Machine Translated by Google

Analisis FTIR Struktur Protein

Warren Gallagher

A. Pengantar struktur protein

Struktur pertama protein pada resolusi atom ditentukan pada akhir tahun 1950-an.1 Sejak
saat itu hingga awal tahun 1990-an, sekitar 300 struktur protein ditambahkan ke dalam daftar,
terutama menggunakan kristalografi sinar-X. Saat ini lebih dari 20.000 struktur telah dipecahkan,2
beberapa di antaranya menggunakan teknik terbaru spektroskopi resonansi magnetik nuklir
(NMR) multidimensi. Meskipun kristalografi sinar-X dan spektroskopi NMR memberikan tingkat
detail tertinggi tentang struktur protein, ada banyak situasi di mana teknik ini tidak dapat
diterapkan. Teknik lain, seperti FTIR, mungkin tidak memberikan tingkat detail struktur yang sama,
namun dapat diterapkan dengan mudah untuk lebih memahami cara kerja protein.

Sebelum menjelaskan informasi struktural yang diberikan spektroskopi FTIR, diberikan

pengenalan singkat tentang struktur protein. Protein adalah polimer biologis linier untuk
yang unit monomernya adalah asam amino. (Gambar 1). Dua puluh asam amino berbeda digunakan
untuk membuat protein, masing-masing dibedakan berdasarkan identitas gugus “R”. Asam
amino berikatan membentuk polimer dengan cara menghubungkan gugus amino pada satu asam
amino dengan gugus asam karboksilat pada asam amino lain sehingga membentuk ikatan amino (Gambar 2).

gugus amino asam karboksilat

H HAI kelompok

H tidak C OH

SDM karbon alfa

kelompok "R".

Gambar 1: Struktur asam amino; bahan dasar pembuatan protein.

Ahli kimia protein menyebut ikatan Amida sebagai ikatan peptida. Ketika dua asam amino dihubungkan
bersama melalui ikatan amino, maka disebut dipeptida ; dan ketika banyak asam amino terikat
bersama-sama dengan cara ini disebut polipeptida . Polipeptida terdiri dari tulang punggung
dan rantai samping. Tulang punggung terdiri dari nitrogen tengah, karbon alfa, dan karbon karbonil
yang disumbangkan oleh setiap unit asam amino. Rantai samping terdiri dari kelompok “R”, dan
menjuntai dari tulang punggung seperti jimat pada gelang.

1 Kendrew dkk. (1958) Alam 18, 662-666.

2 Bank Data Protein, Laboratorium Nasional Brookhaven, “http://ftp.pdb.bnl.gov”, 16 Mei 1997

1
Machine Translated by Google

ikatan Amida

H HAI H HAI H HAI H HAI

H tidak C OH + H tidak C OH H tidak C NC C OH + HOH

H CH3 HCH2 H CH3 HCH2

OH OH

alanin serin suatu dipeptida air

Gambar 2: Menghubungkan dua asam amino melalui ikatan amino untuk membentuk dipeptida.

Protein dibedakan satu sama lain berdasarkan jumlah unit asam amino yang dikandungnya dan
berdasarkan identitas serta urutan asam amino. Jumlahnya bervariasi dari 50 hingga ratusan unit asam amino,
sehingga jumlah urutan yang mungkin sangat besar. Jumlah asam amino dalam protein dan urutannya ditentukan
secara genetik. Beberapa polipeptida dianggap sebagai protein. Agar polipeptida dapat dianggap sebagai
protein, polipeptida harus dapat dilipat menjadi struktur 3 dimensi yang terdefinisi dengan baik. Ini biasanya
merupakan persyaratan untuk fungsi protein.

Ketika suatu protein terlipat untuk membentuk struktur 3 dimensi yang terdefinisi dengan baik, ia memperlihatkan tiga
tingkat struktur: primer, sekunder dan tersier. Urutan asam amino yang ditentukan secara genetis
adalah struktur utama. Struktur utama sering kali dimodelkan
seperti manik-manik pada seutas tali, dimana setiap manik mewakili satu unit asam amino. Struktur tersier
dapat dimodelkan sebagai bola salju yang padat, dimana setiap atom dalam protein memiliki lokasi yang jelas.
Pelipatan protein dapat disamakan dengan meremas untaian manik-manik (struktur primer) menjadi bola yang
padat (struktur tersier) (Gambar 3a). Masalah yang dihadapi protein dalam membentuk struktur tersier adalah
banyaknya asam amino yang berada di dalam bola yang padat dan tidak lagi bersentuhan langsung dengan
air. Namun, Amida suka terkena air karena bisa

membentuk “ikatan hidrogen” dengan air (Gambar 3b). Masalah ini diselesaikan dengan memberikan cara
alternatif bagi Amida yang terkubur untuk membentuk ikatan hidrogen. Yang utama di antara hal-hal ini adalah memiliki
ikatan tengah ikatan hidrogen satu sama lain (Gambar 4).

HAI HAI
ikatan hidrogen H H
dengan air
H HAI H HAI

NC C NC C

H CH3 HCH2
HAI HAI OH

H H

A. B.

Gambar 3: a. Model pelipatan protein yang paling kasar: meremas untaian manik-manik. B. Hidrogen
ikatan yang terbentuk antara ikatan Amida dan air.

2
Machine Translated by Google

H HAI H HAI

NC C NC C N

ikatan hidrogen HR HR H
antara Amida
HAI H HAI H HAI

C NC C NC C

HR HR

Gambar 4: Ikatan hidrogen yang terbentuk antara ikatan amino yang terkubur di dalam protein terlipat.

Hal ini mengarah pada struktur protein tingkat menengah yang disebut struktur sekunder.
Jenis struktur sekundernya meliputi heliks dan lembaran ÿ, yang memungkinkan ikatan hidrogen antara
Amida dengan sangat efisien satu sama lain. Keduanya merupakan struktur periodik.
Dalam heliks ÿ, tulang punggung polipeptida digulung dalam heliks tangan kanan dimana ikatan
hidrogen terjadi antara putaran heliks yang berurutan. Gambar 5 (kiri) menunjukkan segmen ÿhelix dari
protein kecil bovine pankreas trypsin inhibitor (BPTI). Dalam lembaran ÿ, untaian polipeptida direntangkan
dan terletak sejajar atau antiparalel satu sama lain. Ikatan hidrogen terbentuk di antara untaian. Gambar 5
(kanan)
menggambarkan hal ini dengan selembar ÿ-sheet antiparalel dari BPTI. Elemen lain dari struktur
sekunder termasuk putaran ÿ dan struktur tidak teratur . Putaran ÿ adalah putaran tajam yang
menghubungkan untaian yang berdekatan dalam lembaran ÿ antiparalel. Struktur tak beraturan umumnya a
mencakup semua wilayah yang tidak termasuk dalam salah satu kategori lainnya. Ini sering kali merupakan loop yang
terbentuk di dekat permukaan protein dan bergabung dengan elemen struktur sekunder lainnya.

Struktur tersier muncul ketika berbagai elemen struktur sekunder tersusun rapat
bersama-sama untuk membentuk struktur 3 dimensi yang terdefinisi dengan baik. Struktur tersier suatu
protein ditentukan oleh koordinat spasial semua atomnya. disatukan oleh interaksi yang menguntungkan
antara rantai samping. Interaksi ini lemah, itulah sebabnya protein mudah “terdenaturasi” oleh panas dan
paparan bahan kimia tertentu. Rantai samping yang terkubur di dalam protein terlipat dikemas rapat dan
harus berinteraksi dengan baik agar tetap terlipat. Sedikit

3
Machine Translated by Google

Gambar 5: Segmen ÿ-helix (kiri), dan ÿ-sheet (kanan) yang diambil dari BPTI. Hidrogen dan
sidechains telah dihilangkan untuk kejelasan. Karbon berwarna hitam, oksigen berwarna merah, dan nitrogen berwarna biru.
Ikatan hidrogen antara oksigen Amida dan nitrogen ditunjukkan sebagai garis putus-putus.

rangkaian polipeptida yang mungkin memenuhi persyaratan ketat ini untuk melipat ke dalam
struktur 3 dimensi yang terdefinisi dengan baik. Gambar 6 menunjukkan model
spacefilling dan pita untuk BPTI. Dalam model pengisian ruang, atom diwakili oleh bola
dengan skala sesuai ukuran relatif sebenarnya, yang menggambarkan protein terlipat
yang tersusun rapat. Model pita menunjukkan tulang punggung polipeptida menelusuri
struktur lipatan. Ini menyoroti berbagai jenis struktur sekunder.

B. Memperoleh informasi struktur tentang protein menggunakan spektroskopi FTIR

Spektroskopi FTIR memberikan informasi tentang kandungan struktur sekunder

protein, tidak seperti kristalografi sinar-X dan spektroskopi NMR yang memberikan informasi
tentang struktur tersier. Spektroskopi FTIR bekerja dengan menyinari radiasi infra merah
pada suatu sampel dan melihat panjang gelombang radiasi pada wilayah spektrum
inframerah mana yang diserap oleh sampel. Setiap senyawa mempunyai karakteristik pita
serapan dalam spektrum inframerahnya. Pita karakteristik yang ditemukan pada spektrum
inframerah protein dan polipeptida meliputi Amida I dan Amida II. Ini muncul dari ikatan
Amida yang menghubungkan asam amino. Penyerapan yang berhubungan dengan
pita Amida I menyebabkan vibrasi regangan ikatan C=O dari Amida, serapan yang berhubungan dengan Amida
Pita II terutama mengarah pada getaran lentur ikatan N—H (Gambar 7). Karena keduanya
ikatan C=O dan N—H terlibat dalam ikatan hidrogen yang terjadi antara berbagai
elemen struktur sekunder, lokasi pita Amida I dan Amida II sensitif terhadap kandungan
struktur sekunder suatu protein. Studi dengan protein yang strukturnya diketahui telah
digunakan untuk mengkorelasikan secara sistematis bentuk pita Amida I dengan kandungan
struktur sekunder.3,4 Pita Amida II, meskipun sensitif

3 Byler, DM dan Susi, H. (1986) Biopolimer 25, 469-487.

4 Surewicz, WK dan Mantsch, HH. (1988) Biokimia. Biofisika. Undang-undang 952, 115-130.

4
Machine Translated by Google

terhadap kandungan struktur sekunder, bukanlah prediktor yang baik untuk mengukur struktur sekunder
protein. Salah satu kesulitan dalam menganalisis pita Amida I untuk struktur sekunder adalah
pergeserannya

Gambar 6: Penghambat trypsin pankreas sapi. Kiri, model pengisian ruang; benar, model pita. Warna adalah
digunakan untuk memberi label ÿ-helix (ungu), ÿÿsheet (kuning), dan loop (putih).

pita Amida I berukuran kecil dibandingkan dengan lebar intrinsik pita tersebut. Alih-alih serangkaian
puncak yang terselesaikan dengan baik untuk setiap jenis struktur sekunder, yang diamati adalah
satu puncak kental yang luas (Gambar 8a). Beberapa metode numerik digunakan untuk
meningkatkan resolusi nyata pita Amida I sehingga perkiraan kandungan struktur sekunder dapat
dibuat. Gambar 8b menunjukkan hasil yang kami peroleh untuk pita Amida I BPTI
menggunakan metode dekonvolusi diri Fourier yang dikembangkan oleh Kauppenin dkk.5

Amida I HAI HAI

getaran
C N C N
Amida II
H H getaran

Gambar 7: Getaran yang bertanggung jawab atas pita Amida I dan Amida II dalam spektrum inframerah protein dan polipeptida.
Pita Amida I disebabkan oleh vibrasi regangan karbonil, sedangkan pita Amida II terutama disebabkan oleh vibrasi lentur NH.

C. Pemantauan pertukaran isotop hidrogen dengan spektroskopi FTIR

Ketika protein dilarutkan dalam air, hidrogen terikat pada nitrogen Amida
dapat dengan mudah menukar hidrogen yang terikat pada molekul air. Untuk dibuka

5
Kauppinen, JK; Moffatt, DJ; Mantsch, HH dan Cameron, DG (1981) Appl. Spektrum. 35, 271-276.

5
Machine Translated by Google

polipeptida pertukaran ini dapat terjadi ribuan kali per detik. Ketika polipeptida terlipat untuk membentuk
struktur 3 dimensi protein yang terdefinisi dengan baik, banyak hidrogen Amida yang terkubur di
bagian dalam protein dan tidak lagi bersentuhan langsung dengan air pelarut. Hal ini menyebabkan
penurunan tajam dalam nilai tukar hidrogen tersebut. Hidrogen Amida yang terkubur paling dalam
memerlukan waktu berminggu-minggu, bahkan berbulan-bulan, untuk bertukar. Fakta bahwa mereka
melakukan pertukaran pada akhirnya dianggap sebagai bukti bahwa protein terlipat agak fleksibel, yaitu
strukturnya berfluktuasi seiring waktu untuk memungkinkan daerah yang terkubur mengakses pelarut.
Pertukaran isotop hidrogen menjadi alat yang ampuh untuk mempelajari proses pelipatan protein.6

60 60

Pita Amida I pita Amida II

50 Tidak biasa.
50
?

40
40 ÿ-heliks

Ternyata
30
30 lembar ÿ

lembar ÿ
20 lembar ÿ
20 Rantai samping

Rantai samping
Ternyata
10
10

0
0

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1720 1700 1680 1660 1640 1620 1600 1580

Bilangan Gelombang (cm-1 ) Bilangan Gelombang {cm-1 }

A. B.

Gambar 8: a. Spektrum FTIR inhibitor trypsin pankreas sapi menunjukkan Amida I dan Amida II
band. B. Hasil analisis dekonvolusi diri Fourier pada pita Amide I untuk pankreas sapi
penghambat tripsin. Penetapan berbagai puncak ke berbagai elemen struktur sekunder ditunjukkan.

Untuk mengamati laju pertukaran hidrogen, isotop hidrogen yang berbeda digunakan untuk
pelarut air dibandingkan dengan yang awalnya ada pada protein. Untuk percobaan kami, kami
menggunakan air berat, yang mengandung isotop deuterium hidrogen (2H) dan bukan isotop hidrogen
1H yang lebih melimpah. Isotop 2H memiliki sifat kimia yang hampir sama dengan isotop 1H, tetapi
massanya dua kali lipat. Seperti penambahan massa pada ujung pendulum, pertukaran isotop 1H dengan
isotop 2H mempengaruhi frekuensi getaran ikatan Amida sehingga mempengaruhi pita Amida I
dan Amida II pada spektrum inframerah suatu protein. Gambar 9 menunjukkan hasil percobaan
pertukaran isotop hidrogen di BPTI yang dipantau menggunakan FTIR.

Kami melakukan studi sistematis untuk melihat apakah kami dapat menyelesaikan pertukaran
isotop hidrogen untuk berbagai jenis struktur sekunder menggunakan spektroskopi FTIR. Kami
memilih untuk melakukan studi awal pada BPTI karena beberapa alasan: BPTI merupakan protein yang
sangat stabil dan mudah untuk dikerjakan; itu berisi contoh-contoh representatif dari masing-masing elemen utama

6 Kunihiro, K., Kim, P. dan Baldwin, RL (1984) Biopolimer 22, 59-67.

6
Machine Translated by Google

struktur sekunder (lihat Gambar 6 (kanan)); dan eksperimen pertukaran isotop hidrogen ekstensif
dilakukan pada protein ini menggunakan spektroskopi NMR, sehingga nilai tukar tersedia untuk hampir
setiap hidrogen Amida dalam protein.7 Hasil eksperimen yang dilakukan pada pH 6,04 dan 25°C
ditunjukkan pada Gambar 10a . Untuk melihat elemen struktur sekunder mana yang paling terkena
dampak selama percobaan ini, Gambar 11
memplot intensitas relatif setiap puncak sebagai fungsi waktu beserta penugasan untuk masing-masing
puncak. Skala logaritmik digunakan untuk skala waktu karena pertukaran merupakan proses peluruhan secara
eksponensial. Dari percobaan ini kami membuat penugasan puncak untuk bentuk terhidrogenasi
dan deuterasi dari masing-masing elemen utama struktur sekunder.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 11, puncak yang ditetapkan mencerminkan perilaku masing-
masing selama proses pertukaran. Unsur yang mengalami perubahan paling besar pada percobaan ini adalah
unsur tak beraturan dan unsur heliks ÿ. Elemen belokan dan lembaran ÿ menunjukkan perubahan paling sedikit.
Hal ini diharapkan bagi BPTI. Putaran tersebut terletak di permukaan protein dan kemungkinan besar
menyelesaikan pertukarannya sebelum titik waktu pertama diambil. Sebaliknya, ÿ-sheet di BPTI terkubur di
dalam inti protein, sehingga sebagian besar hidrogen ÿ-sheet seharusnya hanya bertukar sedikit pada
akhir percobaan ini. Berdasarkan kondisi pH dan suhu yang digunakan dalam percobaan ini, hidrogen-
hidrogen ini memerlukan waktu bertahun-tahun untuk ditukar. Namun, jika suhu dinaikkan hingga
mendekati titik didih, pertukaran dari semua lokasi akan selesai dalam beberapa menit. Banyak

Gambar 9: Durasi hidrogen/deuterium dari BPTI, dari 3 menit hingga 374 menit setelah permulaan
pertukaran. Pita Amida II pada 1450 cm1 ditujukan untuk BPTI yang dideuterasi dan semakin meningkat seiring berjalannya waktu. Itu

7 Hilton, BD, dan Woodward, CK (1978) Biokimia 17, 3325-3332; Hilton, BD, dan Woodward,
CK (1979) Biokimia 18, 5834-5841; Wüthrich, K. dan Wagner, G. (1979) J. Mol. biologi. 130, 1-18; Richarz,
R., Sehr, P., Wagner, G. dan Wüthrich, K. (1979) J. Mol. biologi. 130, 19-30; Wüthrich, K. dan Wagner, G.
(1979) J. Mol. biologi. 130, 31-37; Tüchsen, E. dan Woodward, C. (1985) J. Mol. biologi. 185, 405-419;
Tüchsen, E. dan Woodward, C. (1985) J. Mol. biologi. 185, 421-430; Roder, H., Wagner, G. dan
Wüthrich, K. (1985) Biokimia 24, 7396-7407; Tüchsen, E. dan Woodward, C. (1987) J. Mol. biologi.
193, 793-802; Gallagher, WH, Tao, F., dan Woodward, C. (1992) Biokimia 31,4673-4680

7
Machine Translated by Google

Pita Amida II pada 1550 cm1 ditujukan untuk BPTI terhidrogenasi dan semakin berkurang seiring berjalannya
waktu. Spektrum merah bawah pada 1550 cm1 diperoleh setelah pertukaran sempurna; sisa serapan di wilayah ini
disebabkan oleh adanya gugus pada protein selain gugus amino.

perubahan terjadi antara titik waktu terakhir yang diambil dalam percobaan yang dilakukan pada
pH 6,04 dan 25°C dan waktu tak terhingga saat pertukaran akan selesai (lihat Gambar 10b).
Selama ini pertukaran isotop hidrogen diperkirakan terutama terjadi di wilayah ÿ-sheet BPTI.

Kami mengusulkan untuk memperluas penelitian ini untuk melihat efek pertukaran isotop hidrogen
dari ÿ-sheet BPTI terhadap pita Amida I. Hal ini dapat dilakukan dengan melakukan percobaan
pada nilai pH yang lebih tinggi . Pada nilai pH di atas 5, pertukaran isotop hidrogen dilakukan
dengan katalis basa. Nilai tukar diperkirakan meningkat 10 kali lipat untuk setiap kenaikan 1 unit
pH . Ini akan memungkinkan kami membawa pertukaran dari ÿ-sheet ke dalam jendela waktu
yang dapat diakses dengan prosedur kami.