Teori dan Aplikasi PCR

(Polymerase Chain Reaction)

TIM UPT LABORATORIUM
TERPADU DAN SENTRA INOVASIT
TEKNOLOGI (UPT LTSIT)

WAWAN A. SETIAWAN, M.Si

Definisi
PCR  proses sintesis
eksponensisal urutan DNA spesifik
yang dilakukan secara in vitro.

Ditemukan tahun 1983 oleh Dr. Kary

Banks Mullis, dimana pada tahun 1993
dia mendapatkan penghargaan Nobel
dalam bidang Kimia.
Mengapa disebut “Polymerase”?

Disebut “polymerase” karena dalam

PCR hanya menggunakan enzim DNA
polimerase.
Mengapa disebut “Chain”?

Disebut “chain/rantai" karena

produk dari reaksi pertama menjadi
substrat dari produk berikutnya, dan
seterusnya.
 Bagaimana PCR Bekerja?

PCR merupakan metode buatan untuk melakukan

Replikasi DNA.
Hanya sebagian kecil sekuen dari DNA genom yang
direplikasi, namun replikasinya dilakukan secara
eksponensial.
Jumlah kopi sekuen DNA yang dihasilkan oleh PCR
mengikuti rumus:
Jumlah kopi sekuen DNA akhir = 2n x y
y = jumlah kopi sekuen awal
n = jumlah siklus PCR
 Jika kita memulai PCR dengan sekuen awal
sebanyak 100 kopi, berapa banyak hasil yang
didapatkan dalam 30 siklus?

Jumlah kopi sekuen DNA akhir =2n x y

= 230 x 100
= 1,073,741,824 x 100
= 107,374,182,400
 Komponen Pereaksi PCR

 Buffer (mengandung Mg++)

 Template DNA
 2 sekuen Primer spesifik yang mengapit sekuen
DNA template yang akan diamplifikasi
 dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP)
 Taq DNA Polymerase
 Tahapan penting PCR
Reaksi PCR dilakukan menggunakan alat PCR
(Automated Thermal Cycler), sebuah alat yang dapat
mengatur panas dan dinginnya suhu secara otomatis
dalam waktu yang sangat singkat. Ada 3 tahapan
penting dalam reaksi PCR, yang diulang dalam 20
sampai 40 siklus.
1. Denaturasi pada kisaran suhu 94°C :
Selama tahap denaturasi, DNA utas ganda terpisah
(melting) menjadi utas tunggal, baik itu sekuen DNA
template maupun sekuen DNA primer. Ikatan hidrogen
DNA untai ganda terlepas.
Tidak ada reaksi enzimatis.
2. Annealing/penempelan primer pada kisaran suhu
54°C :
Ikatan hidrogen yang tadinya terlepas menjadi
berikatan kembali. Sekuen DNA primer akan
berikatan/menempel dengan sekuen DNA template
yang sesuai.
3. Ekstensi/pemanjangan pada kisaran suhu 72°C :
dNTP yang komplemen dengan DNA template akan
ditambahkan oleh enzim DNA polimerase pada
ujung 3’ sekuen primer.
PCR
Temperature
100
Melting
94 oC

50

0
T i m e

3’ 5’
5’ 3’
PCR
Temperature
100
Melting
94 oC

50

0
T i m e
3’ 5’

Heat

5’ 3’
PCR
Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’

5’

5’
5’ 3’
PCR 30x

Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’

Heat
5’

5’

Heat
5’
5’ 3’
PCR 30x

Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
 PCR 30x

Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’
5’ 3’

Heat
5’

5’

Heat
5’
 PCR 30x

Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’
 PCR 30x

Temperature
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragments of
defined length 5’
5’

5’
5’
Verifikasi hasil PCR  Elektroforesis di gel agarose
Aplikasi PCR
Terimakasih