KIMIA

ANALITIK
INSTRUMEN
DASAR KELOMPOK 4:
PEMISAHAN DEYAN DANIEL (A1C115002)
TUTUT RAHAYU (A1C115013)
KROMATOGRAFI WAHYUNI A (A1C115019)
ANISA RAHAYU (RRA1C115001)
NOVA ARMA (RRA1C115011)
FITRI SULASTRI (RSA1C115024)
CHRISYANTO N (RSA1C115028)
 KONSEP KROMATOGRAFI

PENGERTIAN KROMATOGRAFI
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu
Kroma yang berarti warna dan Graf/Grafi yang
berarti tulisan, gambar. Kromatografi adalah
salah satu metode pemisahan kimia yang
didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat
pada fasa diam (stationary phase) dan fasa
gerak (mobile phase). Teknik kromatografi
diartikan sebagai suatu metoda yang digunakan
untuk memisahkan campuran komponen atau
fraksi sejenis menjadi unit-unit yang terpisah satu
dengan yang lain yang didasarkan pada
perbedaan sifat masing-masing.
 KONSEP KROMATOGRAFI

SEJARAH KROMATOGRAFI
Seorang ilmuwan botani dan Rusia, Michael
Tswett, pada tahun 1906 dengan suatu
percobaan dapat mernisahkan zat warna hijau
yang terdapat pada daun menjadi beberapa
komponen. Karoten (kuning oranye/pucat),
feofitin (him keabu-abuan, kadang-kadang tidak
tampak), klorofil-b (hijau tua), klorofil-a (biru
kehijauan), dan xantofil (kuning) dapat
dipisahkan melalui tabung yang diisi dengan
bubuk kalsium karbonat dan dielusi dengan
petroleum eter.
 KONSEP KROMATOGRAFI

ISTILAH DALAM KROMATOGRAFI

 Fase diam (stationer phase)
 Fase gerak (moving phase, mobile phase)
 Penyangga atau matrik (support)
 Penyerap (sorbent)
 Solut (solute)
 Pengembang (developer) atau eluen (eluent)
 Eluat
 Elusi
 Pemuatan (loading) sampel
 Volume retensi (retention volume, void volume, hold-up volume)
 Volume bed (bed volume)
 Volume pengelusi (elution volume)
 Kolom
 Kromatogram
 KONSEP KROMATOGRAFI

SISTEM DALAM KROMATOGRAFI

 Sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang
didasarkan atas perbedaan polaritas pada matrik
(fase diam).
 Sistem adsorpsi, ialah pemisahan komponen yang
didasarkan pada kecenderungan komponen-
komponen mengadakan adsorpsi pada matrik (fase
diam).
 Sistem normal (normal phase) yaitu kromatografi yang
menggunakan fase diam bersifat polar dan fase
bergeraknya bersifat non-polar.
 Sistem sungsang atau sistem terbalik (reversed phase)
jika dalam kromatografi digunakan fase diam bersifat
non-polar sedangkan fase bergeraknya bersifat polar.
 KONSEP KROMATOGRAFI

 Sistem penukar ion (ion exchange) ialah sistem

kromatografi yang menggunakan dasar perbedaan
muatan antara komponen yang dipisahkan dengan
muatan matriknya.
 Sistem afinitas ialah pemisahan komponen dengan
kromatografi yang mendasarkan pada perbedaan
afinitas (kemampuan bergabung) untuk
mengadakan ikatan dengan fase diam.
 Sistem penyaring molekuler (molecular sieve) atau
sistem ekslusi bentuk (size exclussion) jika pemisahan
komponen didasarkan pada perbedaan ukuran
(bentuk) atau berat molekulnya.
 Sistem pasangan ion (ion pairing) jika ke dalam
sistem kromatografi ditambahkan bahan atau
komponen yang dapat merubah tegangan ionik
pada matrik atau eluen atau keduanya.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

1. Kromatografi Kertas dan Kromatografi Lapis

Tipis
Kromatografi kertas merupakan salah satu metode
identifikasi dan pengujian kemurnian suatu senyawa

Prinsip kromatografi kertas :

bahan uji terdistribusi antara fasa diam dan fasa
gerak. Fasa diam biasanya adalah selembar kertas
saring bermutu tinggi. Fasa gerak adalah larutan
pengembang yang merambat naik pada fasa gerak,
membawa sampel bersamanya.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Kromatograsi lapis tipis adalah suatu teknik yang

digunakan untuk memisahkan campuran yang
tidak volatil.

Teknik kromatografi KERTAS dan LAPIS TIPIS dapat

dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan
penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan
kertas, kertas berfungsi ganda, yaitu sebagai pelat
sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas
merupakan selulosa yang dapat menyerap eluen
sehingga sistem yang terjadi adalah partisi.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau

lapis tipis harus dibuat larutan dahulu. Larutan
sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis
tipis pada salah satu tepinya dengan jarak kurang
lebih 2, 5 cm dan tepi. Tetesan sampel diusahakan
sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan
pipa kapiler, pipet mikro, atau siring (spet, jarum
suntik berukuran mikro).

Ada tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan

secara ascending, descending, dan radial atau
horizontal.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Rf diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak

tempuh larutan pengelusi pada kertas atau lapis tipis, yaitu:

𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑝𝑖𝑠 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑠

𝑅𝑓 =
𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑝𝑖𝑠 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑠
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

2. KROMATOGRAFI KOLOM PARTISI

Kromatografi kolom partisi yaitu kromatografi yang
menggunakan fase diam berupa cairan yang
diadsorpsikan pada permukaan partikel partikel matrik
dalam kolom dan menggunakan fase bergerak
berupa cairan.

Peralatan:
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Bahan penyangga dan sifatnya yang banyak digunakan

pada kromatografi kolom partisi antara lain seperti pada
Tabel 1.
Nama komersial Sifat Distributor
Tanah diatom (Kieselguhr):

Filter-Cel Luas permukaan 16m2/g Johns-Manville Corp

Super-Cel Luas permukaan 5m2/g Johns-Manville Corp
Hyflo Super-Cel Luas permukaan 2m2/g Johns-Manville Corp
Celite 503 Luas permukaan 1,5m2/g Johns-Manville Corp
Celite 545 Luas permukaan 1m2/g Johns-Manville Corp
Gel Silika:
Davison 12 28-200 mesh W.R. Grace Co Davison Chemical Div.

Davison 922 200-235 mesh Fisher Scientific Co

Davison 63 325 mesh 325 mesh Fisher Scientific Co
Davison 35 12-42 mesh Fisher Scientific Co
Bio-Sil HA >325 mesh Bio-Rad Laboratories
Bio-Sil BH 100-200 mesh Bio-Rad Laboratories
Bio-Sil A 100-200 dan 200-235 mesh, kemurnian tinggi Bio-Rad Laboratories

Merck 7734 68-320 mesh Brinkmann Instrument Inc.

Merck 7754 68-320 mesh, kemurnian tinggi Brinkmann Instrument Inc.
Merck 7734 35-68 mesh Brinkmann Instrument Inc.
Selulosa (bubuk):
Cellolose powder MN2100 Acid washed Mackerey, Negel & Co

Cellolose powder MN2100 Bebas lemak Brinkmann Instrument Inc.

Cellolose powder S&S 389 Tidak mengandung abu Carl Schleider & Schnell Co.

Cellolose powder Whatman Tidak mengandung abu Reeve Angel and Co

 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

PREPARASI BAHAN PENYANGGA

Untuk bahan penyangga berupa tanah diatome atau gel
silika, maka bahan penyangga ini harus dicampur
dengan fase diam yang akan digunakan dengan
perbandingan 0,5-1,0 bagian fase diam dengan 1,0
bagian bahan penyangga. Pencampuran harus baik,
misalnya dengan menggunakan mortar atau blender
sehmgga akan dihasilkan semacam pasta atau bubur
yang tidak terlalu basah tetapi juga tidak kering.

TEKNIK
Ada beberapa cara mengeluasi sampel :
1. cara bertahap (batch elution atau stepwise elution)
2. mengalirkan eluen secara berterusan (continuous
elution)
3. mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih
pelarut sekaligus dengan rasio yang berubah selama
elusi
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Keterkaitan perubahan konsentrasi pelarut-pelarut pada

pengelusian bertingkat dengan ukuran tangki
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
PENGGUNAAN
Kromatografi kolom partisi banyak digunakan untuk
memisahkan berbagai komponen yang terdapat dalam
bahan pangan dan pakan termasuk juga bahan hasil
pertanian pada umumnya, antara lain:
 Asam-asam lemak C2-C8, dengan fase diam campuran
air dan asam sulfat dengan perbandingan tertentu, dan
fase bergerak campuran kloroform dan n-butanol.
 Senyawa-senyawa golongan lipida, dengan fase diam
campuran trikiorometan dan alkana dan fase bergerak
2-propana.
 Karbohidrat dan glukosida dengan fase diam 1,2-
etanadiol monometileter dan fase bergerak 2-propana.
 Golongan fenol dengan fase diam berupa air dan fase
bergerak campuran metanol, n-butanol, dan kloroform.
 Untuk memisahkan aidrin-dieldrin (keduanya adalah
insektisida) dengan fase diam nitrometan dan fase
bergerak n-heksana.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

3. KROMATOGRAFI KOLOM ADSORBSI

Kromatografi kolom adsorpsi yaitu kromatografi yang
menggunakan fase diam berupa padatan sekaligus sebagai
matrik yang dimasukkan ke dalam suatu tabung dan
menggunakan fase bergerak berupa cairan.

PERALATAN:
Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan
tabung seperti halnya pada kromatografi kolom partisi dan
cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan penyiapan
kolom partisi. Partikel-partikel penyangga dibuat sluri dengan
menggunakan pelarut yang akan digunakan sebagai fase
bergerak, kemudian dimasukkan ke dalam tabung dan
dibiarkan beberapa waktu lamanya supaya partikel-partikel
penyangga mengendap. Cara memuatkan sampel, teknik
mengelusi, dan pengumpulan fraksifraksi, serta cara-cara
analisisnya sama dengan yang telah diterangkan pada
kromatografi kolom partisi. Komponen yang keluar kolom
terlebih dahulu tergantung pada sistem kromatografi yang
digunakan.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

4. KROMATOGRAFI GEL
Kromatografi gel yaitu kromatografi yang menggunakan bahan
penyangga padatan sebagai penyaring molekuler komponen. Pada
kromatografi gel, partikel-partikel yang dipisahkan berupa
molekulmolekul berdasarkan pada ukurannya. Oleh karenanya
kromatografi gel sering kali disebut dengan kromatograli penyaring
molekuler. Yang bertindak sebagai penyaring adalah suatu kolom gel
yang dipersiapkan dan bahan-bahan tertentu, misalnya dekstran.
Perbedaannya dengan penyaringan biasa adalah bahwa dalam
kromatografi gel molekul-molekul yang berukuran besar akan lobs lebih
dahulu, sedangkan molekul-molekul yang kecil ukurannya akan
muncul lebih akhir.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
Bahan Penyangga
Persyaratan utama gel yang dapat digunakan pada kromatografi gel
adalah yang inert, artinya tidak bereaksi dengan atau mempengaruhi
sifat-sifat molekul-molekul yang dipisahkan atau dengan komponen-
komponen pelarut atau larutan penyangga yang digunakan.
Tiga macam gel yang banyak digunakan pada kromatografi gel
adalah dekstran, agarosa, dan poliakrilamida. Dekstran merupakan
polisakarida dengan sub-unit penyusunnya adalah glukosa.
Komponen-komponen dekstran adalah glukosa yang membentuk
ikatan satu sama lain dan bercabang pada ikatan β-1,6- glikosidik
Ada dua jenis agar, yaitu agarosa yang berisfat netral dan agaropektin
yang mengandung gugus asam (gugus karboksilat, -COOH) dan gugus
sulfat. Agarosa merupakan polimer D-galaktosa dan 3,6-anhidro-
1galaktosa, membentuk gel melalui ikatan hidrogen yang ada.
 Gel poliakrilarnida dibuat dengan mencampur akrilamida
(CH2+=CH-CO-NH2) dengan N,N’-metilenabisakrilamida (H2C=CH-
C(=O)-NH-CH2-NH- C(=0)CH=CH2). Salah satu gel poliakrilamida
yang dipasarkan adalah Bio-gel-P yang diproduksi oleh Bio-Rad
laboratories.
 Penyiapan kolom untuk kromatogrfai gel hampir tak ada bedanya
dengan penyiapan kolom untuk kromatografi adsorpsi atau partisi.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Kromatografi gel mempunyai keuntungan dan kerugian antara lain dalam

operasinya gel hampir tak dipengaruhi oleh suhu, pH, tegangan ionik, dan
komposisi larutan penyangga. Pengaruh adsorpsi hampir tidak ada
sehingga tidak mempengaruhi sifat-sifat komponen yang dipisahkan. Pada
kromatografi gel, pita-pita (daerah, zona) pemisahan lebih tegas dan
sempit daripada yang terjadi pada teknik-teknik kromatografi lainnya.
Gaya gravitasi mempengaruhi kecepatan pemisahan. Oleh karena itu
kromatografi gel berjalan lambat. Molekul-molekul yang kecil akan tidak
muncul atau munculnya memerlukan waktu yang sangat lama. Untuk
mengatasi hal tersebut dapat diberikan tekanan untuk mempercepat
aliran eluen.

PENGGUNAAN
Pada umumnya kromatografi gel digunakan untuk mengestimasi berat
molekul komponen-komponen bahan. Untuk ini diperlukan beberapa
standar dengan berat molekul yang bervariasi dan diketahui. Dalam
praktek, yang sering dikerjakan adalah menggunakan standar dengan
berat molekul 103-106 dalton. Standar dilarutkan dalam pelarut kemudian
dielusikan ke dalam kolom. Standar dengan berat molekul tinggi akan
keluar membentuk puncak kromatogram terlebih dahulu, makin kecil berat
molekulnya akan lama membentuk puncakpuncak kromatogram, dan
yang paling kecil berat molekulnya akan keluar membentuk puncak
kromatogram paling akhir.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

5. KROMATOGRAFI GAS
Ada dua macam kromatografi gas, yaitu kromatografi
gas cairan (gas liquid chromatography, GLC) dan
kromatografi gas padatan (gas solid chromatography,
GSC)

Peralatan:
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

FASE DIAM
 Innert terhadap sampel
 bahan penyangga
 bahan tabung
 tidak mudah menguap (nonvolatile)
 stabil pada suhu operasi kromatografi
 mempunyai kemurnian tinggi
 tidak tercampur oleh bahan lain

FASE GERAK
 Merupakan gas pembawa yang ditempatkan dalam
tabung bertekanan tinggi (rata-rata 40 psi) untuk
menghasilkan kecepatan aliran gas 10-100cm3/menit.
Gas pembawa harus murni (tidak mengandung uap
air, hidrokarbon, atau gas-gas lain).
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
BAHAN PENYANGGA

 FUNGSI
Fungsi bahan penyangga untuk kromatografi gas cairan
adalah sebagai bahan yang mengikat/menahan fase
diam berbetuk cairan atau gas, sedangkan pada
kromatografi gas padatan berfungsi sebagai fase diam.
 SYARAT
Innert, murni (tidak tercampur bahan lain, dan logam,
tidak mengandung silanol (Si-OH)).
 BAHAN
Bahan penyangga pada kromatografi gas cairan yang
populer adalah tanah diatome dan silika yang di dalam
perdagangan dipasarkan sebagai celite, chromosorb,
dan stermachol.
Bahan penyangga pada kromatografi gas padatan
umumnya adalah gel silika atau bahan-bahan yang
digunakan untuk kolom pada kromatografi gel.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
KOLOM

KOLOM TERTUTUP (packed column)

 Berukuran panjang 1- 20m.
 Diameter 3-10mm atau 0,125-0,375in.
 Garis tengah kolom sangat menentukan
kapasitas/kemampuannya.
 Umumnya mempunyai lapisan teoritis kurang
daripada 10.000 (rata-rata 1000- 3000/ 1m).
KOLOM TERBUKA
 Berukuran panjang 10-50m, diameter 0,2-1,2mm.
 melapisi dinding bagian dalam tabung dengan sluri
campuran bahan penyangga dengan fase diam).
 ketebalan lapisan fase diam 1pm
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
INJECTION PORT

 Tempat untuk memasukkan sampel (cair)

dinamakan injection port.
 Cara memasukkan sampel dapat secara on-
column injection atau secara flash
evaporation (biasanya hanya digunakan
untuk sampel yang mempunyai titik didih
sangat tinggi).
 Hexaport adalah ijection port untuk sampel
berbentuk gas, sedangkan injection splitter
adalah injection port untuk kolom kapiler.
 Kelebihannya Dengan alat ini dapat
dilakukan pekerjaan lainnya sementara
pemuatan sampel berlangsung.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

DETEKTOR

FUNGSI
 Fungsi detektor adalah mendeteksi komponen-
komponen yang dipisahkan setelah melalui
kolom
MACAM DETEKTOR
 Thermal conductivity detector (TCD)
 Flame ionization detector (FID)
 Hidrogen flame detector (HFD)
 Electron capture detector (ECD)
 Gas density detector (GDD)
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

6. KROMATOGRAFI KOLOM TINGKAT TINGGI

Kromatografi kolom tekanan tinggi yaitu kromatografi kolom
partisi atau adsorpsi yang menggunakan tekanan tinggi untuk
mempercepat laju gerakan larutan pengelusi dan pemisahan
komponen.

PERALATAN:
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

HUKUM DISTRIBUSI

FAKTOR RETARDASI (Rf)

Jika Vs dan Vm masing-masing adalah banyaknya (volume)
fase diam dan fase bergerak, maka pada fase bergerak:
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
Fase diam
JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
WAKTU RETENSI

Waktu retensi (tr) adalah lamanya solut tinggal di dalam sistem

kromatografi atau waktu yang diperlukan untuk mengeluarkan solut ke
dalam dan luar kolom atau juga waktu yang diperlukan untuk
membentuk puncak kromatogram sejak sampel diaplikasikan.
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

Jumlah pelat teoritis (n) dapat dihitung (lihat Gambar):

Teori Lapisan (Pelat)

Ekivalensi pelat teoritis (EPT), high equivalent to a theoritical

plate (HETP) = rasio antara panjang kolom dengan jumlah
pelat teoritisnya,

Jika nilai ekivalensi pelat teoritis kecil maka menguntungkan karena

akan menghasilkan kromatogram yang ideal
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
Menurut Van Deemter dan Gidding:

EFESIENSI KROMATOGRAFI

Menurut Van Deemter dan Gidding :

TERIMA KASIH