochen, Jerman).
( KONTEN TERKAIT
*SSayainformasi pendukung
Informasi Pendukung tersedia gratis di https://
pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.9b01913.
Konformasi dimerik MERS-CoV N-NTD (Gambar S1);
LibDock berpose dimerik MERS-CoV N-NTD dengan
senyawa kuat (Gambar S2); Agregasi protein MERS-CoV N
yang diinduksi P3 mengasingkan wilayah pengikatan RNA
pada dimer N-CTD (Gambar S3); lokasi target potensial
untuk pengembangan senyawa antivirus spektrum luas
(Gambar S4); aktivitas antivirus P3 terhadap MHV (virus
hepatitis tikus) (Gambar S5); pengumpulan data
kristalografi dan statistik penyempurnaan
3139
pubs.acs.org/jmc Artikel
(Tabel S1); pose docking pW43 dengan struktur kimia,
skor docking, dan sifat biokimia dari 17 potensi serangan
(Tabel S2); primer yang digunakan untuk mutagenesis
dalam penelitian ini (Tabel S3); rangkaian rumus molekul (
PDF)
String Rumus Molekuler_JMC_revisi (CSV)
Kode Aksesi
Untuk kode PDB 6KL2 (asli), 6KL5 (kompleks N-P1), dan 6KL6
(kompleks N-P3), penulis akan merilis koordinat atom dan
data eksperimen setelah artikel dipublikasikan.
■
C INFORMASI PENULIS
Penulis yang sesuai
Ming-Hon Hou -Institut Genomik dan Bioinformatika dan
Departemen Ilmu Hayati, Universitas Nasional Chung Hsing,
Taichung 402, Taiwan; orcid.org/0000-0003-4170-1527;
Telepon: +886-4-2284-0338 ; Surel:mhho@nchu.edu.tw;
Faks: +886-4-2285-9329
Penulis
Shan-Meng Lin -Institut Genomik dan Bioinformatika dan
Departemen Ilmu Hayati, Universitas Nasional Chung Hsing,
Taichung 402, Taiwan
Shih-Chao Lin -Pusat Nasional untuk Pertahanan Hayati dan Penyakit Menular
Penyakit, Sekolah Biologi Sistem, Universitas George Mason,
Manassas, Virginia 20110, Amerika Serikat; orcid.org/0000-
0003-2942-5937
Jia-Ning Hsu -Institut Genomik dan Bioinformatika dan
Departemen Ilmu Hayati, Universitas Nasional Chung Hsing,
Taichung 402, Taiwan
Chung-ke Chang -Institut Ilmu Biomedis, Akademisi
Sinica, Taipei 115, Taiwan
Ching-Ming Chien-Institut Genomik dan Bioinformatika
dan Departemen Ilmu Hayati, Universitas Nasional
Chung Hsing, Taichung 402, Taiwan
Yong-Sheng Wang -Institut Genomik dan Bioinformatika,
Universitas Nasional Chung Hsing, Taichung 402, Taiwan
Hung-Yi Wu -Institut Pascasarjana Patobiologi Hewan,
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Nasional
Chung Hsing, Taichung 40227, Taiwan
U-Ser Jeng -Pusat Penelitian Radiasi Sinkronisasi Nasional,
Hsinchu 30076, Taiwan; Departemen Teknik Kimia,
Universitas Nasional Tsing Hua, Hsinchu 30013, Taiwan;
orcid.org/0000-0002-2247-5061
Kylene Kehn-Hall -Pusat Pertahanan Hayati Nasional dan
Penyakit Menular, Sekolah Biologi Sistem, Universitas George
Mason, Manassas, Virginia 20110, Amerika Serikat
Informasi kontak lengkap tersedia di: https://
pubs.acs.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
Kontribusi Penulis
○
S.-ML, S.-CL, J.-NH, dan C.-kC memberikan kontribusi yang sama untuk
pekerjaan ini.
Kontribusi Penulis
Jia N. Hsu, Shih C. Lin, Yong S. Wang, dan Ming H. Hou
merancang penelitian; Jia N. Hsu, Shih C. Lin, Shan M. Lin, Ching
M. Chien, dan Yong S. Wang melakukan penelitian; Hung Y. Wu,
U S. Jeng, K. Kehn-Hall, dan Ming H. Hou menyumbangkan
reagen atau alat analitik baru; Shih C. Lin, Shan M. Lin, Ching M.
Chien, dan Ming H. Hou menganalisis data; Shih C. Lin, Shan M.
Lin, Chung K. Chang, Ching M. Chien, dan Ming H. Hou menulis
makalah tersebut.
https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat
Pendanaan
Karya ini didukung oleh PALING 106-2628-M-005-001-
MY3.
Catatan
■
dia penulis menyatakan tidak ada kepentingan finansial yang bersaing.
T UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada Pusat Penelitian Radiasi
Sinkronisasi Nasional (Taiwan) dan fasilitas radiasi sinkrotron
Pring-8 (Jepang) atas pengumpulan data difraksi sinar-X.
■
S SINGKATAN
PPI, interaksi protein-protein; MERS-CoV, Virus Corona
Sindrom Pernafasan Timur Tengah; NTD, domain N-
terminal; CTD, domain terminal-C; N, nukleokapsid; β-CoV,
betacoronavirus; RNP, ribonukleoprotein; SAXS, hamburan
sinar-X sudut kecil; MR, penggantian molekuler; BSA, area
permukaan terkubur; TPSA, luas permukaan kutub topologi;
CC50, konsentrasi sitotoksik; EC50, konsentrasi efektif;Dmaks,
dimensi maksimum;RG, radius girasi; MHV, tikus
■
virus epatitis
H REFERENSI
(1) Bosch, J. PPI inhibitor dan pengembangan stabilisator pada penyakit
manusia.Penemuan Obat Saat Ini: Teknologi.2017,24,3−9.
(2) Sijbesma, E.; Hallenbeck, KK; Leysen, S.; de Vink, PJ; Skoŕa,
L.; Jahnke, W.; Brunsveld, L.; Arkin, Bpk; Ottmann, C. Skrining berbasis
fragmen yang diarahkan ke lokasi untuk penemuan penstabil interaksi
protein-protein.Selai. kimia. sosial.2019,141,3524−3531 .
(3) Stevers, LM; Sijbesma, E.; Botta, M.; MacKintosh, C.; Obsil,
T.; Landrieu, saya.; Kau, Y.; Wilson, AJ; Karawajczyk, A.; Eickhoff,
J.; Davis, J.; Hann, M.; O'Mahony, G.; Doveston, RG; Brunsveld, L.;
Ottmann, C. Modulator interaksi protein-protein 14-3-3.J.Med.
kimia.2018,61,3755−3778 .
(4) Ni, D.; Lu, S.; Zhang, J. Munculnya peran modulator alosterik
dalam regulasi interaksi protein-protein (PPI): paradigma baru
untuk penemuan obat PPI.medis. Res. Putaran.2019,39,2314− 2342.
(5) Fischer, G.; Rossmann, M.; Hyvonen, M. Modulasi alternatif
interaksi protein-protein oleh molekul kecil.Saat ini. Pendapat.
Bioteknologi.2015,35,78−85.
(6) Petta, I.; Kehidupan, S.; Libert, C.; Tavernier, J.; De Bosscher,
K. Modulasi interaksi protein-protein untuk pengembangan
terapi baru.mol. Ada.2016,24,707−718.
(7) Zhong, M.; Lee, GM; Sijbesma, E.; Ottmann, C.; Arkin, MR Memodulasi
jaringan interaksi protein-protein dalam homeostasis protein.Saat ini.
Pendapat. kimia. biologi.2019,50,55−65.
(8) Yang, CH; Horwitz, SB Taxol: agen penstabil mikrotubulus
pertama.Int. J.Mol. Sains.2017,18,Nomor 1733.
(9) Yuan, Y.; Wang, L.; Du, W.; Ding, Z.; Zhang, J.; Han, T.; Sebuah, L.;
Zhang, H.; Liang, G. Perakitan mandiri nanopartikel taxol intraseluler
untuk mengatasi resistensi multi-obat.Angew. Kimia, Int. Ed.2015,54,
9700−9704 .
(10) Saxton, RA; Sabatini, DM mTOR memberi sinyal pada pertumbuhan,
metabolisme, dan penyakit.Sel2017,168,960−976.
(11) Putih, KM; Abreu, P.; Wang, H.; De Yesus, PD; Manikasamy, B.;
García-Sastre, A.; Chanda, SK; DeVita, RJ; Shaw, ML Penghambat
spektrum luas virus influenza A dan B yang menargetkan
nukleoprotein virus.Infeksi ACS. Dis.2018,4,146−157.
(12) Zaki, AM; van Boheemen, S.; Bestebroer, TM; Osterhaus,
IKLAN; Fouchier, RA Isolasi virus corona baru dari seorang pria
penderita pneumonia di Arab Saudi.N.Inggris. J.Med.2012,367,1814−
1820.
(13) Forni, D.; Cagliani, R.; Klerisi, M.; Sironi, M. Evolusi molekul
genom virus corona manusia.Tren Mikrobiol.2017,25, 35−48.
3140
pubs.acs.org/jmc Artikel
(14) Mubarak, A.; Alturaiki, W.; Hemida, MG Middle East
Respiratory Syndrome Virus Corona (MERS-CoV): infeksi, respon
imunologi, dan pengembangan vaksin.J. Imunol. Res.2019,
2019,1−11.
(15) Zhu, N.; Zhang, D.; Wang, W.; Li, X.; Yang, B.; Lagu, J.; Zhao,
X.; Huang, B.; Shi, W.; Lu, R.; Niu, P.; Zhan, F.; Bu, X.; Wang, D.;
Xu, W.; Wu, G.; Gao, GF; Tan, W. Virus corona baru dari pasien
pneumonia di Tiongkok, 2019.N.Inggris. J.Med.2020,1−7.
(16) Hui, DS; E, IA; Madani, TA; Ntoumi, F.; Kok, R.; Sayang,
HAI.; Ippolito, G.; McHugh, TD; Memish, ZA; Drosten, C.; Zumla,
A.; Petersen, E. Ancaman epidemi virus corona baru 2019-nCoV yang terus
berlanjut terhadap kesehatan global - wabah virus corona baru tahun 2019
terbaru di wuhan, Tiongkok.Int. J. Menginfeksi. Dis.2020,91,264−266.
(17) Huang, X.; Li, M.; Xu, Y.; Zhang, J.; Meng, X.; Sebuah, X.; Matahari, L.;
Guo, L.; Shan, X.; Ge, J.; Chen, J.; Luo, Y.; Wu, H.; Zhang, Y.; Jiang, Q.; Ning,
X. Inhibitor peptida HR1 berbasis nanorod emas baru untuk virus corona
sindrom pernafasan timur tengah.Aplikasi ACS. Materi. Antarmuka2019,
11,19799−19807 .
(18) Chang, CK; Lihatlah, SC; Wang, YS; Hou, MH Wawasan terbaru
tentang pengembangan terapi terhadap penyakit virus corona dengan
menargetkan protein N.Penemuan Obat Hari Ini2016,21,562− 572.
(19) Zumla, A.; Chan, JF; Azhar, EI; Hui, DS; Yuen, KY Virus
Corona - penemuan obat dan pilihan terapi.Nat. Pendeta
Penemuan Obat2016,15,327−347.
(20) McBride, R.; van Zyl, M.; Fielding, BC Nukleokapsid
virus corona adalah protein multifungsi.Virus2014,6,2991−
3018.
(21) de Wit, E.; van Doremalen, N.; Falzarano, D.; Munster, VJ SARS dan
MERS: wawasan terkini mengenai virus corona yang baru muncul.Nat.
Pendeta Mikrobiol.2016,14,523−534.
(22) Lin, SY; Liu, CL; Chang, YM; Zhao, J.; Perlman, S.; kamu,
Dasar struktural MH untuk identifikasi domain N-terminal
protein nukleokapsid virus corona sebagai target antivirus.
J.Med. kimia.2014,57,2247−2257 .
(23) Nguyen, THV; Lichiere, J.; Desas-desus, B.; Papageorgiou, N.;
Attoumani, S.; Ferron, F.; Coutard, B. Struktur dan keadaan oligomerisasi
wilayah terminal C nukleoprotein virus corona sindrom pernafasan timur
tengah.Acta Crystallogr., Sekte. D: Struktur. biologi.2019,
75,8−15.
(24) Chen, IJ; Yuann, JM; Chang, YM; Lin, SY; Zhao, J.; Perlman, S.;
Shen, YY; Huang, TH; Hou, MH Eksplorasi berbasis struktur kristal
tentang peran penting Arg106 dalam domain pengikatan RNA
protein nukleokapsid OC43 virus corona manusia.Biokimia. Biofisika.
Acta, Protein Proteomik2013,1834,1054−1062.
(25) Penggemar, H.; Ooi, A.; Tan, YW; Wang, S.; Fang, S.; Liu,
DX; Lescar, J. Protein nukleokapsid virus bronkitis menular
virus corona: struktur kristal domain N-terminal dan sifat
multimerisasi.Struktur2005,13,1859−1868.
(26) Chen, J.; Sawyer, N.; Regan, L. Interaksi protein-protein: tren umum
dalam hubungan antara afinitas pengikatan dan luas permukaan
antarmuka yang terkubur.Ilmu Protein.2013,22,510−515.
(27) Papageorgiou, N.; Lichiere, J.; Baklouti, A.; Ferron, F.; Sevajol,
M.; Desas-desus, B.; Coutard, B. Karakterisasi struktural bagian
Nterminal nukleokapsid MERS-CoV dengan difraksi sinar-X dan
hamburan sinar-X sudut kecil.Acta Crystallogr., Sekte. D: Struktur.
biologi. 2016,72,192−202.
(28) Jayaram, H.; Penggemar, H.; Bowman, BR; Ooi, A.; Jayaram, J.;
Collisson, Barat; Lescar, J.; Prasad, struktur sinar-X BV dari domain
terminal Nand C dari protein nukleokapsid virus corona: implikasi
terhadap pembentukan nukleokapsid.J.Virol.2006,80,6612− 6620.
(29) Saikatendu, KS; Yusuf, JS; Subramanian, V.; Neuman, B.
W.; Buchmeier, MJ; Stevens, RC; Kuhn, P. Pembentukan
ribonukleokapsid dari virus corona sindrom pernapasan akut
parah melalui aksi molekuler domain N-terminal protein N.
J.Virol. 2007,81,3913−3921 .
(30) Grossoehme, NE; Li, L.; Keane, SC; Liu, P.; Dan, CE, ke-3;
Leibowitz, JL; Giedroc, DP Virus Corona N protein N-
https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141
Jurnal Kimia Obat pubs.acs.org/jmc Artikel

domain terminal (NTD) secara khusus mengikat urutan regulasi (47) Adams, P.; Grosse-Kunstleve, RW; Digantung, L.-W.; Ioerger, T.
transkripsional (TRS) dan melelehkan dupleks RNA TRS-cTRS.J.Mol. R.; McCoy, AJ; Moriarty, N.; Baca, RJ; Sacchettini, JC; tumis,
biologi.2009,394,544−557. N.; Terwilliger, T. PHENIX: membangun perangkat lunak baru untuk
(31) Pyrkov, televisi; Chugunov, AO; Krylov, NA; Nolde, DE; penentuan struktur kristalografi otomatis.Acta Crystallogr., Sekte. D:
Efremov, RG PLATINUM: alat web untuk analisis organisasi Biologi. Kristallogr.2002,58,1948−1954.
hidrofobik/hidrofilik kompleks biomolekuler.Bioinformatika (48) Emsley, P.; Cowtan, K. Coot: alat pembuat model untuk grafik
2009,25,1201−1202. molekuler.Acta Crystallogr., Sekte. D: Biologi. Kristallogr.2004,
(32) Bros, J.; Tveen-Jensen, K.; de Waal, E.; Hesp, BH; Jackson, J. 60,2126−2132 .
B.; Canters, GW; Callis, PR Keadaan emisi triptofan dalam protein (49)Sistem Grafik Molekuler PyMOL,versi 1.8; Schrodinger,
dengan fluoresensi pergeseran biru tinggi.Angew. Kimia, Int. Ed. LLC, 2015.
2007,46,5137−5139 . (50) Petoukhov, MV; Franke, D.; Shkumatov, AV; Tria, G.; Kikhney,
(33) Gui, M.; Liu, X.; Guo, D.; Zhang, Z.; Yin, C.-C.; Chen, Y.; AG; Gajda, M.; Gorba, C.; Mertens, HD; Konarev, PV; Svergun, DI
Xiang, Y. Studi mikroskop elektron dari kompleks Perkembangan baru dalam paket program ATSAS untuk analisis
ribonukleoprotein virus corona.Sel Protein2017,8,219−224. data hamburan sudut kecil.J. Aplikasi. Kristallogr.2012,45, 342−350.
(34) Chen, CY; Chang, CK; Chang, YW; Menuntut, SC; Bai, Hai;
Riang, L.; Hsiao, CD; Huang, TH Struktur domain dimerisasi (51) Svergun, D.; Barberato, C.; Koch, MHJ CRYSOL - program
pengikat RNA protein nukleokapsid virus corona SARS untuk mengevaluasi hamburan larutan sinar-X makromolekul
biologis dari koordinat atom.J. Aplikasi. Kristallogr.1995,28, 768
menunjukkan mekanisme pengemasan heliks RNA virus.J.Mol.
−773.
biologi. 2007,368,1075−1086.
(52) Gunalan, V.; Mirazimi, A.; Tan, YJ Motif diacid yang diduga ada pada
(35) Wichapong, K.; Poelman, H.; Ercig, B.; Hrdinova, J.; Liu, X.; Lutgens,
protein SARS-CoV ORF6 memengaruhi lokalisasi subselularnya dan
E.; Nicolaes, GA Desain modulator rasional dengan eksploitasi struktur
menekan ekspresi konstruksi ekspresi yang ditransfusikan bersama.
kompleks protein-protein.Kedokteran Masa Depan. kimia.2019,11, 1015
Catatan Resolusi BMC2011,4,Nomor 446.
−1033.
(53) Furuse, Y.; Okamoto, M.; Oshitani, H. Konservasi urutan
(36) de Vink, PJ; Andrey, SA; Higuchi, Y.; Ottmann, C.; Milroy,
nukleotida untuk diagnosis molekuler virus corona sindrom
LG; Brunsveld, L. Dasar kerja sama untuk stabilisasi molekul
pernafasan timur tengah, 2015.Int. J. Menginfeksi. Dis.2015,40,
kecil dari interaksi protein-protein.kimia. Sains.2019,10, 2869
25−27.
−2874 .
(37) Blevitt, JM; Retas, MD; Herman, KL; Jackson, PF; Krawczuk,
PJ; Lebsack, IKLAN; Liu, Kapak; Mirzadegan, T.; Nelen, MI;
Patrick, AN; Steinbacher, S.; Milla, AKU; Lumb, KJ Dasar
struktural agregat molekul kecil menginduksi penghambatan
interaksi proteinprotein.J.Med. kimia.2017,60,3511−3517 .
(38) Spencer-Smith, R.; Koide, A.; Zhou, Y.; Eguchi, RR; Sha, F.;
Gajwani, P.; Santana, D.; Gupta, A.; Jacobs, M.; Herrero-Garcia, E.;
Cobbert, J.; Lavoie, H.; Smith, M.; Rajakulendran, T.; Dowdell, E.;
Okur, MN; Dementieva, I.; Sicheri, F.; Ada, M.; Hancock, JF; Ikura, M.;
Koide, S.; O'Bryan, JP Penghambatan fungsi RAS melalui penargetan
situs regulasi alosterik.Nat. kimia. biologi.2017,
13,62−68.
(39) Pang, B.; Cheung, NN; Zhang, W.; Dai, J.; Kao, RY; Zhang,
H.; Hao, Q. Karakterisasi struktural situs pengikatan
nukleoproteinnukleozin H1N1.Sains. Reputasi.2016,6,Nomor 195.
(40) Kao, RY; Yang, D.; Lau, LS; Tsui, WH; Hu, L.; Dai, J.; Chan,
anggota parlemen; Chan, CM; Wang, P.; Zheng, BJ; Matahari, J.;
Huang, JD; Madar, J.; Chen, G.; Chen, H.; Guan, Y.; Yuen, KY
Identifikasi nukleoprotein influenza A sebagai target antivirus.
Nat. Bioteknologi.2010,28,600−605.
(41) Klenchin, VA; Raja, R.; Tanaka, J.; Marriott, G.; Rayment, I. Dasar
struktural dari swinholide Ikatan aktin.kimia. biologi.2005,12, 287
−291.
(42) Shin, aku.; Hong, S.; Krische, MJ Sintesis total swinholide A: eksposisi
dalam pembentukan ikatan C−C yang dimediasi hidrogen.Selai. kimia.
sosial.2016,138,14246−14249 .
(43) Bubb, BAPAK; Spector, saya.; Bershadsky, IKLAN; Korn, ED
Swinholide A adalah mikrofilamen yang mengganggu racun laut yang
menstabilkan dimer aktin dan memutuskan filamen aktin.J.Biol. kimia.
1995,270, 3463−3466 .
(44) Ferreira de Freitas, R.; Schapira, M. Analisis sistematis
interaksi atom protein-ligan dalam PDB.MedChemComm2017,
8,1970−1981.
(45) Hossain, BM; Konermann, L. Pertukaran hidrogen/deuterium
berdenyut MS/MS untuk mempelajari hubungan antara kompleks
protein nonkovalen dalam larutan dan dalam fase gas setelah ionisasi
elektrospray.Dubur. kimia.2006,78,1613−1619.
(46) Wang, YS; Chang, CK; Hou, MH Analisis kristalografi
domain N-terminal protein nukleokapsid sindrom
pernafasan timur tengah.Acta Crystallogr., Sekte. F:
Struktur. biologi. Komunitas.2015,71,977−980.

3141 https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01913
J.Med. kimia.2020, 63, 3131−3141