PENDAHULUAN (SPEKTROFOTOMETER) Kelompok 2 Oleh : Hilda Nur Rizkiany G84090016 DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM INSITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

Pendahuluan Beer dan lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan kimia dengan gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam hukum Beer-Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan menggunakan alat instrumentasi yakni spektrofotometer (P Tipler 1991). Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromati, penggabungan bersama dinamakan sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan elektronika sifat kimia dan fisiknya dan detektor yang digunakan secara langsung mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi (Ia). Kemampuan ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda. (Khopkar 2007) Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur transmitans atau absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang lebih mendalam dari absorbsi

energi. Hukum Beer menyatakan absorbansi cahaya berbanding lurus dengan dengankonsentrasi dan ketebalan bahan/medium (Miller J.N 2000) Proses yang dilakukan terkait dengan pekerjaan dan riset dalam bidang Biokimia adalah pengukuran analitik. Tujuan pengukuran pada prinsipnya adalah untuk mencari nilai sebenarnya dari suatu parameter kuantitas kimiawi. Nilai sebenarnya adalah nilai yang mengkarakterisasi suatu kuantitas secara benar dan didefinisikan pada kondisi tertentu yang eksis pada saat kuantitas tersebut diukur, beberapa contoh parameter yang dapat ditentukan secara analitik adalah konsentrasi, pH, temperatur, titik didih, kecepatan reaksi, dan lain lain. Pengukuran parameter-parameter ini sangat penting, karena data yang diperoleh nantinya tidak hanya sebagai ukuran angka-angka biasa namun juga baik kualitatif maupun kuantitatif dengan dapat menunjukkan nilai besaran yang sebenarnya. Setting nilai absorbansi = 0. Setting nilai transmitansi = 100 % (Beran, J.A 1996). Larutan yang akan digunakan dalam penggunaan spektrofotometer adalah larutan blanko. Larutan blanko merupakan larutan yang tidak mengandung analat untuk dianalisis (Basset 1994). Larutan blanko digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai nilai 100% transmittans. Kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Terdapat dua metode untuk membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square (Underwood 1990). Tujuan Praktikum ini bertujuan memperkenalkan alat laboratorium, berupa spectrophotometer dan membuat kurva standar untuk pengukuran sampel dengan spektrofotometer. Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah spectronic 20-D, kuvet, tabung reaksi, pipet volumetric 5 ml, pipet tetes, dan gelas piala 150 ml. Bahan yang digunakan adalah metilen blue, sampel, dan aquades. Prosedur Prosedur praktikum ialah menentukan penentuan panjang gelombang dan pembuatan kurva standar. Percobaan penentuan panjang menyiapkan larutan metilen biru (BM = 319.86 gr/mol) dengan konsentrasi 0.0000, 0.00002, 0.00004, 0.000006, 0.000008 dan 0.0001 masing-masing 10 ml di dalam tabung reaksi. Air sebanyak 10 ml disiapkan dalam tabung reaksi sebagai blanko. Kalibrasi alat dan dimasukkan ke dalam spektrofotometer dan dilihat nilai transmitannya pada

panjang gelombang 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, dan 680 nm. Selanjutnya kurva hubungan antara absorban dan panjang gelombang dibuat berdasarkan data yang diperoleh. Panjang gelombang maksimum untuk larutan metilen biru ditentukan dari nilai absorban tertinggi pada kurva tersebut. Percobaan selanjutnya pembuatan kurva standar. Spektrofotometer yang akan digunakan diatur dengan panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh pada percobaan pertama. Larutan metilen biru dengan berbagai konsentrasi yang telah disiapkan dimasukkan dimasukkan satu per satu ke dalam spektrofotometer dan dilihat nilai transmitannya. Percobaan terakhir mengukur nilai absorbans sampel dengan cara menghitung persamaan yang diperoleh dari absorbans biru metilen. Hasil dan Perhitungan Tabel 1 Data hasil pengukuran panjang gelombang maksimum (max) (nm) 600 610 620 630 640 650 660 670 680 Absorban 0.662 0.688 0.694 0.692 0.712 0.736 0.724 0.634 0.435

Tabel 2 Data hasil pengukuran metilen blue (=650 nm) [ Biru Metilen](M) blanko 2.10-5 0.378 4.10-5 1.646 6.10-5 1.935 8.10-5 2.884 1.10-4 2.993 Tabel 3 Penentuan Konsentrasi sampel Absorban 0.000

Ulangan 1 2 3

Absorban 1.298 1.296 1.298

[sampel](M)

Rata-rata [sampel](M)

3.953 10-5 3.947 10-5 3.951 10-5 3.953 10-5

Persamaan garis Y = 0.0128+32513,4x, r = 0.97 Perhitungan data (ulangan 1) 1.298 = 0.0128+32513.4x x = 3.953 10-5 Pembahasan Panjang gelombang cahaya UV atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit akan menyerap cahaya dalam daerah tampak (yakni senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang lebih pendek. Prinsip percobaan ini menentukan konsentrasi sampel dengan menggunakan kurva standar biru metilen yang menghubungkan konsentrasi dengan nilai absorbannya. Percobaan pertama menentukan panjang gelombang untuk memperoleh panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang yang dipakai dari 600 nm sampai 680 nm. Nilai absorban tertinggi pada saat panjang gelombang 650nm dan nilai absorban 0.736. panjang gelombang ini ditentukan sebagai panjang gelombang maksimum. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk mengetahui ketika absorpsi mencapai maksimum sehingga meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar (Rohman 2007). Pemilihan panjang gelombang maksimum sangat menentukan dalam percobaan karena apabila terjadi penyimpangan yang kecil selama percobaan akan mengakibatkan kesalahan yang kecil dalam pengukuran. Jika pemilihan panjang gelombang memiliki spektrum perubahan besar pada nilai absorbansi saat panjang gelombang sempit, maka apabila terjadi penyimpangan kecil pada cahaya yang masuk akan mengakibatkan kesalahan besar dalam pengukuran. Semakin besar panjang gelombangnya maka akan semakin kecil nilai absorbansinya. Hal ini dapat diakibatkan sinar putih pada setiap panjang gelombang dapat terseleksi lebih detail oleh prisma (Underwood

1990). Menurut Cahyanto 2008, larutan metilen biru memiliki panjang gelombang maksimum sebesar 660 nm. Nilai absorbansi dari enam lima konsentrasi biru metilen yang berbeda selanjutnya dibuat kurva standar dengan menghitung persamaan garis antara konsentrasi dengan absorbannya. Terdapat dua metode untuk membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square (Underwood 1990). Data yang diperoleh hasil spektrofotometer absorban biru metilen sebagai berikut 0.0378 untuk konsentrasi 0.00002, 1.646 untuk konsentrasi 0.00004, 1.935 untuk konsentrasi 0.00006, 2.884 untuk konsentrasi 0.00008 dan 2.993 untuk konsentrasi 0.0001. Metode yang digunakan dalam percobaan ini menghitung persamaan garis dengan metode grafik, absorban sebagai sumbu x dan konsentrasi biru metilen sebagai sumbu y. sehingga persamaan garisnya adalah Y= 0.0128+32513,4x dan r = 0.97. Fungsi biru metilen di bidang Biokimia adalah untuk pewarnaan, sehingga mempermudah dan memperjelas jika akan mengamati bagian dari suatu sel. Fungsi persamaan garis biru metilen selanjutnya digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel. Sampel diambil dan dimasukkan ke dalam kuvet. Nilai absorban dibaca dengan alat spectronic. Pengukuran absorban sampel diulang sebanyak triplo, tujuannya mendapatkan konsentrasi yang tepat. Nilai absorban dimasukkan ke-y, maka didapatkan nilai x. Nilai x itulah konsentrasi dari sampel. Konsentrasi yang didapat dari percobaan ini adalah 3.953 10-5 M, 3.947 10-5 M,dan 3.953 10-5 M. Sehingga rata-rata konentrasi sampelnya 3.951 10-5 M. Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah (1) Sumber energi radiasi yang kontinu dan meliputi daerah spektrum, di mana alat ditujukan untuk dijalankan, (2) Monokromator, yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi suatu berkas sempit dari panjang gelombang-panjang gelombang daru spektrum luas yang disiarkan oleh sumber (tentu saja tepat monokromatisitas tidak dicapai), (3)Wadah untuk contoh, kuvet yang terbuat dari kuarsa memeliki ketelitian yang tinggi, (4) Detektor yang merupakan suatu transducer yang mengubahenergi radiasi menjadi isyarat listrik, (5) Penguat dan rangkaian yang bersangkutan yang membuat isyarat listrik cocok untuk diamati, (6) Sistem pembacaan yang dapat mempertunjukkan besarnya isyarat listrik (Rohman. 2007). Penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis menggunakan spektrofotometer adalah serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi matrik selain komponen yang akan dianalisis. Kesalahan kedua serapan oleh kuvet. Kuvet yang biasa digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa. Dibandingkan dengan kuvet dari bahan gelas, kuvet kuarsa memberikan kualitas yang lebih baik, namun tentu saja harganya jauh lebih mahal. Serapan oleh kuvet ini diatasi dengan penggunaan jenis, ukuran, dan bahan kuvet yang sama untuk tempat blangko dan sampel.Kesalahan ketiga fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi yang sangat rendah atau sangat tinggi. Hal ini dapat diatur dengan pengaturan

konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan. (melalui pengenceran atau pemekatan) (Beran, J.A 1996). Simpulan Simpulan praktikum ini adalah sperktrofotometer digunakan untuk menghitung absorban biru metilen. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang maksimum, 650 nm. Hasil absorbansi biru metilen digunakan sebagai kurva standar yang menghubungkan konsentrasi dan absorbannya. Selanjutnya kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang belum diketahui konsentrasinya. Praktikan mampu menggunakan alat spektrofotometer, membuat kurva standard an menghitung konsentrasi sampel. Percobaan berhasil dilakukan. Daftar Pustaka Basset, J. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. EGC. Jakarta. Beran, J.A. 1996. Chemistry in The Laboratory. John Willey & Sons. Cahyanto. 2008. Tinjauan Spektrofotometer. Xains Info. [terhubung berkala]. http://xains-info.blogspot.com/ 2008/ 08/ tinjauan-spektrofototmeter. html [24 Maret 2011]. Khopkar S. 2007. Konsep Dasar kimia Analitik. Jakarta : UI Press. Miller, J.N and Miller, J.C. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed, Prentice Hall : Harlow. P, Tipler. 1991. Fisika untuk Sains dan Teknik Jilid . Bandung: Erlangga. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar Underwood, A. L. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Erlangga. Jakarta.