 Pertumbuhan semua organisme tergantung

pada ketersediaan nitrogen (misalnya asam

amino)
 Nitrogendalam bentuk dinitrogen (N2)
menyusun 80% dari udara yang kita hirup,
tetapi bentuk ini tidak dapat digunakan
karena ikatan yang sangat kuat (NN)
 Agarnitrogen dapat digunakan untuk
pertumbuhan  harus difiksasi dalam bentuk
ion ammonium (NH4) atau nitrat (NO3).
Energi Penambatan Nitrogen
 NN

 Proses penambatan N di industri pemupukan 

(100-200 atm, 400-500°C, 8,000 kcal kg-1 N)

 Penambatan biologi  Nitrogenase

(4,000 kcal kg-1 N)
 PENAMBATAN N SECARA BIOLOGI
Kemampuan menambat nitrogen hanya ditemukan
pada bakteri-bakteri tertentu:
 Bakteri yang hidup bersimbiosis dengan
tanaman legum (misalnya: soybean, alfalfa).
 Bakteri yang hidup bersimbiosis dengan
tanaman di luar legum (misalnya: Alnus sp).
 Bakteri yang hidup bebas di dalam tanah.
 Nitrogen-fixing cyanobacteria : penting
dalam memelihara kesuburan lingkungan
semi akuatik, seperti sawah.
 BEBERAPA ORGANISME PENAMBAT
NITROGEN
Free-living aerobic bacteria Free-living associative
Azotobacter bacteria
Beijerinckia
Klebsiella Azospirillum
Cyanobacteria (lichens)

Free-living anaerobic bacteria Symbionts

 Clostridium
 Desulfovibrio
 Purple sulphur bacteria
 Purple non-sulphur bacteria
 Green sulphur bacteria
Rhizobium (legum)
Frankia (Alnus sp,
Casuarina)
Organism or system N2 fixed (kg ha-1 y-1)
Free-living microorganisms
Cyanobacteria 25
Azotobacter 0.3
Clostridium pasteurianum 0.1-0.5
Grass-Bacteria associative symbioses
Azospirillum 5-25
Cyanobacterial associations
Gunnera 10-20
Azolla 300
Lichens 40-80
Leguminous plant symbioses with rhizobia
Grain legumes (Glycine, Vigna, Lespedeza, 50-100
Phaseolus) 100-600
Pasture legumes (Trifolium, Medicago, Lupinus)
Actinorhizal plant symbioses with Frankia
Alnus 40-300
Hippophaë 1-150
Ceanothus 1-50
Coriaria 50-150
Casuarina 50
RANGKING PENAMBATAN N BIOLOGI

Sistem menambat N2 Penambatan Nitrogen

(kg N/ha/tahun)
Rhizobium-legum 50 - 600

Cyanobacteria-lichen 10 - 300

Rhizosphere 5 - 25
associations
Free- living 0.1 - 25
 Semua bakteri penambat nitrogen
menggunakan kompleks enzim yang sangat
peka, yaitu: Nitrogenase.

 Nitrogenase terdiri dari 2 komponen: iron-

sulfur protein dan molybdenum-iron-sulfur
protein.

 Organisme aerobik menghadapi tantangan

khusus dalam menambat nitrogen karena
nitrogenase menjadi non-aktif jika oksigen
bereaksi dengan komponen besi (Fe) dari
protein.
 Fd(ox) FeMo Cofactor

Fd(red) N2 + 8H+
8e-

nMgATP 2NH3 + H2

nMgADP + nPi 4C2H2 + 8H+ 4C2H4

Dinitrogenase reductase Dinitrogenase

N2 + 8H+ + 8e- + 16 MgATP  2NH3 + H2 + 16MgADP

Bakteri Penambat Nitrogen
Yang Hidup Bebas
PENDAHULUAN
 Bakteri penambat N yang hidup bebas dan tidak bersimbiosis
 Winogradsky (1883): Clostridium pasteurianum
 Beijerinck (1901): Azotobacter sp.
 Wilsdon dan Barkat Ali (1923), Sen (1929), Vyas (1934):
Asosiasi Azotobacter dengan akar tanaman meningkatkan
jumlah N di tanah dan tanaman
 Mishustin dan Shilnikova (1969): Di USSR, inokulasi
Azotobacter pada tanah dapat meningkatkan hasil tanaman
sampai 12%

IDENTIFIKASI
 Aerobik, meski dapat tumbuh pada kondisi oksigen
tereduksi
 Morfologi sel: batang sampai coccoid
 Diameter: 2 um atau lebih
 Sel-selnya muncul secara tunggal, membentuk rantai atau
berkelompok
 Tidak membentuk endospora, tp membentuk kista
berdinding tebal
 Gram negatif
 Motil: flagela peritrichous atau non-motil.
 Kadang membentuk “capsular slime”
 Menghasilkan pigmen larut air:
fluorescent hijau-kuning, merah-violet
atau hitam-coklat
 Suhu optimum: 20-30oC
 pH: berkisar 5.5 – 8.5; optimum: 7.0–7.5

TAXONOMI
 Famili Azotobacteraceae:
Azotobacter
Azomonas
 Genus Azotobacter: 6 spesies:
A. chroococcum, A. vinelandii,
A. armeniacus, A. paspali, A. beijerickii,
A. nigricans
 Meskipun Penambat N, tetapi dapat menggunakan sumber N yang
lain: ammonia, urea dan nitrat

 Heterotrofik: sumber energi: gula, alkohol dan asam organik

 Azotobacter dibedakan berdasarkan: morfologi sel, pigmentasi,

penggunaan karbon, produksi “extracellular gum”, pembentukan
kapsul, toleransi terhadap pH, pembentukan kista dan motilitas

 Motil (flagela peritrichous): A. chroococcum, A. armeniacus dan

A. paspali
Non-motil: A. beijerickii, A. nigricans, dan A. vinelandii

 Pigmen hijau kuning: A. vinelandii dan A. paspali

Pigmen merah-violet atau hitam coklat: A. nigricans, A.
armeniacus
 Intensitas pigmentasi berhubungan dgn kapasitas penambatan N

**Spesies dengan pigmen gelap menambat lebih banyak N**

 Rao (1972): pigmentasi ini disebabkan oleh oksidasi thyrosine oleh

thyrosinase (enzim yang mengandung copper)
 Menghasilkan sejumlah bahan yang dapat merangsang
pertumbuhan tanaman (growth promoting subtances):
thiamine, pyridoxin, riboflavin, cyanocobalamine,
nicotine, gibberelins, IAA, bahan anti fungi

ISOLASI DAN EKOLOGI

Isolasi Azotobacter menggunakan medium bebas N
menurut Claus dan Hempel (1971)

Komposisi medium : K2HPO4 900 mg

KH2PO4 100 mg
MgSO4.7H20 100 mg
CaCl2.2H20 100 mg
Na2MoO4.2H20 5 mg
FeSO4.7H20 12.5 mg
Air destilata 1000 ml
Mannitol 5g
 5-10 g tanah + 30 ml medium cair bebas N, diinkubasi
pada suhu 28o C selama 2-3 hari. Bila terjadi pertumbuhan,
pindahkan (1 ml) ke medium baru dengan komposisi yang
sama, dan diulang sampai betul-betul terseleksi, kemudian
digoreskan ke medium agar. Koloni yang diperoleh,
kemudian dideterminasi menurut Bergey’s Manual
 Azotobacter ditemukan pada tanah netral sampai alkalin, di
lingkungan akuatik, rhizosphere maupun phyllosphere
 A. chroococcum paling banyak ditemukan di tanah
UJI KEMAMPUAN PENAMBATAN N
 Didasarkan pada produksi gas ethylene (C2H4) oleh
Azotobacter di dalam medium cair

50 ml medium bebas N  diinokulasi 0.5 ml

suspensi Azotobacter. Biakan diinkubasi di
“shaker” (150 rpm) pada suhu 28 oC selama 7
hari. Setelah masa inkubasi, aktivitas
nitrogenase diukur dengan menghitung produksi
gas C2H4 menggunakan metode ARA

 Semakin tinggi produksi gas ethylene, semakin

tinggi aktivitas nitrogenase, semakin tinggi aktivitas
penambatan N
APLIKASI AZOTOBACTER

 Azotobacter  aplikasi di lapang  bahan pembawa (carrier)

 Bahan-bahan pembawa:
Kompos, gambut, pupuk kandang, tanah, mineral liat (zeolit,
kaolin, betonit), arang, batubara muda, dll.
 Azotobacter + bahan pembawa pupuk hayati (biofertilizer)
 Produksi massal sel Azotobacter :
Azotobacter diinokulasikan pada medium cair bebas N,
diinkubasi selama 3-7 hari menggunakan “shaker” atau
fermentor sampai terjadi pertumbuhan bakteri
 Biakan dicampur dengan bahan pembawa, dan segera
dikemas dalam kantung polythene
 Nomor dan tanggal kadaluwarsa harus dicantumkan dalam
setiap kantung  6 bulan
 Jumlah sel: 107 - 108 sel/ g BK bahan pembawa (sebelum
kadaluwarsa)
 Dosis pupuk hayati Azotobacter yang direkomendasikan:
20 kg/ha, dapat mengurangi kebutuhan N sampai 50%

 Aplikasi 3 kali setahun:

I : 20 kg/ha  10 kg + pupuk organik aplikasi ke tanah
10 kg semprotkan ke daun
II : 15 kg/ha  semprotkan ke daun
III : 15 kg/ha  semprotkan ke daun

HASIL PENELITIAN

 Azotobacter chroococcum yang diinokulasikan bersama dengan

Pseudomonas pelarut P dapat meningkatkan serapan hara N dan
P tanaman jagung sampai 120% dibandingkan kontrol

 Inokulasi ganda ini juga lebih baik bila dibanding dengan

inokulasi tunggalnya (Widyastuti, 1995)
Bakteri Penambat Nitrogen
Yang Hidup Bebas
 Azospirillum : Azote (Nitrogen) dan Spirillum (spiral)

 Beijerinck (1925) :Spirillum lipoferum

 Becking (1963) : S. lipoferum mampu menambat N2

 Bulow dan Dobereiner (1975), Subba Rao, et al. (1979):

potensi penambatan N2 oleh tanaman rerumputan akibat
aktivitas S.lipoferum pada akar tanaman tersebut

 Di India: Penelitian lebih mendalam mengenai bakteri ini,

termasuk fisiologi dan ekologi dari bakteri ini

 Tarrand et al. (1978): merevisi nama bakteri: Azospirillum

Metode Pelipatgandaan (Enrichment)
 Sumber isolat: potongan akar (0.5 cm) atau beberapa mg
contoh tanah
 Bahan tsb. diletakkan pada medium agar setengah padat
di dalam botol kecil yang mempunyai skrup
 Diinkubasi pada suhu 20 – 30 oC selama 2 hari
 Pelicles Azospirillum dapat dilihat 1-2 mm dibawah
permukaan medium

PENENTUAN JUMLAH
Metode MPN
 Dibuat suatu pengenceran kelipatan 10. Sebanyak 0.1 ml
dari tiap pengenceran ditempatkan di tengah-tengah
tabung bertutup rapat berisi media semi padat
 Adanya Azospirillum dilihat dari adanya pelicles dan tes
reduksi Acethylene (C2H2)
Komposisi Medium Spesifik untuk Mengisolasi Azospirillum
(g/l)
a. Buffer fosfat
K2HPO4 6.0
KH2PO4 4.0
Air destilata 500 ml

b. MgSO4 0.2
NaCl 0.1
CaCl2 0.02
NH4Cl 1.0
Asam malat 5.0
NaOH 3.0
Ekstrak Yeast 0.05

MnSO4 0.001
Na2MoO4 0.002
H3BO3 0.0014
Cu(NO3)2 0.0004
ZnSO4 0.0021
FeCl3 0.002
Air destilata 500 ml
Bromothyl biru 2.0
 Pellicles berwarna putih,
padat dan berombak. Pd
medium semi padat dlm botol
tampak tipis
 Gram negatif
 Bentuk sel: batang yang
melengkung (setengah spiral)
 Motil: flagela lateral, bergerak
berputar
 Mikroaerofilik

Dua spesies Azospirillum:

1. A. lipoferum
2. A. brasilense
A. lipoferum A. brasilense
Glucosa: sumber C  Tidak mampu
menggunakan glucosa
Biotin: untuk tumbuh sebagai sumber C
Ukuran sel: 1.4-1.7 um  Tidak memerlukan vitamin
pada media malat semi  Ukuran sel: 1.0 um,
padat bebas N pendek, vibroid
Sel berbentuk helical  Motil
 Biakan tua: sel berbentuk S
Tidak motil
 Dijumpai di tanah-tanah tropika
 Jenis tanaman dan juga pH menentukan ada tidaknya
Azospirillum dan aktivitas nitrogenasenya
 Misalnya: Pada rhizosfer Penicum purpureum ber-pH 5.6-
7.2, terjadi aktivitas netrogenase maksimum (6.7-7.0)
 Menyukai tanah berbahan organik tinggi

Fisiologi
 Azospirillum tumbuh dengan
- Baik : malat, suksinat dan laktat
- Sedang : galaktosa dan asetat
- Kurang : glukosa dan sitrat

 Uji Kemampuan Penambatan N2:

1. Tes Reduksi Asetilen (ARA)
2. Pengambilan Gas 15N2
 Penambatan N2 paling baik: kondisi mikroaerofilik
pengocokan menyebabkan aktivitas nitrogenase terhenti
 Di dalam medium NH4+  bersifat aerobik, tumbuh
dengan baik, tetapi tidak mampu menambat N2
 Jumlah “agar” dalam medium mempengaruhi
pertumbuhan dan aktivitas bakteri ini  optimum : 0.05 –
0.17%

Pemeliharaan dan Perbanyakan

Pemeliharaan
 medium agar mengandung NH4Cl (Okon et al. 1976)
 medium semi padat mengandung malat, menggunakan
tabung bersekrup

Perbanyakan:
 Botol berisi medium Okon, diinkubasi di atas mesin
pengocok yang berputar pada temperatur 35 oC
 Dipanen setelah 3 hari dan dicampur dengan bahan
pembawa
Bahan Pembawa Ketahanan Hidup
(minggu)
1. Tanah 1
2. Pupuk Kandang (Pukan) 31
3. Tanah + Pukan (1:1) 31
4. Tanah + Pukan (1:9) 15
5. Tanah + Sukrosa (9:1) 1
6. Tanah + Sukrosa (9:4) + 100 mg K2HPO4 1
7. Tanah + Na-malat (9:1) 1
8. Tanah + Na-malat (9:4) + 100 mg K2HPO4 1
9. Arang 1
10. Pukan + Arang (1:1) 31
11. Pukan + Arang (1:1) + 100 mg K2HPO4 15
12. Gambut India 2
Tanaman Varietas mg N2 yang ditambat
per- g subtrat

1. Padi (Oryza sativa) Mudhu 28

Mashuri 20

2. Sorgum (Sorghum bicolor) CSH2 20

CSV5 16

3. Jagung (Zea mays) Tak dikenal 24

4. Panicum sp. 28
5. Cynodon dactylon 36
6. Seratia sp. 12
7. Amaranthus spinosa 16
Perlakuan Padi Barley Gandum Oat
Jerami Gabah Jerami Gabah Jerami Gabah Biomassa

Kontrol 155.9 15.8 22.5 24.5 7.6 11.5 44.5

(tanpa inokulasi,
tanpa N)

A. brasilense 200.1 20.9 44.4 37.8 21.6 15.0 51.4

40 kg Urea 237.9 33.9 22.9 25.2 21.9 19.2 49.9

40 kg Urea + 386.1 41.8 59.8 61.0 32.2 33.3 -

A. brasilense

60 kg Urea 436.7 48.1 31.1 29.8 21.9 31.1 -

60 kg Urea + 472.2 54.4 93.2 69.1 35.0 33.5 -

A. brasilense

120 kg Urea 572.8 68.9 33.2 32.9 27.2 27.2 -

120 kg Urea + 645.1 70.0 46.5 40.2 23.9 27.5 -

A. brasilense
Hasil biji gandum Cultivar BR-2 yang diinokulasi dengan
Azospirillum sp Strain RAM-7

Perlakuan Hasil (gram/pot)

Kontrol 4.16 f
Inokulasi (In) 5.01 f
In + 20% N 6.32 e
In + 40% N 8.61 d
In + 60% N 11.00 c
In + 80% N 13.12 b
In + 100% N 15.52 a
100% N 14.64 b

Sumber: Dalla Santa, O.R. et al (2004)

TERIMA KASIH