HISTOLOGI DAN

MATERI PENGKAJIANNYA
 Histologi adalah ilmu tentang jaringan tubuh
dan cara jaringan ini menyusun organ-organ. Akar
kata Yunani histo dapat diterjemahkan sebagai
'jaringan' atau 'jaring' karena kebanyakan jaringan
merupakan faring filamen dan serat yang saling
terjalin, baik selular maupun non-selular, dengan
lapisan membranosa. Histologi mencakup, semua
aspek biologi jaringan, yang berfokus pada
mekanisme susunan dan struktur sel dalam
mengoptimalkan fungsi yang spesifik untuk setiap
organ.
 Jaringan dibentuk oleh dua komponen yang
saling berinteraksi: sel dan matriks ekstrasel.
Matriks ekstrasel terdiri atas banyak jenis molekul,
dan kebanyakan di antaranya sangat rumit dan
membentuk struktur kompleks, seperti serabut
kolagen dan membran basal. Fungsi utama yang
dulu dikatakan sebagai fungsi matriks ekstrasel
adalah sebagai penunjang mekanis bagi sel-sel,
mengangkut nutrien ke selsel, dan membawa
katabolit dan produk sekresi. Kita kini mengetahui
bahwa, meskipun menghasilkan matriks ekstrasel,
sel tersebut dipengaruhi dan terkadang diatur oleh
molekulmolekul matriks.
Jadi, terdapat semacam interaksi intensif antara
sel-sel dan matriks, dengan sejumlah komponen
matriks yang dikenali oleh dan tertambat pada
reseptor-reseptor di permukaan sel. Kebanyakan
reseptor tersebut adalah molekul yang melewati
membran sel dan berhubungan dengan komponen
struktural di dalam sitoplasma. Jadi, sel dan
matriks ekstrasel membentuk semacam kesatuan
yang berfungsi dan bereaksi terhadap rangsangan
dan inhibisi secara bersamasama.
 Setiap jaringan fundamental tersebut dibentuk
oleh beberapa jenis sel dan secara khas oleh
asosiasi sel dan matriks ekstrasel yang spesifik.
Asosiasi yang khas ini mempermudah pengenalan
sejumlah besar subtipe jaringan oleh mahasiswa.
Kebanyakan organ dibentuk oleh kombinasi
beberapa jenis jaringan, kecuali susunan saraf
pusat, yang hampir seluruhnya terdiri atas jaringan
saraf. Kombinasi yang tepat dari jaringanjaringan
tersebut memungkinkan berfungsinya setiap organ
dan organisms secara. keseluruhan.
 Ukuran sel dan matriksnya yang kecil
menyebabkan histologi bergantung pada
penggunaan mikroskop. Kemajuan di bidang
kimia, biologi molekular, fisiologi, imunologi dan
patologi dan interaksi di antara bidang-bidang
tersebut penting untuk memperoleh pengetahuan
yang lebih baik tentang biologi jaringan.
Pembiasaan dengan alat dan metode setiap
cabang ilmu penting untuk memahami topik
pembelajaran dengan baik.
PERSIAPAN JARINGAN UNTUK PENGKAJIAN
Prosedur yang paling Sering digunakan dalam
mempelajari jaringan persiapan sediaan histologi
atau irisan jaringan yang dapat dipelajari dengan
bantuan mikroskop cahaya. Di bawah mikroskop
cahaya, jaringan diamati melalui berkas cahaya
yang menembus jaringan. Karena jaringan dan
organ biasanya terlalu tebal untuk ditembus
cahaya, jaringan tersebut harus diiris menjadi
lembaran-lembaran tipis yang translusen dan
kemudian dilekatkan di atas kaca objek sebelum
jaringan tersebut dapat diperiksa.
 Sediaan jaringan mikroskopik yang ideal harus
dibuat sedemikian rupa sehingga jaringan pada
sediaan tersebut tetap memiliki struktur dan
komposisi molekul yang sama seperti di tubuh.
Namur pada praktiknya, hal ini jarang dapat
dilakukan dan hampir selalu terdapat artefak,
distorsi, dan hilangnya komponen-komponen
akibat proses persiapannya. Tahaptahap dasar
yang diterapkan pada persiapan jaringan untuk
pengkajian histologi diperlihatkan pada Gambar
1-1.
Fiksasi
Jika sediaan yang permanen dikehendaki,
jaringan harus difiksasi. Untuk menghindari
pencernaan jaringan oleh enzim di dalam sel
(autolisis) atau oleh bakteri clan untuk
mempertahankan struktur dan komponen molekul,
potongan organ harus segera diolah dengan tepat,
sebelum atau secepat mungkin setelah organ
diangkat dari tubuh hewan. Pengolahan ini fiksasi
dilakukan secara kimiawi atau, lebih jarang,
dengan cara fisika. Pada fiksasi kimiawi, jaringan
biasanya direndam dalam larutan yang
menstabilkan atau dalam bahan pengikat yang
disebut bahan fiksasi.
Karena bahan fiksasi memerlukan waktu untuk
meresap sepenuhnya ke dalam jaringan, jaringan
tersebut biasanya dipotong menjadi fragmen kecil
sebelum difiksasi untuk mempermudah penetrasi
bahan fiksasi clan untuk menjamin pengawetan
jaringan. Penyuntikan intravaskular bahan fiksasi
dapat dilakukan. Dalam hal ini, bahan fiksasi
sampai di jaringan secara cepat melalui pembuluh
darah sehingga fiksasi semakin baik.
Salah satU bahan fiksasi terbaik untuk
pemeriksaan mikroskop cahaya rutin adalah
larutan dapar isotonik dari formaldehid 37%.
Proses kimiawi yang terlibat dalam fiksasi tersebut
sangat rumit dan tidak selalu dimengerti dengan
baik. Formaldehida dan glutaraldehida, yaitu
bahan fiksasi lain yang banyak dipakai, diketahui
bereaksi dengan gugus amina (NH2) protein
jaringan. Pada glutaraldehicla, kerja fiksasinya
diperkuat karena zat ini merupakan dialdehida
yang dapat membentuk ikatan-silang antarprotein.
Mengingat tingginya resolusi yang dihasilkan
oleh mikroskop elektron, diperlukan lebih banyak
perhatian dalam proses fiksasi untuk
mempertahankan rincian struktur ultranya.
Untuk itu, prosedur fiksasi ganda dengan
menggunakan larutan dapar glutaraldehid, yang
diikuti fiksasi kedua dengan dapar osmium
tetroksida, menjadi prosedur baku persiapan
pengkajian struktur yang harus. Efek osmium
tetroksida adalah mempertahankan dan memulas
lipid dan protein.
Pemendaman & Pemotongan
Jaringan umumnya dipendam dalam medium
padat untuk memudahkan pemotongan. Untuk
memperoleh sediaan yang tipis dengan mikrotom,
jaringan harus diinfiltrasi sesudah fiksasi dengan
substansi pemendam yang memberi sifat padat
pada jaringan.
Bahan pemendaman meliputi parafin, dan damar
plastik. Parafin digunakan secara rutin untuk
mikroskop cahaya; damar digunakan baik untuk
mikroskop cahaya maupun elektron.
Proses pemendaman parafin, atau impregnasi
jaringan, biasanya didahului oleh dug tahap utama:
pengeringan (dehydration) dan penjernihan
(clearing). Air mula-mula dihilangkan dari
potongan jaringan yang ingin dipendam dengan
cara merendamnya berturut-turut secara bertahap
dalam larutan etanol dan air, biasanya dari etanol
70% sampai 100% (pengeringan).
Etanol kemudian digantikan dengan larutan yang
dapat bercampur dengan alkohol dan media
pemendam. Sewaktu jaringan diinfiltrasi oleh
pelarut, jaringan biasanya menjadi jernih
(transparan). Setelah jaringan tersebut dipenuhi
(terimpregnasi) dengan larutan, jaringan
dimasukkan dalam parafin cair di dalam oven,
pada suhu 52-60°C. Panas akan menguapkan
pelarut dalam jaringan dan celah jaringan yang
ditinggalkan akan diisi dengan parafin. Setelah
dikeluarkan dari oven, potongan jaringan dengan
parafin di dalamnya akan menjadi keras.
Jaringan yang akan dipendam dalam damar
plastik juga menjadi kering dalam etanol dan
bergantung pada jenis damar yang dipakai
kemudian diinfiltrasi dengan larutan plastik. Etanol
atau zat pelarut kemudian diganti oleh larutan
plastik yang mengeras akibat ikatan-silang
polimer. Pemendaman dengan damar plastik
mencegah pengerutan akibat suhu yang tinggi
yang diperlukan pada proses pemendaman parafin
dan sedikit atau tidak menimbulkan distorsi sel.
 Blok keras yang berisi jaringan kemudian
diletakkan pada suatu alat yang disebut mikrotom
(Gambar 1-1) dan diiris dengan pisau baja atau
pisau kaca mikrotom menjadi potongan setebal 1-
10 pm. Ingatlah bahwa satu mikrometer (1 µm) =
1/1000 mm = 10-1 m. Satuan jarak lain yang umum
digunakan pada histologi adalah nanometer (1 nm
= 0,001 µm =10' mm = 10-9 m) dan angstrom (1 A
= 0,1 nm atau 10' pm). Lembaran jaringan
diapungkan di atas air dan dipindahkan ke atas
kaca objek untuk dipulas.
 Cara lain untuk mempersiapkan sediaan
jaringan adalah pemaparan jaringan dengan
pembekuan cepat. Pada proses ini, jaringan
difiksasi melalui pembekuan (secara fisika, bukan
fiksasi kimiawi) dan sekaligus menjadi keras dan
siap untuk dipotong. Sebuah mikrotom pembeku
cryostat lalu digunakan untuk memotong jaringan
tersebut yang beku. Karena cara ini cepat
menghasilkan preparat tanpa mengikuti prosedur
pemendaman yang panjang seperti yang
dijelaskan sebelumnya, cryostat digunakan secara
rutin di rumah sakit untuk mengkaji spesimen
selama prosedur pembedahan.
Pembekuan jaringan juga efektif untuk studi
histokimiawi enzim yang sangat sensitif atau
molekul kecil, karena pembekuan, tidak seperti
fiksasi, tidak menginaktifkan sebagian besar
enzim. Terakhir, karena pencelupan jaringan yang
terfiksasi dalam pelarut seperti xylene akan
melarutkan lipid sel, sediaan beku juga bermanfaat
ketika suatu struktur yang mengandung lipid ingin
dipelajari.
Pemulasan
Agar dapat dipelajari di bawah mikroskop,
sediaan biasanya harus dipulas atau diwarnai
karena kebanyakan jaringan tidak berwama.
Oleh sebab itu, sejumlah metode pemulasan
jaringan telah dirancang agar berbagai unsur
jaringan jelas terlihat dan dapat dibedakan satu
dengan yang lain. Pewarna memulas berbagai
unsur jaringan, kurang lebih secara selektif.
Kebanyakan pewarna ini bersifat sebagai senyawa
asam atau basa dan cenderung membentuk ikatan
elektrostatik (garam) dengan radikal yang dapat
terionisasi di jaringan. Komponen jaringan dengan
muatan netto negatif (anionik) lebih mudah dipulas
dengan pewarna basa dan disebut basofilik,
komponen kationik, seperti protein dengan banyak
gugus amino yang terionisasi, memiliki afinitas
untuk pewarna asam dan disebut asidofilik.
Contoh pewarna basa adalah biru toluidin, biru
alcian dan biru metilen. Hematoksilin bekerja
seperti pewarna basa, artinya zat ini memulas
komponen basofilik jaringan. Komponen jaringan
utama yang mengionisasi dan bereaksi dengan
pewarna basa akan mengikat zat basa karena
adanya asam dalam komposisi jaringan tersebut
(asam nukleat, glikosaminoglikan, dan asam
glikoprotein). Pewarna asam (misalnya, G jingga
(orange G), eosin, asam fukhsin) memulas
komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria,
granula sekretoris, dan kolagen.
 Dari semua pewarna, kombinasi hematoksilin
dan eosin (H&E) paling banyak dipakai.
Hematoksilin memulas DNA intisel dan struktur
asam lainnya di sel (seperti bagian sitoplasma
yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadi
biru. Sebaliknya, eosin memulas sitoplasma dan
kolagen menjadi merah muda (Gambar 1-2).
Banyak pewarna lain, seperti trikrom (misalnya,
pewarna Mallory, pewarna Masson), dipakai pada
prosedur histologi lainnya. Trikrom, selain
menampakkan inti dan sitoplasma dengan jelas,
lebih baik dalam membantu membedakan
komponen jaringan ekstrasel ketimbang dengan
H&E.
Teknik yang baik untuk membedakan kolagen
adalah dengan penggunaan pikrosirius, terutama
bila dilihat dengan cahaya polarisasi (lihat
Mikroskopi Polarisasi).
Dasar kimiawi untuk prosedur pemulasan
lainnya lebih sulit daripada interaksi elektrostatik
yang mendasari basofilia dan asidofilia. DNA
secara spesifik dapat diidentifikasi dan
dikuantifikasi dalam inti sel dengan menggunakan
reaksi Feulgen; pada reaksi ini, gula deoksiribosa
dihidrolisis oleh asam hidroklorat lemah, yang
diikuti dengan pengolahan dengan reagen asam
periodat dan Schiff (PAS).
Teknik PAS didasarkan pada transformasi gugus
1,2-glikol yang terdapat dalam gula menjadi residu
aldehid, yang lalu bereaksi dengan reagen Schiff
untuk menghasilkan warna magenta atau ungu.
Polisakarida membentuk suatu kelompok yang
sangat heterogen di jaringan dan terdapat baik
dalam bentuk bebas atau kombinasi dengan
protein dan lipid. Karena kandungan gula
heksosanya, sejumlah besar polisakarida juga
dapat diperlihatkan dengan reaksi PAS.
Polisakarida bebas yang berlimpah di sel hewan
merupakan glikogen, yang dapat diperlihatkan
oleh PAS di hati, otot lurik, dan jaringan lain yang
menimbunnya.
 Rantai gula bercabang pendek (oligosakarida)
melekat pada asam amino glikoprotein sehingga
kebanyakan glikoprotein terpulas positif oleh PAS.
Gambar 1-2b memperlihatkan suatu contoh sel
yang dipulas oleh reaksi PAS. Glikosaminoglikan
(GAG) merupakan polisakarida anionik yang
berantai panjang dan tidak bercabang dan
mengandung gula teraminasi. Banyak
glikosaminoglikan yang disintesis ketika melekat
pada inti protein dan membentuk suatu golongan
makromolekul yang disebut proteoglikan, yang
menjadi bagian penting matriks ekstrasel (ECM)
ketika disekresi.
 Tidak seperti glikoprotein, rantai karbohidrat
glikoprotein memiliki berat dan volume yang lebih
besar ketimbang inti protein molekul. GAG dan
banyak glikoprotein asam tidak mengalami reaksi
PAS, tetapi menunjukkan interaksi elektrostatis yang
kuat dengan biru alcian dan pewarna basa lain,
karena tingginya kandungan gugus karboksil dan
sulfat anionik pada senyawa-senyawa tersebut.
Material basofilik atau yang terpulas positif
dengan PAS selanjutnya dapat diidentifikasi oleh
pengolahan awal sediaan jaringan melalui
pencemaan enzim dengan suatu enzim yang
secara spesifik mencerna suatu substrat, dan
membiarkan bagian lainnya yang berdekatan.
Contohnya, pengolahan awal dengan ribonuklease
akan sangat mengurangi sifat basofilia sitoplasma
dengan sedikit efek pada kromosom, yang meng
indikasikan kepentingan RNA untuk pemulasan
sitoplasma. Demikian halnya, polisakarida bebas
dicerna oleh amilase, sehingga dapat digunakan
untuk membedakan glikogen dari glikoprotein
pada materi yang terpulas positif oleh PAS.
Pada banyak prosedur, struktur tertentu seperti
inti sel menjadi terlabel, tetapi bagian sel lain wring
tidak tampak. Dalam hal ini, pulasan balik
(counterstain) digunakan untuk memberikan
informasi tambahan.
Pemulas balik biasanya adalah pewarna tunggal
yang diberikan pada suatu sediaan dengan
metode lain untuk mempermudah pengenalan inti
atau struktur lain.
Struktur yang kaya akan lipid paling baik
diperlihatkan dengan zat pewarna yang larut-
lipid untuk menghindari langkah persiapan seperti
pengolahan dengan pangs, xylene, atau paraffin,
yang dapat membuang lipid. sediaan beku dipulas
dalam larutan alkohol yang tersaturasi dengan
suatu pewarna lipofilik seperti Sudan black. Zat
warna larut dalam droplet lipid sel dan struktur lain
yang kaya-lipid, yang menjadi terpulas hitam.
Metode khusus untuk menentukan lokasi
kolesterol, fosfolipid, dan glikolipid bermanfaat
pada diagnosis penyakit metabolik dengan
terjadinya akumulasi berbagai jenis lipid di dalam
sel. Selain pemulasan jaringan dengan pewarna,
teknik impregnasi logam yang biasanya
menggunakan garam perak merupakan metode
yang umum dalam memperlihatkan serat matriks
ekstrasel tertentu dan elemen sel yang spesifik di
jaringan saraf.
 Lama keseluruhan prosedur, mulai dari saat
fiksasi sampai pengamatan jaringan di bawah
mikroskop cahaya dapat memerlukan waktu dari
12 jam sampai 21/2 hari, yang bergantung pada
ukuran jaringan, bahan fiksasi, media
pemendaman dan metode pemulasan. Langkah
terakhir sebelum pengamatan adalah meletakkan
kaca penutup pada kaca objek dengan media
perekat.
MIKROSKOPI CAHAYA
Mikroskopi cahaya konvensional, serta
mikroskopi fluoresensi, fase-kontras, interferers
diferensial, konfokal, dan polarisasi semua bekerja
berdasarkan interaksi cahaya dengan komponen
jaringan dan dapat digunakan untuk
memperlihatkan dan mempelajari gambaran
jaringan.
Mikroskopi Lapang-Terang
Dengan mikroskop lapang-terang, yang
banyak digunakan mahasiswa histologi, sediaan
yang sudah dipulas.diperiksa dengan
menggunakan cahaya yang menembus spesimen.
Mikroskop terdiri atas bagian mekanis dan optik
(Gambar 1-3). Bagian optik terdiri atas 3 sistern
lensa. Kondensor menampung dan memfokuskan
cahaya, yang membentuk kerucut cahaya yang
menyinari obyek yang diamati. Lensa objektif
memperbesar dan meneruskan bayangan dari
objek ke arah okular. Eyepiece atau lensa okular
memperbesar bayangan ini dan
memproyeksikannya ke retina pengamat, suatu
lempeng fotografik, atau (untuk mendapatkan
bayangan digital) ke detektor seperti kamera CCD
(charged coupled device). Pembesaran total
diperoleh dengan mengalikan daya pembesaran
lensa objektif dan lensa okular.
Faktor penentu dalam memperoleh bayangan
 Faktor penentu dalam memperoleh bayangan
yang tajam dan rinci dengan mikroskop cahaya
adalah daya resolusinya, yaitu jarak terkecil di
antara dua partikel yang masih dapat
memperlihatkan kedua partikel tersebut sebagai
objek terpisah. Daya resolusi maksimal mikroskop
cahaya adalah sekitar 0,2 pm; daya ini
memberikan gambar yang baik dengan
pembesaran 1000 sampai 1500 kali. Objek
dengan ukuran yang lebih kecil atau lebih tipis dari
0,2 Itm (misalnya, ribosom, membran atau filamen
aktin) tidak dapat dibedakan dengan alat ini.
 Demikian halnya, dua objek seperti mitokondria
akan tampak sebagai satu objek bila letak keduanya
berjarak kurang dari 0,2 Iim. Kualitas gambar
kejelasan dan rincian bergantung pada daya resolusi
mikroskop tersebut. Pembesaran hanya berguna
bila disertai dengan daya resolusi yang tinggi. Daya
resolusi sebuah mikroskop, terutama bergantung
pada kualitas lensa objektifnya. Lensa okular hanya
memperbesar bayangan yang diperoleh dari lensa
objektif; lensa okular tidak memperbaiki resolusi.
Oleh sebab itu, bila kita membandingkan lensa-
lensa objektif dengan pembesaran yang berbeda-
beda, kita akan melihat bahwa mikroskop, dengan
pembesaran yang lebih kuat juga memiliki daya
resolusi yang lebih tinggi.
 Video kamera yang sangat sensitif
meningkatkan daya mikroskop lapang-terang dan
mikroskop cahaya lain dan memungkinkan
perolehan gambar yang dapat disimpan di dalam
komputer untuk analisis bayangan secara
kuantitatif dan dicetak. Keterbatasan mikroskop,
cahaya telah berubah dengan adanya kamera
video yang sangat sensitif terhadap cahaya.
Dengan kamera dan program penajam-gambar
(contohnya, untuk memperkuat kontras), objek
yang semula tidak tampak dengan mikroskop
cahaya melalui lensa okular, dapat dilihat pada
layar video.
 Sistem video ini juga bermanfaat untuk
mempelajari sel-sel hidup untuk waktu yang lama,
karena sistem ini menggunakan cahaya
berintensitas rendah sehingga akan menghindari
kerusakan sel yang dapat tiriibul akibat
pencahayaan yang intensif. Selain itu, perangkat
lunak untuk analisis gambar memungkinkan
pemeriksaan struktur mikroskopis.
Mikroskopi Fluoresensi
Bila zat tertentu disinari cahaya dengan
panjang gelombang yang sesuai, zat tersebut
dapat memancarkan cahaya dengan panjang
gelombang yang lebih panjang. Fenomena ini
disebut fluoresensi.
Pada mikroskopi fluoresensi, sediaan jaringan
biasanya disinari dengan sinar ultraviolet (UV) dan
emisinya terdapat dalarn, bagian spektrum
cahaya-tampak. Zat fluoresen tampak sebagai
partikel halus mengilap dengan latar belakang
gelap. Dalam hal ini, diperlukan mikroskop dengan
sumber cahaya ultraviolet yang kuat dan fitter
khusus yang menyeleksi cahaya dengan berbagai
panjang gelombang yang dipancarkan oleh zat.
Senyawa fluoresen yang mempunyai afinitas
terhadap makromolekul sel, digunakan sebagai
pewarna fluoresen. Salah satu contohnya adalah
jingga akridin, yang dapat bergabung dengan DNA
dan RNA.
Bila diamati dengan mikroskop fluoresen, asam
nukleat tersebut memendarkan fluoresensi yang
sedikit berbeda sehingga lokasi asam-asam
tersebut dapat ditentukan secara terpisah dalam
sel (Gambar 1-4a). Senyawa lain seperti pulasan
Hoechst dan DAM secara spesifik mengikat DNA
dan digunakan untuk memulas inti sel, yang
melepaskan fluoresensi biro yang khas dengan
sinar UV. Aplikasi penting lainnya dari mikroskopi
fluoresensi adalah dengan menggabungkan zat
fluoresen dengan molekul penanda yang secara
spesifik terikat pada komponen sel tertentu
sehingga memungkinkan pengenalan struktur
tersebut dengan mikroskop, (Gambar 1-4b).
Antibodi yang dilabel dengan Senyawa fluoresen
sangat penting pada pemulasan histokimiawi. (lihat
Metode Deteksi dengan Interaksi Spesifik antar
Molekul).
Mikroskopi Fase Kontras & Mikroskopi
Interferers Diferensial
Susunan optik tertentu memungkinkan observasi
sel dan sediaan jaringan yang tidak terpulas.
Specimen biologik yang tidak terpulas umumnya
transparan dan sukar dilihat secara detil, karena
semua bagian spesimen memiliki densitas optik
yang hampir sama. Namun, mikroskop face-kontras
mempunyai sistem lensa yang menghasilkan
bayangan yang terlihat dari objek transparan
(Gambar 1-5).
 Prinsip mikroskop fase-kontras adalah
berdasarkan kenyataan bahwa kecepatan cahaya
akan berubah ketika menerobos struktur sel dan
ekstrasel dengan indeks refraksi yang berbeda-
beda. Perubahan tersebut digunakan oleh sistem
fasekontras sehingga struktur-struktur terlihat
relatif lebih terang atau lebih gelap satu sama lain.
Karena tidak memerlukan fiksasi atau
pemulasan, mikroskopi fase-kontras
memungkinkan pengamatan kultur jaringan dan
sel-sel hidup, dan mikroskop semacam itu menjadi
slat yang panting di semua laboratorium kultur sel.
 Cara lain untuk mengamati sel atau sediaan
jaringan yang tidak terpulas adalah dengan
mikroskop interferers diferensial Nomarski, yang
menghasilkan bayangan tiga-dimensi yang lebih
nyata ketimbang dengan mikroskopi fase-kontras
rutin (Gambar 1-5).
Mikroskopi Konfokal
Dengan mikroskop lapang-terang biasa, berkas
cahaya relatif besar dan mengisi spesimen.
Sebaran cahaya mengurangi kontras di dalam
bayangan dan membentuk daya resolusi lensa
objektif.
Mikroskopi konfokal mengindari terjadinya
penyebaran cahaya dan menghasilkan resolusi
yang lebih besar dengan menggunakan (1) titik
kecil cahaya berintensitas tinggi yang dihasilkan
oleh laser dan (2) suatu lempeng dengan lubang
kecil di depan detektor bayangan. Sumber titik
cahaya,
titik fokus lensa, dan lubang kecil detektor,
kesemuanya terkonjugasi atau tersusun secara
optik satu dengan lainnya pads bidang fokus
(konfokal) dan cahaya yang tidak terfokus tidak
melewati lubang kecil tersebut.
Hal tersebut sangat memperbaiki resolusi objek
pads fokus dan memungkinkan penetapan lokasi
komponen spesimen dengan ketelitian yang lebih
besar ketimbang dengan mikroskop lapang-terang.
Kebanyakan mikroskop konfokal mencakup
suatu sistem cermin yang dikendalikan komputer
(pemisah berkas) untuk menggerakkan titik
iluminasi melalui spesimen secara cepat dan
automatic. Bayangan digital yang ditangkap di
banyak titik pada suatu bidang fokus yang sangat
tipis digunakan untuk menghasilkan suatu 'irisan
optik' bidang tersebut.
Selain itu, pembentukan irisan optik pada
serangkaian bidang fokus melalui spesimen
tersebut memungkinkan irisan tersebut
direkonstruksi secara digital menjadi bayangan
tiga-dimensi. Fitur panting mikroskop konfokal
diperlihatkan pads Gambar 1-6.
Mikroskopi Polarisasi
Mikroskopi polarisasi memungkinkan terlihatnya
strukturstruktur yang dibentuk oleh molekul yang
sangat rumit. Bila cahaya normal melewati filter
polarisasi (seperti Polaroid), cahaya tersebut akan
bervibrasi hanya dalam satu arah.
Jika filter kedua diletakkan di dalam mikroskop di atas
filter yang pertama dengan sumbu utamanya yang
tegak lurus terhadap sumbu filter pertama, tidak akan
ada cahaya yang lewat. Akan tetapi, jika struktur
jaringan dengan molekul terorientasi terdapat di antara
dua filter polarisasi, struktur repetitif molekul tersebut
akan mengitari (rotasi) sumbu cahaya yang keluar dari
polarisator dan tampak sebagai struktur terang dengan
latar belakang yang gelap (Gambar 1-7). Kemampuan
merotasi arah yibrasi cahaya terpolarisasi disebut
birefringensi (birefringence) dan merupakan
karakteristik zat berkristal atau zat yang mengandung
molekul dengan susunan yang sangat terorientasi,
misalnya selulosa, kolagen, mikrotubulus, dan
mikrofilamen.
MIKROSKOPI ELEKTRON
Mikroskop elektron transmisi dan mikroskop
elektron pemindai bekerja berdasarkan interaksi
elektron dengan komponen jaringan. Panjang
gelombang pada berkas elektron jauh lebih
pendek ketimbang panjang gelombang cahaya
sehingga memungkinkan peningkatan resolusi
ribuan kali lipat.
Mikroskopi Elektron Transmisi
Mikroskop elektron transmisi (TEM,
transmission electron microscope) adalah sebuah
sistem pembentuk bayangan yang memungkinkan
resolusi sekitar 3 mm (Gambar 1-8a).
Resolusi tinggi ini memungkinkan pembesaran
sampai 400.000 kali untuk melihat secara rinci.
Sayangnya, pembesaran demikian hanya berlaku
untuk molekul atau partikel yang terisolasi. Irisan
jaringan yang sangat tipis dapat diamati secara
rinci dengan pembesaran sampai sekitar 120.000
kali.
Fungsi TEM berdasar pada prinsip bahwa
berkas elektron dapat dibiaskan oleh medan
elektromagnetik dengan cara yang serupa dengan
pembiasan cahaya dalam lensa kaca. Berkas
elektron dihasilkan oleh suatu katoda di bagian
atas alat dan melewati ruang ke dalam suatu
ruang hampa.
Karena elektron berubah arah ketika berada dalam
medan elektromagnetik, berkas tersebut dapat
difokuskan dengan melalui kumparan listrik yang
dapat dianggap sebagai 'lensa' elektromagnetik.
Lensa pertama adalah suatu kondensor yang
memfokuskan berkas elektron pada sediaan.
Sebagian elektron berinteraksi dengan atom-atom
di dalam sediaan dan mengubah perjalanannya,
sedangkan sebagian lagi melalui spesimen tanpa
berinteraksi. Elektron yang melewati spesimen
mencapai lensa objektif, yang membentuk suatu
bayangan yang diperbesar dan terfokus, yang
kemudian diperbesar lagi melalui lensa lain dan
tertangkap pada layar monitor.
Bayangan spesimen memperlihatkan area berwama
putih, hitam dan abu-abu yang menyatakan area
yang mudah dilalui elektron (tampak terang atau
electron lucent) dan area tempat elektron diserap
atau dibiaskan (terlihat gelap atau electron dense).
Agar dapat terjadi interaksi yang baik antara
spesimen dan elektron, mikroskopi elektron
memerlukan sediaan yang sangat tipis (40-90 nm);
karena itu, pemendaman dikerjakan dengan larutan
plastik epoksi keras dan pemotongan dikerjakan
dengan pisau kaca atau intan. Sediaan yang sangat
tipis tersebut dikumpulkan pada kisi-kisi logam dan
dipindahkan ke bagian interior mikroskop untuk
dianalisis.
Teknik pembekuan (fraktur beku, cryofracture,
freeze etched) yang dikombinasi dengan
mikroskopi elektron sangat berguna untuk
memeriksa struktur membran. Spesimen jaringan
yang sangat kecil cepat dibekukan dalam nitrogen
cair dan dipatahkan dalam suatu ruang hampa
dengan pisau. Suatu replika permukaan yang
masih beku dihasilkan dengan menaruh lapisan
tipis uap karbon, platinum atau atom lain. Jaringan
kemudian dilarutkan dan replika permukaan
tersebut diperiksa dengan mikroskop elektron
pemindai. Bidang patahan yang acak wring
memisahkan lapisan ganda-lipid membran, dan
memaparkan protein dengan ukuran, bentuk dan
distribusi yang kemudian dapat dipelajari.
Mikroskopi Elektron Pemindai (SEM, Scanning
Electron Microscopy)
Mikroskopi elektron pemindai memungkinkan
pandangan pseudo-tiga-dimensi dari permukaan sel,
jaringan dan organ.
Seperti TEM, mikroskop ini menghasilkan dan
memfokuskan berkas elektron yang sangat halus, tetapi
berkas elektron di alat ini tidak menembus spesimen
(Gambar 1-8b). Alih-alih, permukaan spesimen pertama-
tama dikeringkan dan dilapisi dengan suatu lapisan tipis
atom logam yang tidak mudah ditembus elektron. Ketika
berkas dipindai dari satu titik ke titik lain melalui spesimen,
berkas tersebut berinteraksi dengan atom logam dan
menghasilkan elektron yang dipantulkan atau elektron
sekunder yang dilepaskan dari logam tersebut.
Elektron tersebut ditangkap oleh suatu detektor dan
sinyal yang terbentuk diproses untuk menghasilkan
bayangan hitam putih pada monitor. Bayangan SEM
biasanya mudah dipahami karena bayangan tersebut
menyajikan gambar yang tampak seperti disinari dari
atas, seperti halnya dunia makroskopik kita yang
dipenuhi oleh cahaya dan bayangan yang terbentuk
akibat penyinaran dari atas.
AUTORADIOGRAFI
Autoradiografi adalah suatu metode untuk
menentukan lokasi makromolekul yang bare disintesis
(DNA, RNA, protein, glikoprotein dan polisakarida) di sel
atau sediaan jaringan.
Metabolit yang terlabel secara radioaktif (nukleotida,
asam amino) dan bergabung dengan makromolekul
melepaskan radiasi lemah yang terbatas pada regio
selular tempat molekul tersebut berada. Sediaan
jaringan atau sel yang terlabel radioaktif diletakkan
dalam ruang gelap dengan emulsi fotografik yang
mengandung kristal perak bromida, yang bekerja
sebagai mikrodetektor radiasi tersebut dengan cara
yang sama seperti mikrodetektor yang berespons
terhadap cahaya pada film fotografik yang umum
digunakan. Setelah diletakkan dalam kotak yang
terlindung dari cahaya dalam waktu cukup lama, slide
dibuat secara fotografi.
Kristal perak bromida yang tereduksi oleh radiasi
dikurangi menjadi butiran hitam perak kecil, yang
mengindikasikan lokasi makromolekul yang terlabel
dengan radioaktif di jaringan. Prosedur umum tersebut
dapat digunakan pada persiapan mikroskopi cahaya dan
TEM (Gambar 1-9).
Banyak informasi yang dapat diperoleh melalui
autoradiografi sel atau jaringan. Jadi, jika suatu asam
amino radioaktif digunakan, sel jaringan yang
menghasilkan banyak protein dan sel yang sedikit
menghasilkan protein akan diketahui, karena jumlah
butiran perak yang terbentuk di atas sel sebanding
dengan intensitas sintesis protein.
Jika prekursor DNA radioaktif (seperfi timin radioaktif)
digunakan, kita dapat mengetahui sel dalam jaringan
(dan jumlahnya) yang siap untuk membelah. Peristiwa
dinamis dapat pula dianalisis. MisaInya, jika seseorang
ingin mengetahui tempat protein dihasilkan di dalam
sel, dan jalur yang diikuti di dalam sel sebelum protein
tersebut disekresikan, sejumlah hewan akan diberi
suntikan asam amino radioakfif dan jaringan
dikumpulkan beberapa saat setelah penyuntikan.
Autoradiografi dari sediaan-sediaan, yang diambil pada
waktu yang berbeda sepanjang percobaan, akan
menunjukkan migrasi protein radioaktif.
Jika seseorang ingin mengetahui tempat pembentukan
sel yang baru di dalam organ dan arah migrasinya,
sejumlah hewan akan diberi suntikan timidin radioaktif
dan jaringannya dikumpulkan pada waktu yang berbeda
setelah penyuntikan. Autoradiografi sediaan tersebut
akan menunjukkan tempat pembelahan sel-sel dan
arah sel-sel tersebut bermigrasi.
KULTUR SEL & JARINGAN
Sel-sel dan jaringan hidup dapat dipertahankan dan
dipelajari di luar tubuh. Pada organisme yang kompleks,
jaringan dan organ dibentuk oleh beberapa jenis sel.
Sel-sel ini bermandikan plasma darah, yang
mengandung ratusan molekul yang berbeda-beda.
Biakan sel dan jaringan sangat menolong kita
mengisolasi efek sebuah molekul terhadap satu jenis
sel atau jaringan. Biakan sel dan jaringan juga
memungkinkan pengamatan langsung terhadap
perilaku sel hidup dengan mikroskop fase-kontras.
Banyak eksperimen yang tidak dapat dilakukan pada
hewan hidup, dapat dilakukan secara in vitro.
Sel dan jaringan ditumbuhkan dalam larutan
kompleks yang diketahui komposisinya (garam, asam
amino, vitamin) yang ditambahkan dengan komponen
serum atau faktor pertumbuhan yang spesifik. Dalam
menyiapkan biakan dari jaringan atau organ, sel-sel
harus diuraikan terlebih dahulu secara mekanis atau
enzimatis.
Setelah diisolasi, sel dapat dikembangbiakkan pada
cawan Petri tempat sel tersebut melekat, yang biasanya
berupa selapis sel (Gambar 1-5). Biakan sel yang
diisolasi dengan cara ini disebut biakan sel primer.
Banyak jenis sel yang pernah diisolasi dengan cara ini
dari jaringan normal atau patologis dan sejak saat itu
telah dipertahankan secara in vitro karena sel-sel
tersebut telah dipertahankan dan menghasilkan garis
keturunan sel yang permanen. Kebanyakan sel yang
diperoleh dari jaringan normal memiliki batas rentang
hidup yang terprogram secara genetik.
Akan tetapi, perubahan-perubahan tertentu (beberapa
perubahan berhubungan dengan onkogen; dapat
menimbulkan imortalitas sel, yakni suatu proses yang
disebut transformasi, yang mirip dengan perubahan
awal suatu sel normal menjadi sel kanker. Karena
perbaikan teknologi biakan, kebanyakan jenis sel kini
dapat dipertahankan di laboratorium. semua prosedur
dengan sel dan jaringan hidup harus dilakukan di
daerah yang steril dengan larutan dan alat yang steril
untuk menghindari kontaminasi oleh mikroorganisme.
Inkubasi sel hidup in vitro dengan berbagai macam
senyawa fluoresen baru yang disimpan dan
dimetabolisme di dalam kompartemen spesifik sel
tersebut menjadi sebuah pendekatan baru untuk
memahami kompartemen-kompartemen ini, baik
secara struktural maupun fisiologis. Teknik-teknik
histologi lain yang dipakai untuk sel biakan sangat
penting untuk memahami lokasi dan fungsi
mikrotubulus, mikrofilamen, dan komponen
sitoskeleton lainnya.
APLIKASI MEDIS
Biakan sel digunakan secara luas untuk mempelajari metabolisms sel
normal dan sel kanker serta pengembangan obat-obat baru. Teknik ini juga
bermanfaat dalam meneliti parasit yang hanya tumbuh di dalam sel, seperti
virus, mikoplasma, dan beberapa protozoa. Pada penelitian sitogenetik,
penetapan kariotipe manusia Uumlah dan morfologi kromosom seseorang)
terjadi melalui pembiakan singkat sel darah atau fibroblas dan dengan
memeriksa kromosom selama pembelahan mitosis. Selain itu, biakan sel
berperan penting dalam teknik kontemporer biologi molekular dan teknologi
DNA rekombinan.
HISTOKIMIA & SITOKIMIA
Istilah histokimia dan sitokimia terutama digunakan
untuk menunjukkan metode penetapan lokasi struktur
sel dalam sediaan jaringan dengan menggunakan
aktivitas enzimatik yang khas di struktur tersebut.
Untuk mempertahankan enzim-enzim tersebut,
prosedur histokimia biasanya diterapkan pada jaringan
yang tidak terfiksasi atau sedikit terfiksasi, yang sering
dipotong pada suatu cryostat untuk menghindari efek
simpang panas dan paraffin terhadap aktivitas
enzimatik.
 Histokimia enzim biasanya bekerja sebagai
berikut: (1) sediaan jaringan dicelupkan dalam
larutan yang mengandung substrat enzim yang
lokasinya akan ditentukan; (2) enzim tersebut
dibiarkan bekerja pada substratnya; (3) pada
tahap ini atau pada tahap lebih lanjut, sediaan
diberi senyawa penanda; (4) senyawa ini bereaksi
dengan suatu molekul yang terbentuk akibat kerja
enzimatik pada substrat tersebut; (5) produk akhir
reaksi tersebut, yang tidak larut dan tampak
dengan mikroskop cahaya atau mikroskop elektron
hanya jika dipulas atau padat elektron, akan
mengendap di tempat yang mengandung enzim.
 Sewaktu kita mengamati sediaan demikian
dengan mikroskop, kita akan melihat sel-sel (atau
organel) yang ditutupi oleh zat warna atau zat
padat-elektron.
Beberapa contoh enzim yang dapat dideteksi
secara histokimiawi adalah sebagai berikut:
• Fosfatase mengurai ikatan antara gugus
fosfatase dan reside alkohol dari molekul yang
terfosforilasi. Hasil reaksi fosfatase, yang tidak
larut dan berwarna, umumnva berupa plumbum
fosfat atau plumbum sulfida. Fosfatase alkali,
yang beraktivitas maksimum pada pH alkali dan
fosfatase asam dapat dideteksi (Gambar 1-10).
• Dehidrogenase melepaskan satu hidrogen dari
satu substrat dan memindahkannya ke substrat
yang lain. Seperti fosfatase, dehidrogenase
berperan penting pada berbagai proses
metabolik. Dehidrogenase dideteksi secara
histokimiawi dengan menginkubasi sediaan
jaringan yang tidak difiksasi dalam larutan
substrat yang mengandung suatu molekul yang
menerima hidrogen dan mengendap sebagai
senyawa berwarna yang tidak larut. Mitokondria
dapat secara spesifik diidentifikasi dengan
metode ini karena dehidrogenase merupakan
enzim kunci pada siklus asam sitrat (Krebs) di
organel ini.
• Dehidrogenase melepaskan satu hidrogen dari
satu substrat dan memindahkannya ke substrat
yang lain. Seperti fosfatase, dehidrogenase
berperan penting pada berbagai proses
metabolik. Dehidrogenase dideteksi secara
histokimiawi dengan menginkubasi sediaan
jaringan yang tidak difiksasi dalam larutan
substrat yang mengandung suatu molekul yang
menerima hidrogen dan mengendap sebagai
senyawa berwarna yang tidak larut. Mitokondria
dapat secara spesifik diidentifikasi dengan
metode ini karena dehidrogenase merupakan
enzim kunci pada siklus asam sitrat (Krebs) di
organel ini.
• Peroksidase, yang terdapat dalam beberapa jenis
sel, meningkatkan oksidasi substrat tertentu dengan
pemindahan ion hidrogen ke hidrogen peroksida,
yang membentuk molekul air. Dengan cara ini,
sediaan jaringan yang difiksasi secara memadai,
diinkubasi dalam suatu larutan yang mengandung
hidrogen peroksida dan 3,3'-diaminoazobenzidin
(DAB). Dengan adanya peroksidase, senyawa
terakhir ini dioksidasi, yang menghasilkan endapan
coklat, padat-elektron, dan tidak larut, yang
memungkinkan penetapan lokasi aktivitas
peroksidase dengan mikroskop cahaya dan
mikroskop elektron. Pulasan peroksidase dalam sel-
sel darah putih penting untuk mendiagnosis
leukemia tertentu.
 Karena peroksidase sangat aktif dan dapat
menghasilkan cukup banyak endapan tak-larut
dalam waktu singkat, peroksidase juga digunakan
secara luas untuk aplikasi praktis penting lainnya:
memberi protein senyawa lain, yang akan
dijabarkan di bagian berikut.
APLIKASI MEDIS
Banyak prosedur histokimia sexing dipakai dalam diagnosis
laboratorium, seperti reaksi prussic Perl untuk besi (digunakan untuk
mendeteksi penyakit penimbunan besi hemokromatosis dan,
hemosiderosis), reaksi PAS-amilase dan birualcian untukglikogen
danglikosaminoglikan (untuk mendeteksi glikogenosis dan
mukopolisakaridosis), dan reaksi untuk lipid dan sfingolipid (untuk
mendeteksi sfingolipidosis).
METODE DETEKSI DENGAN INTERAKSI
SPESIFIK ANTAR MOLEKUL
Suatu molekul yang spesifik dalam sediaan
jaringan dapat diidentifikasi dengan menggunakan
senyawa atau makromolekul terlabel yang secara
spesifik berinteraksi dengan zat yang ingin
diperiksa (Gambar 1-11). Senyawa yang akan
berinteraksi dengan molekul tersebut harus diberi
suatu label yang dapat dideteksi di bawah
mikroskop cahaya atau elektron. Label yang paling
banyak dipakai adalah senyawa fluoresensi (yang
dapat dilihat dengan mikroskop fluoresensi atau
laser).
Atom radioaktif (yang dapat dideteksi dengan
autoradiografi), molekul peroksidase atau atau
enzim lain (yang dapat dideteksi dengan
histokimia), dan partikel logam (biasanya emas),
yang dapat diamati dengan mikroskop cahaya dan
mikroskop elektron. Metode pemeriksaan tersebut
dapat digunakan untuk mendeteksi dan
menentukan lokasi gula, protein clan asam nukleat
yang spesifik.
Contoh molekul yang berinteraksi secara spesifik
dengan molekul lain antara lain:
• Phalloidin adalah suatu senyawa yang
diekstraksi dari sejenis jamur (Amanita
phalloides) dan berinteraksi kuat dengan aktin.
Karena umumnya diberi label pewarna,
phalloidin biasanya digunakan untuk
memperlihatkan filamen aktin sel.
• Protein A diperoleh dari Staphylococcus aureus
dan terikat pada daerah Fc molekul
imunoglobulin (antibodi). Jadi, protein A yang
sudah diberi label dapat digunakan untuk
menentukan lokasi antibodi alami atau antibodi
yang terikat pada struktur sel.
 Lectin adalah protein atau glikoprotein yang
terutama berasal dari biji tumbuh-tumbuhan dan
terikat pada karbohidrat dengan afinitas dan
spesifisitas besar. Berbagai lectin terikat pada gula
spesifik atau pada deretan residu gula. Lectin-
lectin tersebut terikat pada glikoprotein,
proteoglikan dan glikolipid dan banyak dipakai
untuk menandai molekul membran yang
mengandung deretan residu gula yang spesifik.
Imunohistokimia
Suatu interaksi yang sangat spesifik antar
molekul adalah interaksi yang terjadi di antara
antigen dan antibodinya.
Oleh sebab itu, metode yang menggunakan antibodi
berlabel ternyata sangat berguna untuk
memperlihatkan dan menentukan letak protein
spesifik, dan tidak hanya protein dengan aktivitas
enzimatik yang dapat diperlihatkan oleh metode
histokimia.
Tubuh memiliki sel yang mampu membedakan
molekulnya sendiri (self) dari molekul asing. Bila
terpajan dengan molekul asing disebut antigen
tubuh dapat berespons dengan menghasilkan
antibodi yang bereaksi secara spesifik dan terikat
pada antigen sehingga membantu menyingki-,kan
zat asing. Antibodi adalah protein dari famili
imunoglobulin pada glikoprotein, yang dihasilkan
limfosit.
Pada imunohistokimia, sediaan jaringan (atau sel
dalam biakan) yang diduga mengandung protein
tertentu, diinkubasi dalam larutan yang
mengandung antibodi terhadap protein tersebut.
Antibodi terikat secara spesifik pada protein, yang
lokasinya kemudian dapat dilihat dengan
mikroskop cahaya atau mikroskop elektron,
bergantung pada jenis senyawa yang digunakan
untuk memberi label antibodi tersebut. Antibodi
umumnya dilabel dengan senyawa fluoresensi,
dengan peroksidase atau fosfatase alkali untuk
pendeteksian histokimiawi, atau dengan partikel
emas yang padat-elektron.
 Salah satu syarat terpenting untuk
imunositokimia adalah tersedianya antibodi
terhadap protein yang akan dideteksi. Artinya,
protein itu sebelumnya harus telah dimurnikan
dengan menggunakan cara biomikiawi atau
molekular sehingga antibodi untuk protein tersebut
dapat dihasilkan. Untuk menghasilkan antibodi
terhadap protein x dari spesies hewan tertentu
(misalnya, mencit atau manusia), protein tersebut
pertama-tama harus diisolasi dan kemudian
disuntikkan ke dalam seekor hewan dari spesies
lain (misalnya, kelinci atau kambing).
Jika sekuens asam amino protein tersebut cukup
berbeda bagi hewan ini untuk dikenali sebagai
benda asing artinya, sebagai suatu antigen hewan
itu akan menghasilkan antibodi terhadap protein
tersebut.
Beberapa kelompok (klon) limfosit dari hewan
yang disuntik dengan protein x dapat mengenali
berbagai bagian protein x dan setiap klon
menghasilkan sebuah antibodi terhadap bagian
tersebut. Antibodi-antibodi ini dikumpulkan dari
plasma hewan dan membentuk campuran
antibodi poliklonal; setiap antibodi ini mampu
mengikat regio yang berbeda di protein x.
 Akan tetapi, protein x dapat disuntikkan ke
dalam seekor mencit dan beberapa hari kemudian,
limfosit-limfosit yang teraktivasi diisolasi dan
menaruhnya ke dalam medium biakan
Pertumbuhan clan aktivitas sel-sel ini dapat
dipertahankan dalam waktu yang tidak terbatas
dengan menggabungkan sel tersebut dengan sel
tumor limfositik untuk membentuk sel hibridoma.
Berbagai klon limfosit akan menghasilkan berbagai
antibodi terhadap berbagai bagian protein x.
Setiap klon dapat dipisahkan dan dibiak terpisah
sehingga dapat diperoleh antibodi yang berbeda-
beda terhadap protein x secara terpisah.
Setiap antibodi ini adalah antibodi monoklonal.
Keuntungan dari penggunaan antibodi monoklonal
ketimbang antibodi poliklonal adalah, bahwa
antibodi monoklonal dapat diseleksi dengan
sangat spesifik dan terikat kuat pada protein yang
akan dideteksi sehingga jumlah ikatan nonspesifik
pada protein lain yang serupa menjadi lebih
sedikit.
Pada metode imunositokimia langsung, antibodi
(baik monoklonal maupun poliklonal) hares diberi
label yang sesuai. Sediaan jaringan diinkubasi
dengan antibodi untuk beberapa waktu sehingga
antibodi tersebut berinteraksi dengan dan terikat
pada protein x.
Sediaan tersebut kemudian dibilas untuk
menghilangkan antibodi yang tidak berikatan,
diproses dengan metode yang sesuai dan
diperiksa dengan mikroskop, untuk mempelajari
lokasi atau aspek lain protein x (Gambar 1-12).
Metode imunositokimia tak-langsung lebih
sensitif, tetapi membutuhkan dua antibodi dan
langkah-langkah tambahan. Alih-alih melabel
antibodi (primer) yang spesifik untuk protein x,
label yang dapat terdeteksi dikonjugasikan dengan
suatu antibodi sekunder yang terbentuk di suatu
spesies 'asing' yang berbeda terhadap suatu
golongan antibodi (antibodi primer tercakup dalam
golongan tersebut).
Contohnya, antibodi primer yang terbentuk oleh
limfosit mencit (seperti kebanyakan antibodi
monoklonal) secara -pesifik berikatan dengan
antibodi kelinci anti-mencit.
Pendeteksian imunositokimia tak-langsung
diawali dengan menginkubasi potongan jaringan
manusia yang diyakim mengandung protein x
dengan antibodi anti-x mencit. setelah dibilas,
sediaan jaringan diinkubasi dengan antibodi
kambing atau domba terhadap antibodi mencit.
Antibodi sekunder ini akan mengenali antibodi
kelinci yang telah mengenali protein x (Gambar 1-
12).
Protein x kemudian dapat dideteksi dengan teknik
mikroskopik yang sesuai untuk label yang
digunakan untuk antibodi sekunder. Terdapat
metode tak-langsung lainnya yang memakai
molekul perantara lain, seperti teknik biotin-avidin.
Contoh imunohistokimia tak-langsung
diperlihatkan pada Gambar 1-13, yang
memperlihatkan penggunaan metode pelabel
dengan sel dalam biakan atau setelah
pemotongan untuk pemeriksaan mikroskop
cahaya dan TEM.
APLIKASI MEDIS
Imunositokimia telah berperan penting dalam penelitian biologi set dan
kemajuan prosedur diagnostik medis. Tabel 1-1 memperlihatkan
beberapa aplikasi rutin prosedur imunositokimiawi dalam praktik klinis.
Teknik Hibridisasi
Tantangan utama dalam biologi sel modern
adalah memahami kerja sel secara molekular.
Tujuan ini memerlukan teknik yang dapat
menganalisis molekul yang terlibat dalam proses
informasi yang dihantarkan dari DNA menuju
protein. Banyak teknik yang bekerja berdasarkan
hibridisasi. Hibridisasi adalah penggabungan dua
untai tunggal asam nukleat (DNA dengan DNA,
RNA dengan RNA atau RNA dengan DNA) yang
saling mengenal bila untaian tersebut bersifat
komplementer. Semakin banyak kemiripan
sekuensnya, semakin mudah untai komplementer
membentuk molekul untaian ganda 'hibrid'.
 Jadi, hibridisasi memungkinkan pengenalan
sekuens DNA atau RNA yang spesifik. Hal tersebut
biasanya terlaksana dengan asam nukleat dalam
larutan, tetapi hibridisasi juga terjadi ketika larutan
asam nukleat diberikan secara langsung pada
sediaan sel dan jaringan, suatu prosedur yang
disebut hibridisasi in situ (ISH, in situ hybridization).
. Teknik tersebut ideal (1) untuk menetapkan
apakah sebuah sel memiliki urutan DNA yang khas
(seperti gen atau bagian dari gen), (2) untuk
mengidentifikasi sel yang mengandung mRNA yang
spesifik (dengan gen terkait yang ditranskripsikan),
atau (3) untuk menetapkan lokasi sebuah gen dalam
kromosom yang spesifik.
DNA dan RNA dalam sel harus didenaturasi dengan
panas atau dengan agen denaturasi terlebih dahulu
agar terpisah menjadi untai tunggal. Kedua untai
tersebut kini slap mengalami hibridisasi dengan
segmen DNA atau RNA untai-tunggal (yang disebut
probe) yang bersifat komplementer untuk sekuens
yang ingin dideteksi. Probe tersebut dapat
diperoleh melalui kloning, dengan amplifikasi PCR
dari sekuens sasaran, atau melalui sintesis, bila
sekuens yang dikehendaki tersebut pendek. Probe
harus diberi label, biasanya dengan isotop radioaktif
(yang lokasinya dapat ditentukan melalui
autoradiografi) atau dimodifikasi oleh suatu senyawa
kecil seperti digoksigenin (yang dapat diidentifikasi
dengan cara imunositokimia).
Suatu larutan yang mengandung probe dituangkan di
atas specimen untuk waktu tertentu yang diperlukan
untuk hibridisasi. Setelah kelebihan probe yang tidak
terikat dibilas, lokasi probe yang terhibridisasi akan
tampak dari labelnya (Gambar 1-14).
MASALAH PADA PENGKAJIAN SEDIAAN
JARINGAN
Hal penting yang perlu diingat selama mempelajari
dan menginterpretasi sediaan jaringan yang terpulas
di bawah mikroskop adalah bahwa sediaan mikroskop
merupakan hasil akhir dari sederetan proses yang
berawal dengan pengumpulan jaringan dan berakhir
dengan penempatan kaca penutup pada kaca objek.
 Beberapa tahapan prosedur ini clapat
mengubah bentuk jaringan, dan menghasilkan
kelainan struktural ringan yang disebut artifak.
Struktur yang terlihat secara mikroskopis dapat
berbeda dari struktur yang dijumpai saat struktur
tersebut masih hidup.
Salah satu distorsi tersebut adalah pengerutan
yang ditimbulkan oleh bahan fiksasi, oleh etanol,
dan oleh panas yang diperlukan untuk
pemendaman parafin. Akibat pengerutan adalah
timbulnya ruang artifisial di antara sel-sel dan
unsur jaringan lain.
Penyebab lain timbulnya ruang artifisial adalah
hilangnya molekul, seperti lipid, glikogen atau zat
dengan berat molekul rendah, yang tidak cukup kuat
ditahan dalam jaringan oleh bahan fiksasi atau
terbuang bersama cairan saat proses pengeringan
dan penjemihan. 'Patahan' ringan pads sediaan juga
terlihat sebagai ruang besar di jaringan.
Artifak lain dapat meliputi pengeriputan sediaan
(yang dapat disalah-artikan dengan struktur linear
seperti kapiler darah) dan endapan pemulas (yang
dapat dikacaukan dengan struktur sel seperti granul
sitoplasma). Mahasiswa harus menyadari adanya
artifak dan mampu mengenalinya.
 Hal lain yang perlu diingat dalam mempelajari
sediaan histologik adalah ketidakmungkinan
memulas semua unsur jaringan pads satu sediaan
saja. Dengan mikroskop cahaya, beberapa
preparat yang dipulas dengan metode yang
berbedabeda perlu diperiksa agar kita
memperoleh gambaran tentang komposisi dan
struktur sebuah jaringan. Sebaliknya, TEM
memungkinkan pengamatan sebuah sel dengan
segenap organel dan zat yang terkandung di
dalam sel, yang dikelilingi komponen matriks
ekstrasel.
 Akhirnya, bila sebuah jaringan tiga-dimensi
diiris menjadi sediaan yang sangat tipis, sediaan
tersebut tampaknya hanya memiliki dua dimensi:
panjang dan lebar. Ketika memeriksa suatu
sediaan di bawah mikroskop, kita harus selalu
ingat bahwa sesuatu dapat hilang di depan atau di
belakang sediaan tersebut karena banyak struktur
jaringan yang lebih tebal daripada sediaan
tersebut. Struktur bundar yang terlihat secara
mikroskopis dapat berupa irisan melalui struktur
sferis atau silinder dan saluran dengan irisan
melintang terlihat seperti cincin (Gambar 1-15).
 Juga, karena struktur dalam suatu jaringan
memiliki orientasi yang berbeda-beda, gambaran
dua-dimensinya akan bervariasi, yang bergantung
pada bidang irisan. Suatu saluran tunggal yang
berkelok akan terlihat secara histologic berupa
sejumlah struktur melingkar.
Untuk memahami arsitektur sebuah organ,
seseorang wring kah hares mempelajari sediaan-
sediaan dengan bidang irisan yang berbeda-beda.
Pemeriksaan sejumlah sediaan paralel (sediaan
serial) dan rekonstruksi gambaran tigadimensi
dapat menambah pemahaman suatu organ atau
organisms yang kompleks.
TERIMA KASIH