UJI STERILITAS

Asas : proses sterilisasi yang tepat

perlu dimonitor (in production
control) karena inilah yang
menentukan steril tidaknya suatu
sediaan
Kontrol proses sterilisasi
1. Pengukuran fisika
- suhu yang tepat (otoklaf, oven)
- tekanan (otoklaf, ster.gas)
- kelembaban (ster.gas)
- “Bubble Pressure test”
NB: peralatan harus dikalibrasi dengan cermat

2. Indikator kimia
ikut disterilkan dan menunjukkan perubahan apabila
kondisi yang diinginkan tercapai.
 a. Browne’s steriliser control tubes
tabung kecil tertutup yang mengandung campuran zat
dan indikator, suhu tinggi menghasilkan perubahan
warna dari merah-kuning-coklat-hijau. (warna hijau
timbul setelah waktu sterilisasi dan suhu tertentu
tercapai)

Jenis untuk Warna hijau setelah :

1. Block spot Otoklaf hingga 126o ≥25’(115o), ≥16 (120o), ≥11’ (125o)
2. Yellow spot High-vac.autoclave ≥4’(130o), ≥3’ (125o)
pada ≥ 130o
3. Green spot Oven pada 160o ≥60’(160o)
4. Blue spot Oven IR pada 180o ≥12’(180o)
b. Filter paper strip
Strip kertas saring yg salah satu ujungnya dicelup dgn 2-4-
dinitrofenilhidrazin. Pada suhu sterilisasi tertentu meleleh dan
akan merambat ke atas. Jarak yg ditempuh menunjukkan waktu
dan suhu sterilisasi.

c. Royce sachet
Khusus utk ster. dgn gas etilenoksida. Kantong polietilen
mengandung MgCl2, HCl dan biru bromfenol. Etilenklorohidrin yg
terbentuk-kuning-ungu

d. Dosimeter radiasi
Paling tepat utk kontrol ster.dgn radiasi. Dibuat dari polimetil
metakrilat merah atau nilon polivinilklorida bentuk slide. Setelah
digunakan, perubahan densitas optik karena radiasi diukur
dengan spektrofotometer cahaya tampak. Untuk radiasi 0,1 – 5,0
Mrad
3. Indikator Biologik
- Dibuat suspensi spora bakteri yg jumlah (antara 105 -
107) dan daya tahannya diketahui
- Suspensi spora ini dioleskan pada strip yg setelah
kering dimasukkan ke dalam sampul plastik atau
tabung yg diikutsertakan pada saat sterilisasi
dilaksanakan.
- Setelah sterilisasi selesai, diinkubasi dan jumlah
bakteri hidup dihitung.
a. Sterilisasi uap untuk barang kering
Strip mengandung Bac. stearothermophillus (FI IV).
Inkubasi (setelah ikut dister.) pd 65o selama 3-5 hari
dlm perbenihan (triptone soy broth).
b. Sterilisasi uap untuk larutan air
Ampul yg mengandung suspensi spora Bac.
Stearothermophillus. Inkubasi : sda
Lanjutan indikator biologik…

c. Sterilisasi dlm oven

Bac. subtilis var. niger (FI IV) atau Clostridium
sporogenus dikeringkan pd pasir steril, alumunium foil
strip, stainless steel atau gelas. Inkubasi
(Cl.sporogenes) pd 37o selama 5 hari dlm perbenihan
cair tioglikolat.

d. Radiasi
Strip yg mengandung Bac.pumilus (FI IV) kering.
Inkubasi pd 35-37o selama 5 hari dlm perbenihan
glukosa. Strept.faecium jg dapat dipakai.

e. Etilenoksida
Strip dgn Bac.subtilis (FI IV). Inkubasi pd 35o selama 5
hari dalam perbenihan glukosa
Pengambilan Sampel utk Uji Sterilitas
 Arti bets (Batch) menurut FI IV :
Sediaan yg disterilkan dlm otoklaf; isi seluruhnya = 1
bets. Sediaan yg disterilkan secara berkesinambungan
(mis.radiasi berkas elektron ) : 1 bets adalah semua
sediaan yg disterilkan menurut cara tsb tidak lebih dari
24 jam.

 Pengambilan sampel (sampling) wadah menurut FI IV-

hlm 111:
sediaan yg dibuat secara aseptik yg diisi dlm waktu ≤ 24
jam secara kesinambungan, diambil pada waktu-waktu
tertentu : jumlah min 20 wadah, maks 100 wadah. Untuk
bets kecil (aseptik atau non-aseptik) : 20-200 wadah
diambil 10%. Jika jumlah sediaan ≤ 20 wadah diambil
minimal 2 wadah.
NB :

 Sampling menurut WHO : 0,4 √N;

 N = jumlah wadah/bets (≥ 3 - ≤20)
 Sampling menurut Eur.Pharm (inj) :
- bets ≤ 100, diambil 10 % atau 4 wadah (yg mana yg
lebih besar)
- bets 100-500, diambil 10 wadah
- bets ≥ 500, diambil 2 % atau 20 wadah (yg mana yg
lebih besar)
Pengambilan jumlah ml untuk inokulasi (FI
IV, hlm 859)
Isi wadah (ml) Vol.min Vol.min tiap media Juml wadah
diambil dr tiap per media
wadah utk tiap Digunakan utk Digunakan utk
media inokulasi membran atau
langsung. Vol. yg setengah bagian
diambil dr tiap membran yg
wadah (ml) mewakili vol.total
dr jml wadah yg
sesuai (ml)

< 10 1 ml atau 15 100 20 (40 jk vol

seluruh isi jk tiap wadah
kurang di 1 ml tidak cukup utk
kedua media)
5 ml 20
10 - <50 40 100
Uji Sterilitas
 Asas pengamatan :
Larutan uji + media perbenihan, diinkubasi (30-350;
20-25o) terjadi kekeruhan/pertumbuhan --- TIDAK
STERIL
 Prosedur uji sterilitas
1) inokulasi langsung ke dlm media perbenihan
2) teknik penyaringan dengan filter membran.
(dibagi 2 bagian, lalu diinkubasi)
NB : cara 2) lebih baik drpd cara 1) karena jasad
renik dapat dipisahkan dari cairan yg mengandung
bakteriostatik atau fungistatik sebagai penghambat
pertumbuhan
 Lanjutan uji sterilitas….

 Media yg dipakai utk uji sterilitas

Jasad renik Media Mikroba Uji Suhu inkubasi

Aerob Tioglikolat cair Bac.subtilis 30 – 35o

Cand.albicans
Bacteriodes
vulgatus
Anaerob Tioglikolat Bacteriodes 30 – 35o
alternatif vugatus
Aerob Soybean-casein Bac.subtilis 20 – 25o
digest Cand.albicans
NB:
 Uji fertilitas (baik-tidaknya media); uji bakteriostatik dan
fungistatik
 Perhatikan cara inaktivasi bakteriostatik dan fungistatik :
- dengan pengenceran : benzilalkohol, klorbutanol,fenol,
klorokresol, kresol, feniletilalkohol
- dengan penambahan 0,5% lesitin murni yg disolubilisasi
dengan 3% tween-80 : garam klorheksidin, ester p-
hidroksibenzoat, senyawa amonium kuartener
- dengan penambahan 0,1% natrium tioglikolat dan
pengenceran : garam merkuri, fenil merkuri asetat/nitrat,
tiomersal.
● Inaktivasi senyawa lain :
- sulfonamida : dgn 1 mg asam p-aminobenzoat per 10 mg
sulfonamida
- penisilin dan sefalosporin: dgn penisilinase
- kloramfenikol : dgn CAT (Chloramph.acetyltranferase)
- Neomisin : dgn NaCl atau vit C
Cairan pengencer dan pembilas
Syarat : cairan ini tdk boleh bersifat antibakteri atau anti fungi
jika digunakan sbg pelarut, pengencer atau pembilas
 Cairan A
larutan 1 g digesti peptik jaringan dlm 1 L air
(disaring/disentrifus agar jernih; pH diatur 7,10,2; disterilkan
dlm botol 100 ml dgn uap air)
NB : dipakai dlm campuran dgn penisilinase utk
menginaktifkan penisilin atau sefalosporin
 Cairan D
cairan A + 1 mL polisorbat 80 per liter; pH diatur hingga
7,10,2. sterilkan dengan uap air.
NB : dipakai apabila spesimen uji mengandung lesitin atau
minyak atau utk uji alat kesehatan steril dgn lumen kecil
menggunakan filter membran
 Cairan K
digesti peptik jaringan hewan P 50 g; ekstrak daging P 3,0 g;
polisorbat 80 P 10 g; air 1000 mL, pH setelah sterilisasi dlm
uap air 6,90,2
Pelaksaan uji sterilisasi
1. Inokulasi langsung ke dalam media uji
- vol.tertentu spesimen + vol.tertentu media uji
- inkubasi selama tidak kurang dari 14 hari
- amati pertumbuhan secara visual sesering mungkin,
sekurangnya pd hari ke-3, ke-4, ke-5, ke-7 atau ke-8 dan
pada hari terakhir masa uji.
NB: jika zat uji menyebabkan media menjadi keruh, sehingga
menyulitkan pengamatan secara visual, sejumlah
memadai media dipindahkan ke dlm tabung baru yg berisi
media yang sama sekurangnya 1 kali antara hari ke-1
dan ke-7 sejak pengujian dimulai. Inkubasi media awal
dan media baru dilanjutkan hingga 14 hari sejak inokulasi
awal.
cara inokulasi digunakan utk : 1) salap dan minyak yg tdk
larut dlm isopropilmiristat; 2) zat padat; 3) kapas murni,
perban, pembalut, benang bedah, dst; 4) alat kesehatan
steril; 5) alat suntik kosong atau terisi steril
Lanjutan pelaksaan uji sterilisasi….
2. Penyaringan dengan filter membran
- Penyaringan dgn filter membran (porositas
0,22m;Ø=47mm), kecepatan aliran 55-75 mL/menit; tekanan
70 cmHg. Membran dibilas dgn larutan pepton 0,1 %.
- Membran dipotong menjadi setengah bagian (jika hanya
digunakan satu) lalu dimasukkan ke dalam
a. media tioglikolat cair; inkubasi pd 30-35o = 7 hari b.
soybean-casein digest; inkubasi pd 20-25o = 7 hari
- Yang diuji dgn cara filtrasi :
- cairan yg dpt bercampur dgn pembawa air
- cairan yg tdk bercampur dgn pambawa air
- zat padat yg dpt disaring
- salep dan minyak yg larut dlm isopropilmiristat
- alat kesehatan yg mempunyai saluran kecil
- penisilin dan sefalosporin (+penisilinase); kloramf.(+CAT)
Keuntungan cara filtrasi

 Lebih sensitif daripada cara inokulasi

 Zat penghambat dipisahkan (antibiotika,
pengawet, antioksidan)
 Volume besar tidak masalah
 Kesalahan sampling dgn derajat kontaminasi
rendah/dikurangi
 Penafsiran hasil uji sterilitas
 Tahap pertama
- Kekeruhan dan atau pertumbuhan pd permukaan ---steril Ө
- Jika hasil +, tetapi segi pelaksanaan praktis/teknik tidak
memadai---- tahap pertama diulang
- Jika hasil +, tetapi tdk terbukti uji tahap pertama tidak
absah---- lakukan tahap kedua

 Tahap kedua
- Jumlah spesimen uji : minimum 2X jumlah tahap pertama
- Jika Ө ----steril
- Jika + ----tidak steril
- Jika ada kesalahan atau teknik aseptik tidak memadai
tahap kedua diuang
addendum
 Uji sterilitas oleh Robot
Tujuan : utk mencegah hasil positif keliru (false positive)
karena uji sterilitas dilakukan oleh manusia (human error),
sekalipun dengan fasilitas/sarana yg memadai spt clean
room, LAF hoods, teknik aseptik canggih, dst.

Gagasan: peran manusia diganti oleh robot (1987)

Keuntungan :
- “human error”, kontaminasi ketika uji sterilitas
dilaksanakan, dapat dicegah, sehingga suatu bets (karena
hasil positif yg keliru) tdk perlu dimusnahkan
- uji ulang tidak perlu dilakukan lagi---ebih cepat
- biaya pengerjaan dapat ditekan
Lanjutan…

 Masalah “ hasil positif yg keliru”

- Hasil positif yg keliru lebih sering terjadi drpd hasil
positif yg benar
- Akibat hasil positif yg keliru---perlu diteliti kembali
oleh bagian QC dan bagian produksi---uji sterilisasi
diulang
a. bets tetap dikarantina---pengiriaman tertunda
b. bets mungkin dimusnahkan, menyita banyak
waktu
- Meniadakan hasil positif yg keliru dgn menggunakan
robot dan tidak lagi manusia
Penerapan robot di industri farmasi
 Hofmann La Roche (AS), 1984, yg pertama. Keistimewaan
Hofmann La Roche adalah bahwa masalah teknis mengenai
uji ster.dgn robot dipublikasi, sehingga cara ini dpt dicontoh
oleh industri lain.
 Farmitalia (Italia) menerapkan penggunaan robot menjelang
akhir dasawarsa sembilan puluhan. A.l.uji sterilitas zat padat
dlm vial
 Takeda (jepang) sekitar 1990 dimulai uji sterilisasi cairan atau
zat padat dlm vial. Sebetulnya cara takeda bukan dilakukan
oleh robot, tetapi suatu cara kerja yg lebih efisien melalui
sistem otomatisasi, yg mirip dgn desain alur produksi
 PRI Autotest 1000
dikembangkan oleh Precision Robots Incoporated (AS)
bersama milipore (1988) utk dijual, dan mirip sistem H.La
Roche.
uji sterilisasi secara filtrasi membran (Millipore Sterites) dlm
ruang kelas 10
Uji pirogenitas
 Yunani : pyrogen = product of fire
 Sejarah :
- 1876 : istilah pirogen dipakai pertama kali oleh Sir John
Burdensanderson (1860: Billbroth)
- 1926 : Seibert : “injection fever” disebabkan oleh sumber bakteri
- 1920 : Centanni : isolasi sb serbuk putih
- 1975: Wesphai, elusidasi struktur lipid A
- 1977: Galanos et al, sda
● Asal pirogen (lipopolisakarida)
- Bakteri pembentuk pirogen kebanyakan Gram-negatif---ada
kaitannya dgn dinding sel (mis.Pseudomonas, Salmonella dan
E.coli)
- Dinding sel terdiri atas 3 lapis (Gram-positif, tidak memiliki
membran luar), BM besar; endotoksin bakteri mati/hidup
Lanjutan uji pirogenitas….
 Lipopolisakarida = lipid A-polisakarida-rantai
antigen O
 Sifat pirogen
- 0,01 mcg/ml (iv)---suhu badan naik setelah 30-60
menit
- Larut dlm air, relatif termostabil, tidak dipengaruhi
oleh bakterisida
● Sumber pirogen :
a. Pelarut air
b. Zat dari bahan alam/fermentasi: glukosa, fruktosa,
na sitrat, garam fosfat, asam amino, heparin, dsb.
c. Alat-alat yg dipakai
d. Produksi sediaan parenteral harus selesai dlm
satu hari (jangan diinapkan)
Depirogenisasi
1. Endotoksin dihilangkan
a. Cara bilas dgn air bebas pirogen
b. Ultra filtrasi (membran selulosa triasetat)
c. Filtrasi molekular
d. Filtrasi dgn asbes (lalu G3)( diatas pH=2, endotoksi negatif--
-anion, asbes sebagai kation dibawah pH 8,3----terjadi daya
tarik elektrostatik; asbes juga bekerja sebagai ”depth filter”
e. Destilasi (khusus air suling bebas pirogen + KMnO4(10 mL
0,1 N) + NaOH (5 mL 1N/liter))
NB: tanpa ini juga bisa asal cipratan dicegah ikut uap---
kondensasi
f. Karbon aktif 0,1-0,3% (adsorpsi zat BM besar dan nonionik-
--lebihkan 5 % )
g. Kromatografi kolom Al2O3 (Al+3)
h. Reverse-osmosis (utk air utk inj.)
2. Endotoksin diinaktivasi

 Kalor kering (250o = 30’-USP; 170-180o = 3-4 jam)

 Kalor basah : 120o = 6-7 jam atau 140o = 1 jam (otoklaf)
 Asam/basa encer (K-bikrom + H2SO4; HNO3; soda 5%)
- 0,05 N HCl---100o = 30’
- 1% as.asetat---100o =2-3 jam
- 0,1 M NaOH---30o = 72 jam/4o = 16 jam
 Oksidasi dgn H2O2
- Larutan gelatin + 0,1 M H2O2 digodok = 2 jam atau + 0,4M H2O2-
--116o = 20’
NB: efektifitas H2O2 tergantung dari : kadar, pH, suhu dan waktu
H2O2 mengoksidasi zat berkhasiat
● Alkilasi
- + as.asetat anhidrida --- pengurangan 100x
- + as.suksinat anhidrida --- pengurangan 100-1000x
- + gas etilenoksida (12% + 88% freon; kelembaban 50%; 3,5 psi;
6,5 jam)
● Radiasi pengionan (60CO)
3. Uji pirogenitas
a. Uji bioligik (metode seibert-1920;USP XII 1942).
tertera dlm semua farmakope.
Asas (Uji pirogen-FI IV-908):
berdasarkan peningkatan suhu badan kelinci setelah
disuntikkan dgn larutan ≤ 10 mL/kg bobot badan dlm vena
auricularis.
Penafsiran hasil :
- setiap penurunan suhu dianggap nol
- memenuhi syarat: tak seekor kelincipun menunjukkan
kenaikan suhu 0,5oC atau lebih
- jika ada kelinci ---kenaikan suhu 0,5oC atau lebih---
lanjutkan uji dgn 5 ekor kelinci tambahan
- memenuhi syarat : tidak lebih dari 3 ekor dari 8 kelinci
masing-masing menunjukkan kenaikan suhu 0,5oC atau
lebih dan jumlah kenaikan suhu maks 8 kelinci tidak lebih
dari 3,3o
NB :
 Yang perlu diperhatikan/diamati selama
pemeliharaan kelinci :
- Bobot dan suhu badan
- Waktu istirahat untuk kelinci yang baru
dipakai (pirogen positif/negatif)
- Ruang khusus
b. Uji serologi
 Uji endotoksin bakteri (FI IV-905)
USP XX (hal.888): bacterial endotoxin test
1956: Bang menyuntik kepiting (Limulus polyphenus) dgn
endotoksin---penggumpalan
Asas :
Lisat darah kepiting (L.polyphenus) + endotoksin---
gelatinisasi dlm 30’
Pembuatan lisat amebosit limulus (LAL)
- Darah kepiting (Limulus polyphenus, horse shoe crab, mimi
mintaro) diambil melalui punksi dlm jantung.
- Sel darah kepiting (amebosit) dipisahkan dari serumnya
(sentrifuga), lalu dicuci dgn NaCl 0,9%
- Amebosit dihemolisis dg air suling, pisahkan dari dinding
sel (sentrifuga)
- Standarisasi, lalu liofilisasi (Pyrogent)
Keuntungan Uji Endotoksin Bakteri
 Cepat (cocok utk uji pirogenita radiofarmaka)
 Sensitif dan valid
 Zat antipiretik bisa diuji menurut cara ini
 Jumlah sedikit sudah bisa diuji (dgn mikroskop)
 Tidak perlu persiapan yg memakan waktu spt
halnya dgn uji dgn kelinci

Uji Jumlah Leukosit

Asas : berdasarkan berkurangnya lekosit setelah

disuntikkan pada hewan percobaan