HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Ku l i a h A n f a r 1 F F U n a i r, 2 0 1 4

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
yuwono05@yahoo.com
 Chromatography
(Kromatografi)

Bahasa Yunani

“Chroma” “Graphein”
(Warna) (menulis)
Color writing
 Percobaan M.S. Tswett

Pemisahan pigmen tumbuh-

tumbuhan

Tabung gelas  kolom

Mikhail Semenovich Tswett Serbuk CaCO3  Packing
(1872 – 1919) Ekstrak daun  sampel
Petroleum eter  fase gerak
 KROMATOGRAFI

Termasuk salah satu teknik

pemisahan komponen campuran zat
Untuk analisis kualitatif, kuantitatif
dan preparatif
Analit terdistribusi dalam fase gerak
(mobile phase) dan fase diam
(stationary phase)
 Fase gerak
Jika fase gerak berupa cairan  disebut
kromatografi cair (Liquid
Chromatography)
Contoh:
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT=HPLC)

Jika fase gerak berupa gas 

disebut kromatografi gas (Gas
Chromatography = GC)
 Fase diam
Berupa padatan atau cairan
Fase diam
 dapat berupa kertas  disebut Kromatografi
Kertas (Paper Chromatography)
 dapat ditebarkan pada lempeng (plate)disebut
kromatografi lapis tipis (Thin Layer
Chromatography =TLC)
 dapat diisikan/dilapiskan pada kolom  Contoh:
HPLC, GC, Kromatografi kolom)
Klasifikasi berdasarkan Mekanisme
Kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)

Kromatografi Partisi
(partition chromatography)

Kromatografi Pertukaran ion

(ion exchange Chromatography)

Size Exclusion Chromatography (SEC)

Kromatografi Permeasi Gel; Kromatografi Filtrasi Gel
 CHROMATOGRAPHY

GAS SFC LIQUID

GSC GLC Column Pla na r

NP RP IEC SEC TLC Pa per

GPC GFC
GSC: Gas Solid Chromatography; GLC: Gas Liquid Chromatography
SFC: Supercritical Fluid Chromatography; NP: Normal Phase; RP: Reversed
Phase; IEC: Ion-Exchange; SEC: Size Exclusion Chromatography, GPC: Gel
Permeation Chromatography, GFC: Gel Filtration Chromatography
HPLC The most frequently used technique

High Performance
HP High Pressure

L Liquid
Cairan sebagai Fase gerak

Chromatography
C  Teknik Pemisahan
 HPLC = KCKT

Dikembangkan pada awal 1970-an

Dewasa ini merupakan teknik paling
banyak digunakan untuk pemisahan dan
analisis dari berbagai bidang seperti
farmasi, bioteknologi, lingkungan,
polimer dan makanan.
Merupakan “method of choice for the
analysis of a wide variety compounds”
 Aplikasi HPLC bidang Farmasi

a t?
Analisis Kualitatif W h
Manfaat
?
Analisis Kuantitatif uch HPLC
wm
Ho di bidang
t io n/
n
Farmasi
la
Preparatif o
Is fica ti o
u ri
p
Penggunaan HPLC

Senyawa Organik, dan Anorganik

Bahan Aktif, Bahan Tambahan

dan Cemaran

Molekul sederhana dan

makromolekul (netral, ionik, zwitter ion)

Pemisahan Isomer (enantiomer)

12
Berdasarkan sifat kimia Pemisahan
SEC
NP Size
Normal
Phase HPLC Exclusion
(GPC, GFC)

IE

Ion
HILIC Reversed
Phase Exchange

RP

Dilakukan dengan instrumen HPLC yang sama,

tergantung dari kolom yang digunakan
 HPLC Fase Normal
 NP-HPLC: fase gerak non
polar, fase diam polar
 Disebut juga kromatografi
adsorpsi (adsorption
chromatography)
 Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit
pada fase diam polar (silika
atau alumina)
 Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar
karena gugus silanol pada
silika.
 HPLC Fase terbalik
 RP-HPLC: fase gerak polar,
fase diam non polar
 Pemisahan didasarkan atas
koefisien partisi analit dalam
fase diam dan fase gerak
 Urutan elusi: analit polar
terelusi lebih dahulu, analit
non plar terelusi terakhir
 Untuk analit berupa ion dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan dapar dan
teknik pasangan ion (ion-pair).
 Reversed-phase mobile phases
Water
Methanol
Acetonitrile
THF
Additives, salts, acids, bases
 Ion Exchange HPLC

 Pemisahan didasarkan atas

pertukaran ion analit dengan
ion dari gugus fungsi bahan
pendukung padat fase diam
 Contoh Fase diam: senyawa
sulfonate (penukar kation);
ammonium kuarterner
(penukar anion)
 Fase gerak: dapar
 Aplikasi: analisis ion, asam-
asam amino, protein/peptida,
polinukleotida
 Size Exclusion HPLC
 Untuk pemisahan
makromolekul (BM >
10000).
 Disebut GFC jika
digunakan untuk
pemisahan molekul
biologis yang larut air
 Disebut GPC jika
digunakan untuk
penentuan Bobot molekul
suatu polimer organik.
Fase gerak umumnya
toluen dan
tetrahidrofuran.
 HPLC: Berdasarkan komposisi fase gerak

Isokaratik (Isocratic elution):

 Komposisi fase gerak tetap

Gradien (Gradient elution):

 Komposisi fase gerak berubah

Elusi gradien
% Solven B

Elusi Isokratik

Waktu (menit)
 Gradient Analysis
Advantages:
 Better suited for complex samples
 Better resolution of early and late eluting peaks
 Better sensitivity of late eluting peaks
 Higher peak capacity (fit more peaks in the
chromatogram)

Disadvantages
 More complex HPLC instrument
 Method development, implementation and transfer
are more difficult
 Typically longer analysis times since column must be
calibrated with initial mobile phase
Pemisahan Kromatografi Cair
 Pemisahan pada capillary GC

injection
Panjang Kolom detector
 Sekadar Ilustrasi

Jl. Basuki Rahmat , Surabaya

MALL

Restaurant FINISH
START
 Prosedur Analisis

HPLC
instrumen

Sampel Preparasi sampel

Pemisahan pada
Kolom: sebagai Pita (band)

Pemisahan pada
kromatogram: sebagai
Puncak (peak)
 Chromatogram

tR-B
Respon Detektor 

tR-A
Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width

Area =
width x height
2
Chromatographic retention times are characteristics of the compounds
they represent but are not unique
 Kromatogram
Data :
 Kromatogram  tR: waktu retensi (retention
time)
 (parameter kualitatif)
tR-1
Respon Detektor

 Luas puncak = Peak area

 parameter kuantitatif
tR-2
 Tinggi puncak (Peak height)
parameter kuantitatif
waktu
 Width = lebar puncak

Retention volume (VR)

VR = tR × F Relative Retention Time (RRT) = tR2/tR1
 Retention of unretained compound
 tM = to adalah waktu retensi zat yang tak
tertahan oleh fase diam
 VM = dead volume
  tM = Hold-Up time = dead time
 tR’ = tR – tM = adjusted retention time
 Lebar Puncak (w)
 Lebar garis dasar (baseline) = Wb
 Lebar tengah puncak (W0.5)
Tailing, Fronting & Symmetry Peak

a b
 Tailing Factor (USP)
Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)
 Dihitung pada posisi 5% dari tinggi maksimum puncak

Tf = 1.0  Puncak simetri

Tf < 1.0  fronting
Tf > 2.0  tailing
Retention Factor = Capacity factor (k’)
tR  tM
k 'A 
tM

Menggambarkan kecepatan elusi analit pada kolom

Jika k’A < 1 elusi terlalu cepat.
Jika k’A > 10  elusi terlalu lambat
k’A sebaiknya antara 1.5 dan 4
 Faktor Selektivitas
 Faktor selektivitas= Selectivity Factor (a) = k’B /k’A
 Merupakan ukuran atau selektivitas pemisahan
dua komponen
 Harga a > 1 berarti dua puncak terpisah
 Dipengaruhi komposisi fase gerak, jenis fase
diam, temperatur, pH fase gerak

k ' B (t R ) B  t M
 
k ' A (t R ) A  t M
 Resolusi (RS)
menunjukkan
kemampuan
sebuah kolom
untuk memisahkan
dua analit
 Rs  dua puncak
terpisah dengan
baik
Pada integrasi secara elektronik:
2[(t R ) B  (t R ) A ]
RS  1.18[(t R ) B  (t R ) A ]
WA  WB RS 
W0.5( A)  W0.5( B )
 Tinggi pelat dan Pelat teoretis

 Pelat teoretis = Theoretical Plates (N)

 Tinggi pelat = Plate Height (H) = HETP (High
equivalent to a Theoretical Plate)
 Untuk menunjukkan efisiensi kolom

N = L/H
L = panjang kolom
 Menghitung N dari kromatogram

2
 tR 
N  16  
W 

Pada integrasi secara elektronik:

2
 tR 
N  5.54 
 W0.5 
 Peak A Peak B

Peak area A = Peak area B

WA WB

Peak A: Peak B:
• Narrow band;
• Broad band;
• Narrow peak;
• Broad peak;
• Greater peak height;
• Less sensitivity;
• Increased sensitivity
• Less resolution capacity
• More resolution capability
• Less Plates
• More Plates
 Hubungan Resolusi dengan N

1. Dipengaruhi ukuran partikel, Panjang kolom, kondisi

kolom
2. Faktor selektivitas  tergantung analit dan fase diam
3. Faktor kapasitas  kondisi pemisahan
 Memperbaiki Resolusi
Optimasi kondisi pemisahan
Pemilihan kolom (ukuran partikel,
diameter internal, jenis fase diam)
komposisi fase gerak
 Pengaturan temperatur (oven/kolom)
 HPLC
Instrumentasi
Kuliah Anfar 1 2014, FF Unair

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
yuwono05@yahoo.com
 HPLC Instrumentation
1. Mobile Phase Supply System
2. Pump
3. Sample Injector
4. Column
5. Detector
6. Data System
Gradient
Controller
•
Pump Column
Detector
Injector
Mobile
Phases
 Instrumentation
HPLC Instrumentation
 Instrumentation
HPLC Instrumentation
Degasser

70 mbar

A A
B B
C C

Pump

A A B C
A B C

B
C

Eluent Gradient mixer Detector

Column
HPLC Instrumentation
Instrumen HPLC di Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair
Instrumen HPLC di Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair
HPLC instrument (di Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair)
47
Lab Unit Layanan Pengujian FF Unair
48
 Fase Gerak

 Fase gerak
diletakkan dalam
botol-botol
reservoir.
 Fase Gerak

 Zat cair yang digunakan sebagai fase

gerak harus saling campur
 Pelarut yang umum digunakan pada
RP-HPLC
 Air
 Asetonitril
 Metanol
 Tetrahidrofuran
Ketercampuran Pelarut
Saling campur
Tidak saling campur
 Fase Gerak HPLC
 Melarutkan komponen sampel
 Tidak merusak komponen sistem HPLC
 Memiliki kemurnian tinggi
 Tidak mengandung cemaran yang mengabsorpsi
cahaya pada daerah UV
 Viskositas rendah
 Toksisitas rendah
 Tidak mudah terbakar
 Kemurnian Fase gerak
Solvent UV Cutoff (nm)
Diperlukan solvent dengan
kemurnian tinggi Acetonitrile 190
Adanya pengotor Water 190
Cyclohexane 195
(impurities) pada solvent
Hexane 200
dapat menimbulkan Methanol 210
gangguan analisis. Ethanol 210
Gunakan HPLC grade Diethyl Ether 220
Air sebagai fase gerak: Dichloromethane 220
digunakan water for injection Chloroform 240
Carbon Tetrachloride 265
Tetrahydrofuran 280 (220)
Toluene 285

Panjang gelombang UV cutoff

Menunjukkan panjang gelombang terendah pada detektor UV
yang dapat digunakan untuk solven tersebut
 Pompa HPLC
 Fungsi Pompa
 Mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem
 Mencampur fasa gerak
 Berdasar kan cara pencampuran:
 Low-pressure
 High-pressure
 Berdasar kan rentang alir:
 Pompa analitik 0.001 – 10 mL/menit
 Pompa preparatif 30 mL/menit – liter/menit
 Berdasarkan mekanisme pendorong:
 Mekanisme pendorong bolak-balik (reciprocating)
 Pompa syringe
 POMPA: Resiprocating Pump
Single Piston
Dual Piston
Outlet
Check Valve

Piston

Cam
Seal

Inlet
Check Valve
Komponen yang terbasahi oleh fase gerak terbuat dari bahan yg inert: safir,
ruby, stainless steel, fluorocarbon.
 PENYEBAB GANGGUAN POMPA
 Seal  aus, menyebabkan kebocoran fasa
gerak ke bagian belakang pompa
 Kontaminasi pada valve akibat partikulat atau
kotoran
 Gelembung udara yang berpengaruh
pembukaan dan penutupan check valve

Pengatasan:
• Ganti Seal secara berkala
• Cuci sistem sebelum dimatikan
• Lakukan Degassing Fase gerak
 HPLC, Mengapa perlu tekanan tinggi?
 Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing
kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um.
 Faktor C pada hukum van Deemter sebanding
dengan dp2
 Ukuran partikel makin kecil  luas permukaan
makin besar  transfer massa dari fase gerak ke
fase diam atau sebaliknya makin besar  kolom
semakin efisien dan resolusi peak semakin baik.
 Penggunaan ukuran partikel kecil  diperlukan
tekanan tinggi
 Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang
kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm
(1000 – 6000 psi)
 Hukum Van Deemter
H = A + B/m + C. m
 A= suku difusi Eddy; B=suku difusi longitudinal; C=
suku perpindahan massa; m=kecepatan fase gerak
Hukum Van Deemter
 Eddy Diffusion

A = 2l d p

• disebut difusi Eddy

• l tergantung pada distribusi
ukuran partikel
• Jika ukuran partikel packing seragam
 l kecil
• dp = diameter partikel packing
 Longitudinal Diffusion (B)

B/u = 2gDM/u

• g = konstan tergantung mutu packing

• DM = koefisien difusi fase gerak

• Berbanding terbalik dengan laju alir fase gerak
 Mass Transfer (Cs + Cm)

H = A + B/u + (Cs + Cm)u

CS = fS(k’)df2 / DS

CM = fM(k’)dp2 / DM

• DM = koefisien difusi fase gerak

• DS = koefisien difusi fase diam
• df = film thickness
• dp = diameter partikel
• Berbanding lurus dengan laju alir fase gerak
Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)
Particle Size and Column Performance

(300 psi)
(1300 psi)
(10,000 psi)
(34,000 psi)
 HPLC vs UHPLC/UPLC

 UHPLC :Tekanan sangat tinggi

UHPLC menggunakan kolom dengan
ukuran partikel sangat kecil
(< 2µm)
waktu analisis sangat cepat dengan
resolusi yang tinggi
 Sample Injection

 6-port rotary valves

 Terdiri dari:
 Stator: bagian terfiksasi
 Rotor: seal internal
berotasi
 Dapat diputar pada 2 Load – Inject
posisi: Position

 Load
 Inject
 Sample Injection
 Load and Inject -Position
 INJEKTOR

Autosampler:
 Sampel dimasukkan dengan
syringe otomatis yang
mengambil sampel dari vial
pada rak bermotor
penggerak
HPLC Columns

Kolom:
Bagian
terpenting
dalam
pemisahan
 HPLC Column Categories
 Column Hardware: Standard or Cartridge,
stainless, titanium
 Chromatographic Modes: Normal-phase
(NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange
(IEC), size exclusion (SEC)
 Dimensions: Preparative, semi-prep,
analytical, fast LC, micro, nano
 Support Types: Silica, polymer, zirconia,
hybrid
 Column Dimension

Length x ID
Art.-Nr. xxxx HPLC-column 250x3 mm
Lichrospher 100 RP-18 5µm
Flow  Particle size in µm

Modification of silicagel

Pore size (Angstrom)

Producer of silica gel

Flow direction
Chromatography Stationary Phases

Silica Gel Derivatized Silica Gel

O O O O O O
| | | | | |
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR Where R = C18H37
| | | | | |
O O O O O O hydrocarbon chain
| | | | | | (octadecylsilyl deriv.
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR silica or “C18”)
| | | | | |
O O O O O O

bulk (SiO2)x surface bulk (SiO2)x surface

relatively polar surface relatively nonpolar surface

“normal phase” “reversed phase”
 Bonded Phases

 C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3

• C-18 Octadecyl Silyl -Si-(CH2)17-

CH3
•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN
 Fasa Diam (USP)
Kelompok fase diam HPLC:
Berdasarkan sifat kimia rantai bonded phase :
 L1: C18 / octadecyl / ODS
 L7: C8 / octyl
 L8: NH2
 L9: SCX
 L10: CN
 L11: Phenyl
 L13: Trimethylsilyl/methyl/TMS
 L14: SAX
Fase Normal  Fase terbalik
 Residual Silanol
 Pada derivatisasi silika: Karena efek halangan
ruang, tidak semua gugus silanol mengalami
derivatisasi, sehingga masih ada gugus silanol
tersisa (Residual silanol)
 Residual silanols menyebabkan timbulnya
puncak yang berekor (tailing) khususnya untuk
analit asam dan basa
 Untuk menghilangkan residual silanol 
dilakukan proses “endcapping”
 penggunaan molekul rantai pendek
Contoh: RP-18 endcapped
RP-HPLC column endcapped

78
 Kolom HPLC
 Bentuk Partikel
 Spherical atau irregular
 Partikel spherical 
mengurangi tekanan dan kolom
lebih awet

 Ukuran Partikel
 Umumnya 3-10µm
 Makin kecil ukuran partikel,
makin tinggi efisiensi
 KARAKTERISTIK KOLOM HPLC

Carbon Load
 Amount of bonded phase attached to base material,
expressed as %C
 Higher carbon loads generally offer greater resolution
and longer run times.
 Low carbon loads shorten run times and many show a
different selectivity.
 Kolom HPLC

Ukuran Pori-pori
 Bervariasi antara 60-
10,000Å
 Makin besar pori-pori 
analit molekul besar
dapat tertahan lebih lama.
 Pilih  150Å untuk sampel
BM  2000.
 Kolom Monolitik

Batangan silika monolitik  Kecepatan alir dapat

ditingkatkan dengan resolusi yang baik
 Kolom Monolitik

Pori-pori besar  kecepatan alir dapat ditingkatkan 

waktu analisis makin cepat
 High Pure Silica
Spherical particles
 Almost no metal impurities (< 5 ppm)
 Excellent peak symmetry
 Extended stability: pH range 1.5 to 10.5

irregular

spherical

monolithic

85
 High Pure Silica

The Difference - Metal Content

Metal content in ppm

Sodium Calcium Magnesium Iron Aluminium

irregular 340-400 1300 160-220 20-25 15-20

Sperical 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140

High Pure Silica 1 1 3 1

1
 HILIC

Hydrophylic Interaction Liquid Chromatography =

Hydrophylic Interaction Chromatography
Sometimes is called “Aqueous Normal Phase”

A Liquid chromatography technique

(Andy Alpert’s early work or sugars
on amino columns using H2O/ACN)

Similar to NP-HPLC
but with aqueous mobile phase
87

Retention of polar components 

separation of many types of
polar and hydrophilic compounds
 HPLC Detectors

To detect the separated analytes

An ideal Detector:
 UNIVERSAL (i.e. detects everything)
 SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of
analytes)
 LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between
intensity of response and amount of analyte).
 give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the
analyte is, even if you didn’t know beforehand).
 HPLC Detectors

UV-Vis Detector
Photodiode array Detector (PDA = DAD)
 Refractive Index Detector (RID)
 Fluorescence Detector (FLD)
 Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
 Electrochemical Detector (ECD)
 Conductivity Detector
 Radiometric Detector

Hyphenated Systems
 LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR
 HPLC Detectors
 UV-Vis
 Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105)
 Can be used with gradient elution
 Requires chromophore
 Refractive Index
 Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102)
 Isocratic only
 Nearly universal detection
 Evaporative Light Scattering
 Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105);
 Non-linear calibration required
 Can be used with gradient elution
 Nearly universal detection
 UV-Vis Detector
 Paling banyak digunakan
 Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan
flow cell
 Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang
dapat bergerak dan dapat memilih panjang
gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit)
 190 – 600nm
 Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan
sensitivitas pada daerah visibel.
 Macam UV-Vis:
 Fixed wave length
 Variable wave length
 Multiple variable wave length
 Photo diode-array
 UV-Vis Detector
Lamp Cut-off filter
Holmium oxide filter

Slit

Sample diode
Mirror 1

Grating

Flow cell

Mirror 2

Reference diode
 Photodiode array Detector (PDA)
Disebut juga diode
array detector (DAD)
Dapat menampilkan
spektra UV/Vis dari
puncak yang terelusi
Mampu melakukan
identifikasi puncak
 PDA
Dengan menggunakan software 
dapat menampilkan kromatogram dan
spektra serapan UV/Vis sampel
Dapat mengenali panjang gelombang
maksimum, peak matching
(menghitung match factor atau MF),
library search dan evaluasi kemurnian
peak (peak purity)
Dapat menampilkan 3-D spektra
Spektra 3D
 HPLC-DAD
 Spektra UV/Vis analit dan baku pembanding
 overlay 
Evaluasi korelasinya (r, MF)

 Kemurnian puncak 200 250 300 350 400 nm

 Pengukuran spektra pada “upslope,

apex dan down slope”
 dapat diketahui Peak “pure atau impure”
 Match Factor
MF = 1000  r = 1 100% pure peak
MF > 990  pure
MF < 900  impure
900 < MF < 950  contaminated
Pure and Impure HPLC peaks

98
Memilih Panjang Gelombang Detektor UV/PDA
Pemilihan
Panjang
Gelombang
(UV)

?
 Refractive index
 Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel
sampel yang mengandung analit yang terelusi
dengan sel pembanding.
 Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug)
 Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan
digunakan umumnya untuk analit yang memiliki
gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida,
asam-asam organik dll.
 Detektor standar untuk GPC
 Tidak dapat digunakan untuk gradien
Refractive Index Detector
Evaporative Light Scattering Detector