ANALISIS KADAR

PROTEIN
 METODE PENENTUAN PROTEIN

1. Metode Kjeldahl
2 Metode Dye binding
3. Metode Biuret
4. Metode Lowry
5. Metode Ultraviolet
 Metode Kjeldahl
Metode Kjeldahl dikembangkan sejak
tahun 1883 pertama kali oleh Johann
Kjeldahl.
Metode Kjeldahl dapat dibagi menjadi
3 langkah :
- digest
- netralisasi
- titrasi
Metode Kjeldahl
Metode
Kjeldahl
 Digest
 Sampel makanan yang akan dianalisis ditimbang dalam
labu, kemudian didigest dengan memanaskannya dalam
asam sulfat (oksidator), natrium sulfat anhydrous dan suatu
katalis, seperti tembaga, selenium, titanium atau merkuri.
 Digestion ini mengubah setiap nitrogen menjadi amoniak,
dan bahan organik yang lain menjadi C02 dan H20.
 Amoniak dalam larutan asam ada dalam bentuk ion
amonium (NH4+) yang terikat pada sulfat dan tetap ada
dalam larutan
 N(makanan) (NH4)2SO4 (1)
 Netralisasi
 Setelah digesti sempurna, larutan dalam labu
dibuat bersifat basa dengan penambahan NaOH,
yang mengubah ammonium sulfat menjadi gas
amoniak :
(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4
 Gas amoniak ditampung dalam labu penampungan
yang mengandung asam boraks berlebihan.
Amoniak akan berubah menjadi ion amonium
NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3-
 Titrasi
 Kandungan nitrogen dihitung dengan titrasi
amonium borat dengan larutan standar asam sulfat
atau asam klorida dengan indikator yang sesuai.
H2BO3- + H+ H3BO3
 Konsentrasi ion hidrogen (dalam mol) ekuivalen
dengan konsentrasi nitrogen dalam sampel
 Konsentrasi nitrogen dalam sampel dengan berat
m dan konsentrasi HCl yg digunakan x M adalah :

% N = [(V HCl Sp – V HCl Blk) x N HCl x 14 x 100]/ mg Sp

 Titrasi
 Vs dan Vb adalah volume titrasi untuk
sampel dan blangko
 14 adalah berat molekul nitrogen N
 Sampel blangko biasanya diukur bersamaan
dengan sampel analit
 %Protein = F´ %N
 F’ adalah faktor konversi.
 Faktor konversi dari nitrogen ke protein
untuk bahan pangan

Bahan Makanan:
Bir, Sirup, Biji-bijian, Ragi = 6,25
Buah-buahan, teh, anggur = 6,25
Makanan ternak = 6,25
Beras = 5,95
Roti, Gandum, Makaroni, Mie = 5,70
Kacang Tanah = 5,46
Kedele = 5,75
Kenari = 5,18
Susu = 6,38
Gelatin = 5,55
 Keuntungan dan kerugian
 Keuntungan
- Merupakan metode standar yang banyak digunakan
dalam skala internasional
- Presisi dan reprodusibilitas tinggi
 Kerugian
- Tidak memberikan ukuran real kadar protein, karena
nitrogen dalam sampel tidak semuanya merupakan protein
- Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang
berbeda karena perbedaan urutan asam amino
- Penggunaan asam sulfat pekat pada temperatur tinggi
berbahaya, demikian juga dengan katalisnya
- Teknik Kjeldahl ini membutuhkan waktu yg lama
Tidak semua N adalah protein
Purine
Pyrimidine DNA, RNA, etc.
Urea
Jaringan tanaman mempunyai > 50% N non-protein
 2. METODE IKATAN ZAT WARNA
Prinsip: Pada pH rendah, gugus basa protein bermuatan (+) yang
secara kuantitatif berikatan dengan zat warna yang bermuatan (-).

+
NH 3
CH 2 H
+
CH 2 CH 2 N C NH 2
Lysine
CH 2 CH 2 NH 2
CH 2 O CH 2 Arginine
H
CH N C CH
N C C N
H H
O CH 2
C NH +

HC CH Histidine
N
H
 METODE IKATAN ZAT WARNA

Acid Orange 12:

-
SO3
HO
N=N

Prosedur:
1. Campur protein, zat warna dan, buffer pH = 2.
2. Saring atau sentrifuge.
3. Ukur densitas optik (O.D.) dari filtrat.
 3. Biuret Method

Prinsip: Cu++ dalam larutan alkali membentuk kompleks dengan

ikatan-ikatan peptida – menghasilkan warna abu-abu pink

Ukur intensitas warna pada 540 nm.

A at 540 nm

% Protein (Kjeldalh)
 Biuret Method
 Reagen biuret yang mengandung semua kemikalia yang
dibutuhkan untuk melakukan analisis dapat dibeli secara
komersial
 Reagen biuret dicampur dengan larutan protein dan dibiarkan
selama 15-30 menit sebelum absorbansinya diukur pada 540
nm.
 Keuntungan utama metode ini adalah tidak ada interferensi
dari bahan yang menyerap pada panjang gelombang yang
lebih rendah.
 Metode ini kurang sensitif terhadap jenis-jenis protein karena
absorbsi melibatkan ikatan2 peptida yang umum untuk semua
protein daripada gugus2 spesifik
 Metode ini sensitifitasnya relatif rendah dibandingkan metode
UV-Vis yang lain.
Biuret Assay
 Uji Biuret
 Prosedur – Reaksi biuret merupakan suatu
metode yang dapat digunakan untuk menentukan
jumlah protein yang dapat larut
 Reagen biuret bereaksi dengan ikatan-ikatan
peptida dan warna kompleksnya berubah warna.
 Spectrofotometer dapat digunakan untuk
mengukur intensitas warna yang dihasilkan.
Semakin banyak protein yang ada, warnanya
makin gelap
Kurva standar Uji Biuret
 Uji Biuret
 Karena komponen-komponen larutan biuret
menyerap sejumlah sinar, oleh karena itu harus
dikurangi terhadap absorbsi total protein sendiri.
 Dilakukan dengan menggunakan tabung yang
hanya mengandung larutan biuret sebagai blangko
Biuret Assay
 4. Metode Lowry
• Cu++ dalam larutan alkali membentuk kompleks dengan protein.
• Cu++ mengkatalisis oksidasi gugus fenol dari tyrosine dengan asam
fosfomolibdat-fosfotungsten.
• Salah satu metode yang paling sensitif
750 nm
A at

 g of protein (Kjeldahl)
 Lowry Method
 Metode Lowry mengkombinasikan reagen biuret
dengan reagen yang lain (reagen fenol Folin-
Ciocalteau) yang bereaksi dengan residu-residu
tyrosine dan tryptophan dalam protein.
 Menghasilkan warna kebiruan yang dapat dibaca
pada 500 - 750 nm tergantung pada sensitivitas yang
dibutuhkan.
 Metode ini lebih sensitif pada konsentrasi protein
yang rendah dibandingkan dengan metode biuret
 5. Serapan Ultra-violet (UV) pada 280 nm

1. Gugus-gugus Kromofor asam amino aromatik

(Tyrosin, Tryptofan).
2. Absorpsi pada 280 nm.
3. Perhitungan konsentrasi protein didasarkan pada
absorpsi
 Serapan Ultra-violet (UV) pada 280 nm

 Tryptophan dan tyrosine menyerap kuat sinar ultraviolet

pada 280 nm.
 Kadar tryptophan dan tyrosine dari banyak protein tetap
konstan, sehingga absorbansi larutan protein pada 280 nm
dapat digunakan untuk menentukan konsentrasinya.
 Keuntungan metode ini adalah prosedurnya mudah
dilakukan, nondestruktif dan tidak membutuhkan reagen
khusus
 Kerugian metode ini adalah asam nukleat juga menyerap
kuat pada 280 nm dan dapat menginterferensi pengukuran
protein jika konsentrasi asam nukleatnya cukup besar.
 Untuk mengatasi masalah ini misalnya dengan mengukur
absorbansi pada 2 panjang gelombang yang berbeda
 6. Metode Fluoresensi

Tyrosine dan tryptofan merupakan senyawa fluorescent

Tereksitasi pada 280 nm.
Diukur emisinya pada 348 nm.
Keuntungan : lebih sensitif daripada serapan UV
 Metode Fluorescence

Emitted Fluorescence at 348 nm

mg of protein/ml of solution
 Metode Fluorescence
What is fluorescence and how to measure it?

Excited State Emits radiation

(fluorescence)
Decay yields
fluorescence at
longer wavelength

Ground State
 7. Metode Turbidimetri
 Molekul Protein yang biasanya dapat larut
diendapkan dengan penambahan sejumlah
kemikalia seperti trichloroacetic acid.
 Pengendapan Protein menyebabkan larutan
menjadi keruh
 Konsentrasi protein dapat ditentukan
dengan pengukuran derajat turbiditasnya