UJI KUALITATIF

PROTEIN
RIDA NURHAIDA, S.TP. S.Pd
OKTAVIANI BUDIARTI, S.Pd
DWI FATHONAH M W, S.Pd
TEAM PROKSIMAT
 UJI KUALITATIF PROTEIN
• Reaksi Biuret, • Reaksi Ninhidrin,
• Reaksi Xantoprotein, • Salting out test,
• Reaksi Hopkins-Cole, • Denaturasi protein
• Reaksi Millon,
 UJI KUALITATIF PROTEIN

HARUS PAHAM STRUKTUR 20 ASAM AMINO

 UJI BIURET
• Metode biuret didasarkan pada prinsip zat yang mengandung dua
atau lebih ikatan peptida dapat membentuk kompleks berwarna
ungu dengan garam Cu dalam larutan alkali.
• Metode biuret ini merupakan metode yang baik untuk menentukan
kandungan larutan protein karena seluruh protein mengandung
ikatan peptida.
 IDENTIFIKASI UJI BIURET
• Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks
antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida.
• Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaruhi warna reaksi ini.
• Senyawa dengan dipeptida memberikan warna biru, tripeptida ungu dan tetrapeptida serta peptida
kompleks memberikan warna merah.
• Biuret dihasilkan dengan memanaskan urea kira-kira pada suhu 180 oC dalam larutan basa. Biuret
memberikan warna violet dengan CuSO4. Reaksi ini disebut dengan reaksi biuret, kemungkinan
terbentuknya Cu2+ dengan gugus CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa.
 IDENTIFIKASI UJI BIURET
• Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks
antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida.
• Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaruhi warna reaksi ini.
• Senyawa dengan dipeptida memberikan warna biru, tripeptida ungu dan tetrapeptida serta peptida
kompleks memberikan warna merah.
• Biuret dihasilkan dengan memanaskan urea kira-kira pada suhu 180 oC dalam larutan basa. Biuret
memberikan warna violet dengan CuSO4. Reaksi ini disebut dengan reaksi biuret, kemungkinan
terbentuknya Cu2+ dengan gugus CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa.
 PERSAMAAN REAKSI
UJI BIURET

Larutan protein dibuat alkalis

dengan NaOH kemudian
ditambahkan larutan Cupri Sulfat
( CuSO4) encer.
 UJI BIURET
PRINSIP KERJA
• Didasarkan pada pembentukan senyawa
kompleks berwarna ungu ikatan peptida
dalam protein dengan Cu2+ pada suasana
basa.
PROSEDUR
- Campurkan 2 mL NaOH 2N dengan 2
tetes CuSO4 1% dalam 2 buah tabung
reaksi.
- Tambahkan 1 mL larutan sampel dan
albumin ke dalam masing-masing tabung
- Terbentuknya warna ungu menunjukan
adanya protein pada contoh.
 https://www.youtube.com/watch?
v=ijxMMRljnjs&feature=emb_rel_end
 UJI XANTHOPROTEAT
• Uji xantoprotein merupakan uji kualitatif pada protein yang
digunakan untuk menunjukkan keberadaan gugus benzene.
• Metode analisis protein ini menggunakan larutan asam nitrat pekat,
yang merupakan salah satu asam pekat. Larutan asam nitrat ini
ditambahkan dengan ke dalam larutan protein.
 UJI XANTHOPROTEAT
PRINSIP KERJA
• Nitrasi dari gugus benzen pada protein
dengan HNO3 pekat akan menghasilkan
senyawa berwarna kuning, dan dengan
NaOH membentuk garam yang berwarna
jingga.
PROSEDUR KERJA
- Campurkan 2 mL larutan sampel dan
albumin dalam tabung reaksi berbeda
dengan 1 mL HNO3 pekat
- Panaskan campuran perlahan-lahan, lalu
dinginkan.
- Tambahkan 5 – 10 tetes larutan NaOH 50%.
- Terbentuknya warna jingga menandakan
adanya gugus benzen dalam protein.
 IDENTIFIKASI UJI XANTHOPROTEAT

HASIL POSITIF PERSAMAAN REAKSI

• Asam amino yang menunjukkan reaksi positif
untuk uji ini adalah tyrosin, phenilalanin, dan
tryptophan.
• Reaksi positif uji xantoprotein adalah
munculnya gumpalan atau cincin warna
kuning. Pada uji ini, digunakan larutan HNO3
yang berfungsi untuk memecah protein
menjadi gugus benzene
https://www.youtube.com/watch?
v=VCzu3sCEE1c
 UJI MILLON
• Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam
asam nitrat, apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein,
akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi
merah oleh pemanasan.
 FUNGSI PEREAKSI MILLON
• Fungsi larutan millon adalah sebagai pereaksi yang bereaksi dengan sampel yang mengandung
gugus aromatik membentuk endapan putih yang mana ketika dipanaskan akan membentuk
senyawa kompleks berwarna merah.
• Fungsi pemanasan adalah untuk membuat protein mengalami denaturasi atau kerusakan,
sehingga diharapkan molekul protein yang terdiri dari banyak polipeptida dapat terputus menjadi
molekul-molekul penyusunnya yang lebih kecil, sehingga hal ini diharapkan dapat mempercepat
reaksi.
• Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan
gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein ini mengandung tirosin akan memberikan hasil positif.
 Perbedaan uji Xanthoproteat dan uji
Millon
Uji xanthoproteat Uji Millon
• pada uji xanthoprotein yang diuji adalah
semua asam amino aromatik yaitu tirosin, • pada uji Millon yang diuji hanya tirosin saja
fenilalanin dan triptofan (Poedjiadi, 1994).
 UJI MILLON
PRINSIP KERJA
• Tirosin dengan pereaksi Millon akan
membentuk tirosin ternitrasi yang dengan
ion Hg2+ akan membentuk senyawa
merah.
PROSEDUR KERJA
- Campurkan 3 mL larutan sampel dan
albumin dalam tabung reaksi berbeda
dengan 5 tetes pereaksi Millon
( Hg2(NO3)2 5% & Hg(NO3)2 5% )
- Panaskan campuran perlahan-lahan
selama 1-2 menit, lalu dinginkan.
- Terbentuknya warna merah menunjukkan
adanya tirosin dalam contoh.
HASIL POSITIF UJI MILLON

VIDEO PRAKTIKUM
• https://www.youtube.com/watch?
v=YjdfZG0N2Uo
 UJI HOPKINS - COLE
• Uji hopkins cole atau tes hopkins cole merupakan uji kimia yang digunakan untuk menunjukkan
adanya asam amino triptofan.
• Pereaksi yang dipakai mengandung asam glioksilat.
• Kondensasi 2 inti induk dari trptofan oleh asam glioksilat akan menghasilkan senyawa berwarna
ungu.
• Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya cincin ungu pada bidang batas.
 UJI HOPKINS - COLE
PRINSIP KERJA
• Gugus triptofan dalam protein akan
berkondensasi dengan aldehid dalam
pereaksi Hopkins-cole dalam suasana
asam kuat membentuk cincin berwarna
ungu.
PROSEDUR KERJA
- Campurkan 2 mL larutan sampel dan albumin
dalam tabung reaksi berbeda dengan 1 mL
pereaksi Hopkins cole yang mangandung asam
glioksilat.
- Tambahkan 3 mL H2SO4 pekat kedalam
campuran melalui dinding tabung reaksi, lalu
diamkan.
- Terbentuknya cincin ungu diperbatasan larutan
manandakan adanya gugus tryptofan dalam
sampel.
HASIL POSITIF UJI HOPKINS-COLE

VIDEO PRAKTIKUM
• https://www.youtube.com/watch?
v=7w3xLnFsB7s
 UJI NINHIDRIN
• Uji Ninhidrin atau tes ninhidrin digunakan untuk menunjukkan adanya asam amino dalam zat yang
di uji . Dalam uji ini digunakan larutan ninhidrin untuk mendeteksi semua jenis asam amino.
• Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) merupakan senyawa kimia yang digunakan untuk
mendeteksi gugus amina dalam molekul asam amino.
• Hasil positif ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru/keunguan yang disebabkan
oleh molekul ninhidrin dan hidrindantin yang yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino
tersebut dioksidasi.
 Uji Ninhidrin

Prinsip kerja Prosedur

• Didasarkan pada pembentukkan senyawa - Campurkan 2 mL larutan sampel dan
berwarna ungu hasil reaksi antara asam albumin dalam tabung reaksi berbeda
amino bebas dengan ninhidrin dengan 10 tetes larutan Ninhidrin 0,1 %.
teroksidasi. - Panaskan campuran perlahan-lahan
selama 1-2 menit, lalu dinginkan.
- Terbentuknya warna ungu menandakan
adanya asam amino bebas dalam
sampel.
HASIL POSITIF UJI NINHIDRIN

VIDEO PRAKTIKUM
• https://www.youtube.com/watch?
v=edTRUi8H1Do
• https://www.youtube.com/watch?
v=82hDLnPTPr0
 Salting out test
• Ketika konsentrasi garam meningkat, sebagian dari molekul-molekul air
akan tertarik oleh ion garam, yang kemudian akan mengurangi jumlah
molekul air yang dapat berinteraksi dengan bagian hidrofobik protein.
• Sebagai akibat dari meningkatnya permintaan molekul solven , interaksi
antar protein menjadi lebih kuat daripada interaksi antara pelarut dan zat
terlarut, Hal ini akan menyebabkan molekul-molekul protein mengental
dengan membentuk interaksi hidrofobik dengan satu sama lain. Proses ini
dikenal sebagai salting-out.
• salting out terjadi ketika pada konsentrasi garam yang tinggi, garam akan
lebih cenderung mengikat air dan menyebabkan agregasi. Sehingga
molekul protein mengalami presipitasi.
• Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein
ditambahkan garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah
sebagai endapan. Peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out.
 Salting out test
Prinsip kerja
• adanya garam netral dalam larutan
protein akan menarik air dari mantel air
protein hingga protein kehilangan air,
kemudian menggumpal dan mengendap
Prosedur kerja
- Kedalam 2 mL larutan sampel dan albumin
dalam tabung reaksi yang berbeda,
tambahkan (NH4)2SO4 padat sedikit demi
sedikit sambil diaduk hinggab(NH4)2SO4
tidak melarut lagi.
- Pisahkan endapan yang terbentuk dan
supernatannya
- Uji endapan dan supernatan dengan cara
biuret.
 Prosedur salting out test
Uji kelarutan endapan
• Larutan albumin dalam air dapat diendapkan
dengan penambahan amoniumsulfat ((NH4)2SO4)
hingga jenuh. Setelah larutan albumin
dijenuhkan dengan (NH4)2SO4, uji kelarutan
endapan yang terjadi dengan air menunjukkan
hasil positif (endapan larut membentuk
butiran). Kemudian butiran direaksikan dengan
pereaksi milon, dan bereaksi positif dengan
ditandai endapan berwarna kemerahan.
Uji filtrat
• Uji filtrat dengan pereaksi biuret juga
menunjukkan hasil positif yang ditandai
larutan berwarna ungu violet. Pengujian
endapan yang dihasilkan dengan pereaksi
milon bertujuan untuk mengetahui ada
tidaknya kandungan tirosin, sedangkan
pengujian filtrat dengan pereaksi biuret
bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya
gugus amida pada filtrat yang dihasilkan.
Salting out test

Video animasi
• https://www.youtube.com/watch?
v=gnhUh6qVD5Y
 Denaturasi Protein
• Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur
sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-
ikatan kovalen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan
hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul protein
• Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik
non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan
menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga
mengacaukan ikatan molekul tersebut.
• Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemasakan.
Beberapa makanan dimasak untuk mendenaturasi protein yang dikandung
supaya memudahkan enzim pencernaan dalam mencerna protein tersebut.
Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan
mengikat airnya menurun.
• Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi
non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan
ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya
berlangsung pada kisaran suhu yang sempit.
Prinsip kerja Prosedur kerja
• Protein dalam suasana asam dan - Kedalam 2 mL larutan sampel dan
dengan adanya pemanasan akan albumin dalam tabung reaksi yang
mengendap, endapan ini adalah protein berbeda, tambahkan 5-10 tetes
yang telah berubah sifatnya. CH3COOH 5 N sambil dipanaskan.
- Amati perubahan yang terjadi.
 Denaturasi protein

Perubahan struktur protein Video praktikum

• https://www.youtube.com/watch?
v=ilHE8G9bQEc