Pembuatan Antibiotik Kloramfenikol dengan

Metode Rekayasa Genetik dari Bakteri

Streptomyces sp
Bioteknologi dalam Farmasi
• Bioteknologi adalah bidang ilmu yang mempelajari
pemanfaatan makhluk hidup dalam memproduksi suatu
bahan.
• Definisi yang tercantum dalam Farmakope Amerika (USP)
adalah “Penggunaan organisme hidup (sel mamalia) untuk
produksi produk bermanfaat”. Definisi sempitnya adalah
teknologi DNA rekombinan (transfer DNA dari 1
organisme ke organisme lain).
• Bioteknologi dalam bidang farmasi yakni pembuatan
antibiotik, vaksin, vitamin, steroid, hormon, antibodi,
inhibitor enzim, dan pereaksi untuk diagnostik.
 Kloramfenikol
• Kloramfenikol pada awalnya dari Streptomyces venezuela yang
pertama kalinya diisolasi oleh Burkholder tahun 1947 dari contoh
tanah yang diambil dari Venezuela, sekarang telah dapat dibuat
melalui sintesis yang metodenya relatif lebih sederhana dan biaya
murah.
• Kloramfenikol digunakan sebagai antibiotik bersifat bakteriostatik
dan mempunyai spektrum luas.
• Obat pilihan untuk pengobatan demam tifoid akut yang disebabkan
oleh Salmonella sp
• Efektif terhadap riketsia, konjungtivitis akut yang disebabkan oleh
Pseudomonas sp
• Efektif untuk pengobatan infeksi berat oleh gram positif dan gram
negatif
 Pertumbuhan Streptomyces sp
• Tahap biosintesis, dengan menumbuhkan Streptomyces sp pada
medium yang sesuai dan menghasilkan jumlah sel maksimal,
setelah itu berhenti pertumbuhannya dan memasuki fase stasioner,
akhirnya diikuti oleh kematian sel vegetatif atau pembentukan
spora.
• Pada stadium ini, setelah sel-sel berhenti membelah, metabolit
sekunder mulai diproduksi dalam jumlah besar dan kebanyakan
disekresikan ke dalam medium biakan. Kebanyakan antibiotik
merupakan metabolit sekunder.
• Biosintesis mengubah senyawa awal menjadi senyawa baru yang
lebih bermanfaat dengan pertolongan suspensi sel.
• Berdasarkan biosintesis, metabolit sekunder dapat diumpankan
dengan prazat untuk menjadi produk yang lebih cepat dengan
kultur suspensi sel.
• Prazat dapat merangsang aktivitas enzim tertentu yang terlibat
dalam jalur biosintesis, sehingga dapat meningkatkan produksi
metabolit sekunder.
• Senyawa yang diinginkan dapat ditingkatkan dengan cara
memanipulasi media maupun dengan penambahan
prekursor/prazat, merangsang aktivitas enzim tertentu yang terlibat
dalam jalur biosintesis, sehingga dapat meningkatkan produksi
metabolit sekunder.
Pembuatan Antibiotik Kloramfenikol dari
Bakteri Streptomyces sp.

• Dengan majunya teknologi dan ilmu pengetahuan, pembuatan

antibiotik Kloramfenikol dilakukan dengan cara Rekayasa Genetik.
• Rekayasa Genetik adalah mengubah susunan gen untuk mengubah
sifat organisme sehingga memiliki kemampuan yang diingginkan/
unggul.
 Teknik Rekayasa Genetika
Amplifikasi gen
• Amplifikasi gen adalah proses dimana plasmid/bakteriofag yang
diinduksikan ke dalam sel dan kemudian berkembang dengan cepat.
Amplifikasi gen sering dilakukan pada sel-sel yang berfungsi sebagai
penghasil suatu senyawa, diantaranya: Enzim, Antibiotik, Vitamin, dll.
Rekombinasi gen
• Rekombinasi gen adalah pembetukan rekombinan baru dari material
yang dapat diturunkan dengan cara penyisipan DNA dari luar
kedalam suatu wahana (vektor), sehingga memungkinkan
penggabungan dan kelanjutan berkembang dalam host yang baru.
Rekombinasi gen dapat dilakuan dengan cara memotong DNA dan
kemudian disambung dengan DNA yang baru yang membawa sifat
unggul.
 Pembuatan DNA Rekombinan
• Adapun tahap-tahap pembuatan DNA rekombinan:
1. Cari DNA unggul.
2. Siapkan vector.
– Vektor adalah alat untuk memasukan DNA ke dalam makhluk
hidup yang akan diubah sifatnya. Vektor biasa berupa virus atau
plasmid dari bakteri.
3. Memasukan DNA rekombinan ke dalam sel.
4. Kloning DNA rekombinan, DNA yang sudah dimasukkan ke dalam sel
diperlakukan sedemikian rupa agar bakteri yang dimasukkan DNA
itu melipatgandakan DNA tersebut di dalam selnya.
2 jenis enzim yang berpengaruh
• Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa
adanya dua jenis enzim, yaitu:
1. Enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai “gunting”
untuk memotong DNA pada situs spesifik.
2. Enzim ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua
molekul DNA di dalam tabung reaksi.

• DNA rekombinan ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali

dengan memperbanyaknya di dalam sel inang. Proses ini disebut
sebagai transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005).
 Enzim Restriksi
• Restriksi merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs
tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim
restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk
memotong fragmen DNA pada situs spesifik.
• Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong
hanya di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim
restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan
kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan
gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya.
• Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan
ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika
dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya
rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan.
 Enzim Ligase
• Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA
dengan fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert
disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis
vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan
cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk
organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC),
Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan
Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).
• Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim
Ligase. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan
fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan
fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong
pada bagian yang sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector,
 Tahap Oksidasi terakhir Kloramfenikol
butuh enzim Oksidase
• Dari family sama yaitu Mycobacterium mempunyai enzim oksidase
yang lebih baik dari Streptomyces. Karena Mycobacterium
mempunyai FGD (Phospo-di-hydrogenase) dan Streptomyces tidak
mempunyainya. (Endang Purwantini,1996).
• Solusi dari permasalahan tersebut ialah dengan menggunakan
metode cloning gen FGD (Phospo-di-hydrogenase) dari
Mycobacterium ke Streptomyces.
• Agar Produksi Kloramfenikol meningkat.
• Metodenya yaitu:
1) Ambil gen FGD (Phospo-di-hydrogenase)
2) Masukkan kedalam vector PIJ 702
3) Transformasi ke dalam Stroptomyces. (D.A Hopwood, M.J, 1985)
TERIMA KASIH