Teknologi Produksi Biofertilizer

Fiksasi N Non Simbiotik

Fiksasi N oleh bakteri yg tdk berassosiasi dg tanaman
●Azotobacter & Azospirillum : memfiksasi N dg nonsimbiotik.
●Hasil Fikasasi N nonsimbiotik lebih rendah dari fiksasi N
secara simbiotik.
Manfaat Bakteri Nonsimbiotik
(a) Tidak mempunyai bahaya atau efek samping,
(b) Efisiensi penggunaan pupuk anorganik dpt ditingkatkan
shg bahaya pencemaran lingkungan dpt dihindari,
(c) Harganya relatif murah
(d) Teknologinya relatif sederhana
 Fiksasi N NonSimbiotik
Tidak memerlukan tanaman inang

• Jlh N yg difiksasi < dibanding simbiotik

• Bakteri (aerobes): Azotobacter, Azomonas, Derxia,
Azospirillum, Beijerinckia,
• Bakteri (Fakultatif anaerob): Bacillus, Enterobacter,
Klebsiella. Pseudomonas, Aerobacter,
• Bakteri (anaerob): Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum
• Bakteri fotosintetik:, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas,
Chlorobium
• Blue-gree algae (Cyanobacteria).
 Potensi Rizobakteri
Azotobacter

Azotobacter ad.bakteri dari famili Azotobacteraceae :

Ada 3 spesies genus Azotobacter : A.chrococcum. A.agillis,
A.vinelandii
Ciri : - aerobik, gram negatif, bentuk kokkus, tanpa endospore sel,
bergerak dg flagel yg terdpt pd pinggir(peritrik)
- hidup bebas didaerah perakaran,
- mampu menfiksasi nitrogen
• Bersifat katalase positif, spesies seperti A. Chroococcum
memiliki pigmen hitam-coklat yg tidak larut,
• Pada medium padat koloni Azotobacter berbentuk
bulat, convex, halus, semi opaque, kebasahan (moist),
• Berwarna putih, bening sampai keruh dan kadang-
kadang putih kecoklatan.
• Koloni mempunyai diameter antara 0,5-4 mm.
• Sel berukuran besar (diameter 2-4 μm)
• Berbentuk batang
• Peka terhadap pH rendah, dpt pd kisaran pH 4,5 - 8,5,
optimal pH7-7,5
• Suhu optimum untuk pertumbuhan 30 Cͦ
• Bakteri ini terdapat di tanah dan di air.
• Pada media yg mengandung karbohidrat, kapsul tambahan atau
lapisan lendir diproduksi oleh Azotobacter.
• Azotobacter ad. bakteri obligat aerob, enzim nitrogenase yg
yaitu enzim yg mengkatalisis pengikatan N₂, sensitif terhdp O₂.
• Diduga karakteristik Azotobacter yg mempunyai kapsul lendir
tebal membantu melindungi enzim nitrogenase dari O₂.
• Azotobacter dpt membtk struktur sel istirahat yg disebut kista.
• Adanya btk kista dr Azotobacter shg resisten terhdp proses
pengeringan, penghancuran mekanik, ultraviolet, & radiasi.
Namun, tidak seperti endospora, kista Azotobacter tidak
resisten terhdp panas.
 Eksplorasi dan Isolasi

• Azotobacter sp. dpt diisolasi dr perakaran & tanah sekitar

perakaran berbagai jenis tanaman pangan, hortikultura,
& perkebunan.
• Sampel akar & tanah dr lapangan, 2 g dimasukkan ke
dalam media Ashby & diinkubasi pd 30⁰C ± 4-7 hari s/d
terbentuk pellicle pd permukaan media.
• Isolasi Azotobacter sp. dilakukan dari pellicle dg metode gores
pd media agar Ashby, kemudian diinkubasi pada suhu 30⁰C
selama 3-4 hari.
• Amati pertumbuhan koloni yg terbentuk, lalu
dilakukan pemurnian isolat pd media yg sama.
Komposisi medium Ashby (Sumber: Rao, 1982)

Komponen Berat/volume
Mannitol 20,0 g
K₂HPO₄ 0,2 g
MgSO₄7H₂O 0,2 g
NaCl 0,2 g
K₂SO₄ 0,1 g
CaCO₃ 5,0 g
Agar 15,0 g
Akuades 1000 ml
• Azotobacter : agen biologis pemiksasi N2 NH3 melalui
reduksi N menjadi ammonia secara enzimatik yg dikatalisir
oleh enzim nitrogenase.
• Sumber N untuk pertumbuhan dpt dipakai N₂,
ammonium, nitrat, nitrit, urea & senyawa N organik.
N ad. UH yg membatasi produktivitas tanaman shg N selalu
ditambahkan sbg input dl produksi tanaman.
• Inokulasi Azotobacter untuk meningkatkan ketersediaan
N tanah hasil yg bervariasi.
Kemampuan Azotobacter dl memfiksasi N₂ diketahui pertama
kali oleh Beijerinck pd tahun 1901 (Page 1986).
Efisiensi penembatan N rendah 5 – 20 mg N₂ yg ditambat/g
gula yg dioksidasi.
Kontribusi rizobakteri hidup bebas terhdp N tanah ± 15 kg
N/ha/th < bakteri pemfiksasi N simbiosis 24-584 kg N/ha/t
(Shantharam & Mattoo 1997).
 Produksi Fitohormon
• Azotobacter memproduksi fitohormon sitokinin & auksin,
dilaporkan pertama kali oleh Vancura & Macura pd th
1960 (Vancura 1988).
• Rizobakteri Azotobacter. chroococcum, A. beijerinckii, A.
Paspali & A. Vinelandii memproduksi fitohormon terutama
sitokinin.
• Abbass and Okon (1993b) : kemampuan A. Paspali
meningkatkan pertumbuhan tanaman terkait dg kapasitasnya
dl mensistesis faktor tumbuh.
• Kemampuan Azotobacter dl memproduksi hormon sitokinin
& giberelin sangat menguntungkan sebab kedua fitohormon
tsb berperan dl perkembangan & pembelahan sel (Taiz &
Zeiger 1991).
• Azotobacter sp. dpt menghasilkan senyawa ekstraseluler
dl kuantitas tinggi dl bentuk lendir (slime) s/d bentuk
cyste, berupa alginat & polisakarida.
• Azotobacter juga mengekskresikan senyawa biostimulan
seperti tiamin, riboflavin, piridoksin, sianokobalamin, nikotin,
indole acetic acid, giberelin dan asam pantotenat (Subba Rao,
1987).
• Azotobacter sp, mampu mensintesis substansi seperti vit. B
& asam indol asetat (Ahmad et al., 2005).
• Azotobacter sp. dikenal sbg PGPR (Plant Growth Promoting
Rhizobacteria), yaitu bakteri yg dpt merangsang
pertumbuhan tanaman karena mampu memfiksasi N₂ &
memproduksi fitohormon, antara lain auksin (IAA), sitokinin,
dan giberelin (GA) (Hindersah dan Simarmata, 2004).
• Azotobacter chroococum AC04 mampu menggunakan
berbagai jenis sumber karbon (dari mono sampai
polisakarida), asam organik dari alifatik & aromatik asam
lemak, etanol, manitol, aseton, & beberapa asam organik
volatil (Subba Rao, 1987).
 Tabel. Penambatan N molekular di dalam medium biakan

Mikroorganisme Kondisi Masa inkubasi N yg

(hari) ditambat
(ugN/ml)
Azotobacter aerob 3 1050
vinelandii
Klebsiella anaerob 2 60
pneumoniae
Clostridium anaerob 10 136
butyricum
Chlorobium anaerob 5 20
Rhodospirillum cahaya 10 76
Sumber; Tedja Imas at al, 1989
Beberapa kelebihan Azotobacter :
1. Menghasilkan amonia, vitamin dan senyawa yang
meningkatkan perkecambahan benih (Brown, 1975;
Narula et.al., 1981; Narula and Tauro, 1986).
2. Menghasilkan IAA, GA dan sitokinin yg dpt meningkatkan
pertumbuhan akar & absorbsi hara (Martinez-Toledo et
al. 1988; Neito & Frankenberger, 1989; Verma et al.,
2001)
3. Menghambat pertumbuhan cendawan patogen dg
menghasilkan senyawa anti cendawan (Sharma &
Chahal, 1987; Verma et. al. 2001).
4. Menghasilkan siderophores yang melarutkan Fe⁺³
(Neiland, 1981; Knosp, et al. 1984; Page & Huyer, 1984;
Page, 1987; Suneja & Lakshminarayana, 993; Suneja et
al., 1996).
• Azotobacter sp., diisolasi dari rizosfir tomat, yg dikulturkan
di media bebas N mengekskresikan fitohormon GA sebanyak
13.57 µg/mL & sitokinin sebanyak 10.13 µg/mL (Hindersah et
al, 2001).

• Pada kultur isolat Azotobacter yang diisolasi dari rizosfir

bibit lettuce memperlihatkan adanya 0.04 ppm sitokinin, 1.9
ppm GA tetapi tidak terdeteksi adanya auksin (Hindersah et
al, 2003).
• Azotobacter juga memilki potensi untuk mengeskresikan
senyawa eksopolisakarida (EPS) & as.organik yg dpt
berfungsi sbg bioremediasi tanah yg tercemar logam berat
(Hindersah dan Sudirja, 2010).
 Aplikasi
• Inokulan Azotobacter diperbanyak dl kultur cair bebas N
• Diaplikasi dg cara menyiramkan ke daerah perakaran.
• Inokulan cair, memiliki kelebihan yaitu selama inkubasi
untuk memperbanyak sel bakteri, kondisi media yg
bebas N mendorong ekskresi N tersedia hasil fiksasi
bakteri ke dl media & menginduksi pembentukan
fitohormon.
• N tersedia, fitohormon serta sel bakteri, merupakan
komponen penting untuk mempertahankan fungsi
tanah sbg media tumbuh tanaman.
• Kelompok tanaman paling banyak memanfaatkan
fitohormon ad. tanaman hortikultura, pangan, industri,
perkebunan & tanaman kehutanan (Manurung, 1987).
• Inokulasi pd jagung, gandum, kentang, kol, tomat,
kapas kadang meningkatkan hasil kadang tdk.
• Mikroba tanah tidak hanya menambat N ttp juga
menghasilkan berbagai senyawa organik seperti
PGRs
• Mikroba PGRs sangat bermanfaat bagi
perkecambahan benih, perkembangan &
proliferasi akar, shg penyerapan hara & air
menjadi lebih efisien.
• PGRs ad.bahan organik non hara yg mempengaruhi
proses fisiologis tanaman pd konsentrasi yg
rendah.
 Azospirillum

Beijerinck th 1925 melaporkan suatu spesies bakteri yg dpt

menambat N yaitu Spirillum lipoferus Azospirillum
oleh Tarrand et al., 1978.

Manfaat Azospirillum (Okon, 1985b):

1. Mendorong pembentukan rambut akar & percabangannya
2. Meningkatkan serapan N, P, K & microelement;
3. Memperbaiki status air pd tanaman (toleran kering)
4. Meningkatkan akumulasi bhn kering & produksi
Ciri Azospirillum
• Azospirillum ad. bakteri gram negatif,
• Berbentuk batang & berukuran 1μm (diameter),
• Aerobik, kemoorganotrop non-fermentatif,
• vibroid & memproduksi fitohormon, utamanya auksin,
• Bergerak dg flagella polar.
• Dpt menggunakan bbrp sumber C terutama gula & gula alkohol
• Bakteri ini hidup pd lingkungan & tanaman yg beraneka (tan.
sereal, tebu, rumput, kopi, buah-buahan & bunga-bungaan).
• Jika ditumbuhkan pd media agar MPSS akan terbtk
flagella lateral & koloni dark pink
Diantara spesies yg ada, 2 spesies yg paling banyak dipelajari, yaitu
A. Brasilense & A. Lipoferum yg terdpt dl jlh banyak di dlm tanah,
khususnya di daerah tropis. Berasosiasi dg tan. rumput, jagung,
padi, sorgum, tebu, & bbrp tan.lain.
Ada 5 species Azospirillum :
o A. Brasilense (tdk dpt menggunakan glukosa sbg sumber C)
o A. Lipoferum (dpt menggunakan glukosa sbg sumber C)
o A. Amazonese
o A. Halopraeferens
o A. Irakense
Infeksi oleh Azospirillum tdk menyebabkan perubahan morfologi
perakaran, meningkatkan jlh akar rambut shg lebih berperan
dl penyerapan hara.
Azospirillum spp, sgt adaptif, dpt tumbuh pd kondisi :
• Anaerobic conditions (nitrate used as electron acceptor)
• Microaerobic (elemental or ammonia used as N source)
• Fully aerobic conditions (ammonia, nitrate, amino acid
or combined N only)
 Isolasi
Isolat Azospirillum sp dpt diperoleh dr tanah & akar.
Tanah atau akar media agar semi padat (0,05 – 0,17%
agar) Media utk isolasi ad. media spesifik, seperti berikut.
a. Buffer fosfat g/l g/l
K2HPO4 6
KH2PO4 4
Air destilasi 500 ml
b. MgSO4 0,2
NaCl 0,1 Na2MoO4 0,002
CaCl2 0,02 H3BO3 0,0014
NH4Cl 1,0 Cu(NO3)2 0,0004
As.malat 5,0 ZnSO4 0,0021
NaOH 3,0 FeCl3 0,002
Ekstak ragi 0,05 Air destilasi 500 ml
MnSO4 0,001 Bromothyl biru 2,0

Modifikasi media Okon at al,1977 oleh Laksmi at al, 1980

.
• Kontribusi fiksasi N₂ dr Azospirillum pd tanaman sedikit, ± 5 -
18% dr total peningkatan tanaman.
• Aktivitas enzim nitrogenase dr Azospirillum meningkat jika
ditumbuhkan dl kultur campuran dg bakteri lain. Contoh
pd campuran A. brasilense Cd dg bakteri Staphylococcus
sp. yg meningkatkan fiksasi N₂ dr A. brasilense.
• Azospirillum dpt berperan sbg agen biokontrol terhdp patogen
tanaman dl tanah. Azospirillum lipoferum menghasilkan
catechol siderophores pd kondisi kekurangan besi,
menunjukkan aktivitas antimikroba terhdp bbrp isolat bakteri &
jamur.
• Contoh lain, isolat Azospirillum ditemukan menghasilkan
bakteriosin yg menghambat pertumbuhan beberapa bakteri.
Namun demikian, ada juga penelitian yg melaporkan bhw
bbrp strain Azospirillum tdk menghasilkan senyawa anti
patogen.
Dobereiner, et al 1976. menemukan Azospirillum dl tanah di
Afrika dan Brasil (trofika) dan di India oleh Laksmi et al, 1977.
pH tanah (pH 5,2 – 7,2) dimana Azospirillum ditemukan, ditandai
dg adanya aktivitas nitrogenase disekitar akar.
Laksmi et al, 1977, menyimpan contoh tanah s/d 15 th dg
kelas tekstur bermacam-macam & dg kadar bhn organic yg
beragam semuanya mengandung Azospirillum kecuali tanah
dg pH < 5,7.
Azospirillum menghendaki tanah dg kadar bhn organic banyak
 Pemeliharaan & Perbanyakan
Pemeliharaan:
1. Medium agar + NH4Cl (Okon et al., 1976)
2. Medium semi padat + malat
Perbanyakan
Medium Okon et al (1976) inkubasi (3 hari, 35oC) + bhn
pembawa (Campuran tanah + pupuk kandang (1:1))

Penambatan N tanaman yg akarnya terdpt Azospirillum lipoferum:

1. Pd Tanaman padi, N₂ yg ditambat 20 – 28 mg N₂/g substrat
2. Sorgum, N₂ yg ditambat 16 – 20 mg N₂/g substrat
3. Jagung, N₂ yg ditambat 24 N₂/g substrat
Aplikasi
• Azospirillum dpt bersinergi dg mikroba lain.
• Dual inokulasi tanaman legum dg Azospirillum & Rhizobium
didpt kan meningkatkan bbrp peubah pertumbuhan
tanaman dibanding d inokulasi tunggal.
• Azospirillum dianggap membantu Rhizobium dg cara
menstimulasi nodulasi, fungsi nodulasi, &
kemungkinan metabolisme tanaman.
• Fitohormon yang dihasilkan oleh Azospirillum memacu
diferensiasi sel epidermis pd rambut akar, hal ini
meningkatkan jlh tempat yg berpotensi bagi infeksi
Rhizobium.
• Percobaan lapangan, dg inokulasi kultur campuran Azospirillum
dg Rhizobium secara nyata meningkatkan jlh total nodul, berat
kering nodul, jerami, & meningkatkan hasil biji. Interaksi ini
lebih kuat jika ada bhn organik pd media tumbuh tanaman
(Cassa´n, 2011).
• Aplikasi Azospirillum dpt meningkatkan hasil 5 - 30%.
• Faktor keberhasilan utama ad. aplikasi sel hidup secara hati-
hati. Sel bakteri haruslah diambil pd fase eksponen, bukan
dari inokulum pd fase stasioner.
• Walaupun, inokulasi lapangan belum menjadi area utama
dari penelitian Azospirillum saat ini, bbrp percobaan lapangan
& rumah kaca pd sereal, menunjukkan potensial yg
menjanjikan (Bashan & Holguin, 1997).
• Di Italia, Jerman, & Belgia, produk yg mengandung campuran
A. brasilense (strain Cd) dan A. lipoferum (strain Br17)
diformulasikan dl campuran vermikulit atau formula larutan &
merekomendasikan pengurangan 30 – 40% pupuk N bagi
tanaman.
• Di Perancis, AzoGreenTM digunakan pd jagung dg
kenaikan hasil 100%.
 Respon tanaman terhdp inokulasi Azospirillum

Hasil (ku/ha) % peningkatan

Tanaman Dosis N
Tanpa Dengan hasil
Padi 0 23,75 41,95 76,7
40 53,75 63,06 17,3
60 60,42 63,19 4,6

Gandum 0 37,78 38,96 3,1

40 45,39 45,76 0,8
80 49,38 57,53 16,5
120 49,97 62,88 27,1
Subba Rao, 1982