IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I. Tujuan Percobaan :
Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang
telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui.
II. Dasar Teori :
Spesies berasal dari bahasa Latin species
yang merupakan tingkatan dalam taksonomi
yang terkecil, biasanya digunakan untuk
mengklasifikasi organisme baik yang hidup
maupun organisme yang fosil.
Dalam biologi, species adalah salah satu
bentuk pengelompokan dalam klasifikasi
makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama
binomial, nama suatu spesies makhluk
hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya
(diawali dengan huruf kapital dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari
gambar di samping,Panthera pardus, !ama Panthera merupakan nama genus
atau marga sedangkan pardus merupakan nama species.
"erikut penjelasan singkat mengenai # spesies sampel yang kelompok kami
temukan. $etiga spesies sampel kami antara lain adalah %. coli, Staphylococcus
epidermis dan &roteus mirabilis.
'. %.coli
Escherichia coli, atau biasa disingkat E.
coli, adalah salah satu jenis spesies utama
bakteri gram negatif. &ada umumnya,
bakteri yang ditemukan oleh (heodor
%scherich ini hidup pada tinja, dan dapat
menyebabkan masalah kesehatan pada
manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli
banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. "iasa digunakan sebagai
)ektor untuk menyisipkan gen*gen tertentu yang diinginkan untuk
dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah
dalam penanganannya.
+. Staphylococcus epidermis
Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non*motil, jenis coccus gram*
positi)e cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak
memiliki en,im koagulase. "akteri ini merupakan bakteri yang patogen dan
aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. -nfeksi dari bakter in berakibat
pembengkakan pada daerah yang terinfeksi.
#.&roteus mirabilis
Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negati)e dan bakteri fakultatif
anaerob. "akteri ini memiliki kemampuan motalitas dan akti)itas urease.
P.mirabilis menyebabkan ./0 infeksi yang disebabkan oleh jenis 1&roteus2.
P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi.
"akteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk ,ona
bening pada media. &.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang
diketahui sebagai penyebab pergerakan. "akteri ini pada umumnya ditemukan
pada intestinal manusia. &.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam.
3ji 4 uji biokimia pada &.mirabilis adalah sebagai berikut :
5-ndole negati)e dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi
5Metyl red positif dan 6oges*&roskauer negatif
57atalase positif and 7ytochrome 89idase negatif
3ntuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan
serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada.
"erikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam
mengidentifikasi spesies sampel :
1.Pearnaan Gra!
&ewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan
mikroorganisme berdasarkan susunan : struktur dinding sel mikroorganisme.
Metode pewarnaan gram membutuhkan ; jenis reagen yaitu : crystal gentian
)iolet (<ram -, iodine (<ram --, alkohol .=0 (<ram---, dan saphranin
(<ram -6. Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat
digolongkan menjadi + kelompok, yaitu : bakteri gram (> yang akan
berwarna biru*ungu dan bakteri gram (* yang berwarna merah.

"eberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies
sampel termasuk dalam gram (> atau gram (* adalah sebagai berikut:
&emberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik gram
negatif maupun positif
-odin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin membentuk
komplek dengan kristal fiolet. &embentukan kompleks mengakibatkan sel
berwarna biru tua.
&emberian alkohol memiliki + fungsi:
4 &ada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi
sehingga ukuran porinya mengecil. -ni mengakibatkan kristal )iolet
tidak dapat keluar dari sitoplasma.
4 &ada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan
lubang kecil pada peptidoglikan. -ni mengakibakan kristal )iolet tercuci
keluar dan sel menjadi tidak berwarna.
Staphylcuococs (>
E. coli (*
Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan memberi warna
pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan terlihat berbeda
secara jelas di bawah mikroskop.
Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme
berdasarkan susunan : struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga
dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. "erikut gambar
tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :
".#ji $io%i!ia
"iokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan
reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. ?enis 4 jenis uji biokimia
untuk mengidentifikasi spesies antara lain :
a.Rea%si Li&!us Mi'%
Media yang digunakan : litmus broth
$omposisi Media : * Litmus (/,= gr
* Skim milk powder ('// gr
* Sodium sulfite (/,= gr
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
&enyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam
media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto*albumin
dan lactoglobulin.3ntuk melihat adanya perubahan metabolisme yang
diproduksi dalam medium, digunakan pB indicator yaitu o9idase*reduction
indicator litmus. -ndicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus
milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat
mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen en,imatik bakteri
tersebut. "eberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :
Cermentasi Laktosa
8rganisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk
produksi energi, dengan menggunakan induksi en,im *galactosidase.
Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:
Ddanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus
bewarna ungu pada pB netral dan berubah menjadi merah muda ketika
medium menjadi asam yaitu pada pB sekitar ;.
Ddanya gas
&roduk akhir pada fermentasi laktosa adalah 78+ > B+ . Ddanya gas
ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan 1curd2 atau pembelahan
dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.
Eeduksi Litmus
Cermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang
terjadi karena tidak ada molekul oksigen. 8ksidasi ini mungkin akan
terlihat sebagai perpindahan hydrogen (dehydrogenation dari
substrat.$arena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebasFmelayang*
layang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion
hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi*oksidasi
tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. &ada tes
litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam kondisi
oksidasi, litmus berwarna unguG ketika litmus menerima hydrogen dari
substrat, litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih atau warna
putih susu. 8ksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat, asam butirat,
gas 78+ dan gas B+.
<as hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor, yang
menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa
tereduksi.
(erbentuknya 7urd
Dkti)itas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan
pada litmus milk menghasilkan produksi + tipe curd (clots yang
berbeda. 7urd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia
yang membentuk curd tersebut Dda + jenis curd yang mungkin terbentuk
yaitu :
*Dcid curd
Dsam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk
protein casein sebagai ca'ciu! caseina&e menjadi bentuk gumpalan
yang tidak larut.
*Eennet curd
"eberapa organisme menghasilkan rennin, en,im yang berperan
mengubah casein menjadi bentuk paracasein( selain itu adanya calcium
ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan
yang tidak larut. (idak seperti acid curd, curd jenis ini berupa gumpalan
semisolid yang lembut. <umpalan ini akan mengalir perlahan saat
tabung dimiringkan.
&roteolysis (&eptoni,ation
$etidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi
melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme
tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein
untuk menghasilkan energi. Dengan menggunakan en,im proteolitik,
Lactose <lucose &yru)ic acid
*Lactic acid
*"utyric acid
*78
+
> h
+
organisme menghidrolisis milk protein, terutama casein, menjadi bentuk
dasarnya yaitu asam amino. &roses pencernaan protein disertai dengan
perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium
dengan alkaline pB. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang
berada di atasF permukaan dari tabung. reaksi sedangkan bagian
bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan
Eeaksi Dlkaline
Eeaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah
atau berubah menjadi biru. Eeaksi ini mengindikasikan partial
degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek,
dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan
perubahan warna.
"eberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk :
$eterangan gambar :D. DcidFEeductionF7urd
". EeductionF7urd (arrow denotes gas pocket
7. 3ninoculated 7ontrol
D. Dcid Cormation
%. &roteolysis of casein
C. Dlkaline Eeaction
b.Fer!en&asi Karbo)i*ra&
Media yang digunakan : phenol red lactose, fructose, glucose,
mannitol broth
$omposisi Media : * 7asein peptone ('/ gr
*LactoseFfructoseFglucoseFmannitol (= gr
* Sodium chloride (= gr
* &henol red (/,/'@ gr
Lama inkubasi : +; * ;@ jam pada #A
/
7
$ebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi
en,imatis tertentu dan terintegrasi,yang mengarah pada biooksidasi substrat,
seringkali karbohidrat. 8rganisme menggunakan karbohidrat secara
berbeda, tergantung pada komplemen en,imnya. "eberapa organisme
mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob, sedangkan
yang lain dengan aerob. Dnaerob fakultatif mampu melakukan keduanya
sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa
secara anareob maupun aerob.
&ada fermentasi, substrat*substrat seperti karbohidrat dan alkohol
mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik
(sebagi contoh : laktat, format, atau asam asetat yang disertai adanya gas
seperti hydrogen atau karbondioksida. Cermentasi digambarkan dengan baik
lewat degradasi glukosa melalui jalur %mbden*Meyerhof, yang dikenal
dengan jalur glikolisis. Satu mol glukosa dikon)ersi menjadi dua mol asam
piru)at, yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan
dari degradasi glukosa. Basil metabolisme asam piru)at lebih lanjut tidak
sama untuk semua organisme, dan )ariasi produk akhir menunjukkan
kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Degradasi fermentasi secara
anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung
Durham, yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. Medium
fermentasi karbohidrat mengandung :
*!utrient broth untuk pertumbuhan semua organisme
*$arbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi
kemampuan fermentasi organisme*organisme.
*pB indicator phenol red, yang merah pada pB netral (A dan menjadi
kuning bila sedikit asam (pB H,@.
-nkubasi dilakukan dalam waktu ;@ jam. -nkubasi yang berlebih dapat
menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan
kegiatan en,imatik pada substrat, selain karbohidrat.
Setelah inkubasi, karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil
sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning, yang
mengindikasikan reaksi positif. &ada beberapa kasus, produksi asam disertai
produksi gas (78+ yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham.
$ultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan
merubah warna indicator, dan tabung tetap warna merah, serta tidak ada gas
pada tabung Durham. -ni merupakan reaksi negatif.
$ekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat
diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. 8rganisme menggunakan nutrien
lain dalam medium sebagai sumber energi. Di antara nutrien tersebut adalah
pepton yang ada pada nutrient broth. &epton dapat didegradasi oleh en,im
mikrobial menjadi asam amino yang secara en,imatis dikon)ersi menjadi
asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. Dsam ketoamino tersebut lalu
dimetabolisme lewat siklus $rebs untuk menghasilkan energi. Eeaksi
tersebut membebaskan ammonia hidroksida (!B;8B dan menghasilkan
lingkungan alkalin, yang menimbulkan warna merah tua.
c.Pro*u%si +"S
Media yang digunakan : S-M agar deep tubes
$omposisi Media : * "acteriological agar (#,= gr
* Cerric ammonium sulfate (/,+ gr
* 7asein peptone (+/ gr
* Meat peptone (H,' gr
* Sodium thiosulfate (/,+ gr
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
(erdapat dua jalur fermentasi utama yang mana beberapa
mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (B+S :
?alur - : gas B+S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi sulfur
organic yang ada di asam amino sistein, yang mana merupakan
komponen peptone yang terdapat pada medium. &epton tersebut
didegradasi oleh en,im microbial menjadi asam amino, meliputi sistein.
Dsam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase, kehilangan atom
sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk
membentuk B+S.
?alur -- : gas B+S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur anorganik
seperti thiosulfat (S+8#
+*
, sulfat (S8;
+*
, atau sulfit (S8#
+*
. Medium yang
mengandung sodium thiosulfat, dengan mikroorganisme tertentu dapat
direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan B+S. Dtom sulfur
bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa anorganik
seperti ditunjukkan sebagai berikut :
&ada percobaan digunakan S-M medium yang mengandung peptone dan
sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur, ferro sulfat (CeS8; sebagai
indicator B+S, dan Dgar untuk membuat medium menjadi semisolid dan
mendorong respirasi anaerob. Cerrous ammonium sulfat gas, membentuk
endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di
sepanjang tusukan inokulasi, yang mengindikasikan terbentuknya B+S.
$etiadaaan endapan menunjukkan reaksi negati)e. S-M agar juga dapat
digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. Motilitas disadari saat
pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis
inokulasi. &ertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi
ditunjukkan sebagai berikut :
*.Re*u%si Ni&ra&
Media yang digunakan :!utrient Dgar
$ompisisi Media : * &eptone from casein ('/ gr
* Meat e9tract (# gr
* Dgar ('+ gr
Eeagen yang diperlukan :Solution D (asam sulfanilat,Solution " (I*
naphthylamine dan bubuk Jn.
Lama inkubasi :+; 4 ;@ jam pada #A
/
7
Eeduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif
anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.
&ada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu
sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (!8#
*
atau sulfat (S8;
+*

untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam
pembentukan energi. &erubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi
di bawah ini:
"eberapa organisme mempunyai kapasitas en,imatik untuk mengurangi
jumlah nitrit menjadi ammonia (!B#
>
atau molekul nitrogen (!+.
Eeduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkulti)asi organisme dalam
medium nitrat broth. &ada dasarnya,medium mengandung nutrient broth
bersupplemen /,'0 kalium nitrat ($!8# sebagai substrat nitrat. Dapat
ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan
/,'0 agar. $ondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen
ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan
reduksi nitrat
Setelah kultur diinkubasi, kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat
atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan + reagen: Larutan D yaitu
asam sulfanilat, diikuti dengan pemberian Larutan " yaitu I*naphthylamine.
Ddanya proses reduksi dengan penambahan Larutan D dan " akan
menghasilkan warna cherry red.
!8
#
*
> +B
>
> +e
*
!8
+
*
> B
+
8
Ni&ra&
Re*u%&ase
Ni&ra&
+,*ro-en
e'ec&ron
Ni&ri& Air
!8
+
*
!B
#
>
Ni&ri& A!!onia
+!8
#
*
> '+B
>
> '/e
*
!
+
> HB
+
8
Ni&ra& Gas Ni&ro-en
!8
#
*
!8
+
*

Ni&ra&
Re*u%&ase
$ultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di
atas memiliki + kemungkinan :
5!itrat tidak direduksi oleh organisme, atau
58rganisme mempunyai semacam potensi en,im nitrate reductase yaitu
nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan
menjadi molekul nitrogen.
3ntuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui
terbetuknya nitrite,bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah
diberi Larutan D dan ". "esi mereduksi nitrat menjadi nitrit. "ila ada
perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi
menjadi nitrit oleh organisme. ?ika nitrat tidak direduksi, reaksi reduksi
nitrat dikatakan negatif. "ila setelah penambahan besi tidak ada perubahan
warna, mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia
dan gas nitrogen. -ni adalah reaksi yang positif.
e.Pro*u%si In*o'
Media yang digunakan : S-M agar deep tubes
$ompisisi Media : * "acteriological agar (#,= gr
* Cerric ammonium sulfate (/,+ gr
* 7asein peptone (+/ gr
* Meat peptone (H,' gr
* Sodium thiosulfate (/,+ gr
Eeagen yang diperlukan : $o)ac2s reagent
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
(riptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi
melalui beberapa aktifitas en,imatik bakteri. $onfersi triptofan menjadi
produk metabolit dilakukan oleh en,im triptofanase. Eeaksinya sebagai
berikut :
$emampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik
mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda
biokimia.
Dalam uji ini digunakan agar S-M (Sulphite Indole Motility yang
mengandung substrat trytophan. $eberadaan indol dideteksi dengan
menambahkan reagen $o)ac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di
atas agar deep menjadi berwarna merah ceri. -ndol diekstrak dari medium
ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan
asam klorida (B7l dan membentuk kompleks dengan p*
dimetilaminoben,aldehid yang menghasilkan warna merah ceri. $ultur yang
menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah
dengan reagen $o)ac mengindikasikan indol positif. $etidakhadiran warna
merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis
dan mengindikasikan reaksi indol negati)e.
..Tes !e&i' !era) /MR0
Media yang digunakan : ME*6& broth
$omposisi media : * &eptone mi9ture (A gr
* &otassium phosphate (= gr
* De9trose (= gr
Eeagen yang diperlukan : Metyl red indicator
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
<lukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh
organisme enteric untuk produksi energi. &roduk akhir dari reaksi ini dapat
ber)ariasi tergantung reaksi en,imatik spesifik yang ada dalam bakteri. &ada
uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang
besar pada hasil akhir dengan media ME6& Dgar. Meskipun semua
mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam
organik, uji ini berguna dalam pemisahan %.coli dan %.aerogenes.
$edua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama
masa inkubasi awal. Derajat keasaman yang rendah (pB K ; distabilisasi
dan diatur oleh %.coli pada akhir masa inkubasi. Selama inkubasi
selanjutnya, %.aerogenes secara en,imatik mengubah asam ini ke hasil akhir
yang tidak asam seperti +,#*butanadiol dan acetoin (asetilmetil*karbinol
yang menghasilkan pB sekitar H. Eeaksinya sebagi berikut:
<lukosa > B+8 > 78+ > B+ (pB ;./
-ndikator metal red pada pB sekitar ; akan berwarna merah yang
mengindikasikan bahwa hasil uji positif. &ada pB sekitar H masih tetap
mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang
lebih rendah. -ndikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan
hasil uji yang negatif. &roduksi dan deteksi produk akhir non asam dari
fermentasi glukosa %. areogenes diperkuat dengan uji 6oges*&roskauer.
-.Tes 1o-es2Pros%auer
Media yang digunakan : ME*6& broth
$omposisi media : * &eptone mi9ture (A gr
* &otassium phosphate (= gr
3ji > ditunjukkan dengan warna
media yang menjadi merah.
Dsam laktat
Dsam Dsetat
Dsam format
* De9trose (= gr
Eeagen yang diperlukan : "arritt2s reagent D dan "
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
3ji 6oges*&roskauer menentukan kemampuan beberapa organisme untuk
memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil *karbinol
yang berasal dari metabolisme glukosa. Eeagen yang digunakan dalam uji
ini adalah reagen "arrit yang mengandung campuran I*naphthol alkoholik
dan larutan ;/0 potassium hydro9ide ($8B. Deteksi acetylmethylcarbinol
membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil.
Eeaksi ini terjadi pada keberadaan katalis I*naphthol dan grup guanidine
yang ada pada peptone pada medium ME6&. Sebagai hasil, kompleks pink
terbentuk, sebagai warna mawar pada medium. $eberadaan warna mawar
tua pada kultur setelah penambahan reagen "arritt mengindikasikan
keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif, dan bila tidak
ada berarti hasilnya negatif.
).Pen--unaan Si&ra&
Media yang digunakan : Simmons citrate agar slant
$omposisi media : * ammonium dihydrogen phosphate (' gr
* dipotassium hydrogen phospate (' gr
* sodium chloride (= gr
* sodium citrate (+ gr
* magnesium sulfate (/,+ gr
$ompleks
berwarna
&ink
7B
#
7
7B
7B
#
8
8B
>
345 KO+
8ksidasi
8B
7B
#
7
7
7B
#
8
8
>
7
!B
!B
+
!B*E
Ase&i'!e&i'%arbino' 2na.&o' Diase&i' Guani*in
Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit
$ompleks
berwarna
&ink
7B
#
7
7B
7B
#
8
8B
>
345 KO+
8ksidasi
8B
7B
#
7
7
7B
#
8
8
>
7
!B
!B
+
!B*E
Ase&i'!e&i'%arbino' 2na.&o' Diase&i' Guani*in
Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit
* bromthymol blue (/,/@ gr
* bacterological agar ('= gr
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
&ada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi, beberapa
mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi
energi mereka. $emampuan ini tergantung pada keberadaan en,im sitrat
permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. Sitrat merupakan
senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi
asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Sitrat, dengan keberadaan en,im
sitrase, menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. &roduk tersebut
kemudian secara en,imatis diubah menjadi asam piru)at dan
karbondioksida. Selama reaksi, medium menjadi alkalin*karbondioksida
yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium
carbonate, sebuah produk alkalin. $ehadiran sodium carbonate mengubah
indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua &russia.
Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti
warna biru, sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap
berwarna hijau.
788B
7B
+
788B
B8 7 788B
7B
+
6
i&ra&e
6i&ras
e
Ace&ic aci*
P,ru7ic
aci*
E8cess
carbon
*io8i*e
>
O8a'oase&i
c aci*
788B
788B
788B
7 8
7B
+
788B
7B
#
788B
788B
7 8
7B
#
>
78
+
1.
78
+
> +!a
>
> B
+
8 !a
+
78
#
Dlkaline pB perubahan warna dari )ijau
ke menjadi biru
".
i.A%&i.i&as urease
Media yang digunakan : 3rea broth
$omposisi media : * dipotassium phosphate (.,= gr
* phenol red (/,' gr
* monopotassium phosphate (.,' gr
* urea (+/ gr
* yeast e9tract (/,' gr
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
3rease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan en,im
yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris. Lalaupun
organisme lain mungkin menghasilkan urease, peran mereka pada substrat
lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies &roteus. 8leh karena itu, tes
ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari
mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.
3rease adalah en,im hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon
pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk
akhirnya adalah ammonia .
Ddanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea
broth medium yang mengandung pB indicator phenol red. $etika substrat
urea dipisahkan dari produknya,adanya ammonia membuat lingkungan
alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Bal ini
menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. $egagalan perubahan
warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.
j.A%&i7i&as %a&a'ase
Media yang digunakan :!utrient Dgar
$ompisisi Media : * &eptone from casein ('/ gr
* Meat e9tract (# gr
* Dgar ('+ gr
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
Selama respirasi aerobik, mikroorganisme memproduksi hydrogen
peroksida dan dalam beberapa kasus, secara ekstrem menghasilkan to9ic
supero9ide. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang
mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara en,imatik. Substansi ini
diproduksi ketika bakteri aerob, facultati)e anaerob, dan mikroaerophile
menggunakan jalur respirasi aerobic,di mana oksigen merupakan akseptor
electron terakhir, selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi
energi. 8rganisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat
mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut :
+B+8+ +B+8 > 8+ (g
8rganisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi to9ic
supero9ide secara khusus menggunakan en,im supero9ide dismutaseG hasil
akhir dari supero9ide dismutase adalah B+8+, tetapi B+8+ kurang berbahaya
bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida.
$etidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase, pero9idase,
atau supero9ide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi
beracun untuk mikroorganisme. "ila en,im 4 en,im di atas tidak ada maka
menyebabkan konsentrasi ,at toksik dari B+8+ tidak dapat didegradasi ketika
organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen.
&roduksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat B+8+
pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. ?ika ada katalase,
seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh
gelembung dari gas oksigen yang 1terbebas2. Bal ini menunjukkan tes
+i*ro-en
Pero%si*a
Air
O%si-en
bebas
katalase positifG sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes
katalase negati)e.
'.#ji $i'e Escu'in
Media yang digunakan : "ile esculin agar
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. <roup
D streptococcus menunjukkan I atau *hemolysis pada blood agar plates.
<roup ini meliputi en&erococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin
menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu, ada golongan
nonen&erococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia
menggunakan laser. %nterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten
dan yang lebih jarang sebagai )ancomycin.
$i'e escu'in &es& : Dengan adanya bile, <roup D streptococci menghidrolisis
glycoside esculin menjadi H,A*dihydro9y*coumarin yang bereaksi dengan iron
salt yang terkandung dalam medium. Bal ini menyebabkan timbulnya warna
cokelat 4 hitam pada medium setelah diinkubasi. "ila tidak terdapat warna
hitam tidak mengidentifikasi organisme <roup D streptococci.
!.#ji 9.:5 so*iu! c)'ori*e bro&)
Media yang digunakan : H,=0 !a7l "roth
$omposisi media : brain 4 heart infusion broth
!a7l H,=0
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. <roup
D streptococcus menunjukkan I atau *hemolysis pada blood agar plates.
<roup ini meliputi en&erococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin
menjadi penyebab infeksi pada urine. Selain itu, ada golongan
nonen&erococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia
menggunakan laser. %nterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten
dan yang lebih jarang sebagai )ancomycin.
9.:5 so*iu! c)'ori*e bro&) : <roup D enterococci dapat diidentifikasi
dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan
non enterococci.
n.A%&i7i&as )e!o',&ic
Media yang digunakan : blood agar base
$omposisi media : * proteose peptone ('= gr
* li)er digest (+,= gr
* yeast e9tract (= gr
* !a7l (= gr
* Dgar ('+ gr
* Darah steril (=0
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
Dkti)itas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi
adanya streptococci. Dari hasil penelitian, ada # tipe reaksi hemolytic pada
blood agar yaitu:
* ( A'p)a2)e!o',sis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna.
Ditandai dengan adanya ,ona berwarna hijau di sekitar koloni. *hemolytic
streptococci, Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen.
Sedangkan yang lain, memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi
pada manusia seperti subacu&e en*ocar*i&is dan gagal jantung.
* ( $e&a2)e!o',sis merupakan penghancuran sel darah merah dengan
sempurna. Ditandai dengan terbentuknya ,ona bening sekitar + * ; kali
diameter koloni. Streptococcus mampu memproduksi *hemolysins dan
bersimbiosis dengan bakteri patogen.
* ( Ga!!a2)e!o',sis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di
sekitar koloni. Sebagian besar, *hemolytic streptococci bersifat avirulent.
o. #ji $i'e So'ubi'i&,
Media yang digunakan : "ile solubility
Eeagen yang digunakan : !a*deoksikolat
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
Ddanya surface-active agents seperti bi'e dan bi'e sa'&s (sodium
deso9ycholate atau sodium dodecyl sulfate, menyebabkan dinding sel
pneumococcus mengalami lisis. Selain *hemolytic streptococci tidak akan
mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Setelah
diinkubasi, biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang
tidak larut dalam bile akan tampak keruh.
p. #ji Pi-!en
Media yang digunakan : !utrient Dgar
$ompisisi Media : * &eptone from casein ('/ gr
* Meat e9tract (# gr
* Dgar ('+ gr
Lama inkubasi : +; 4 ;@ jam pada #A
/
7
&ada uji pigmen ini,apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna
selain warna koloni, maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif.
Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji
pigment positif.
Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji 4 uji biokimia, ada juga yang
membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. "erikut
adalah penjelasan tentang pewarnaan spora.
Pearnaan spora
&eralatan yang diperlukan : "unsen, hotplate, staining tray, inoculating
loop, glass slides, bibulous paper, lens paper dan
mikroskop
Eeagen yang dibutuhkan : Malachite green dan safranin
Lama inkubasi untuk biakan : ;@ * A+ jam pada media agar slant
%ndospora merupakan
struktur yang bersifat resisten,
dorman, dan berfungsi untuk
melindungi bakteri dari
lingkungan yang tidak
menguntungkan. Struktur ini
tidak dapat diwarnai dengan
metode pewarnan sederhana
maupun gram. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer*Culton
endospore stain. Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna
primer (primer stain dan safranin sebagai caounterstain.<ambar tentang
berbagai bentuk spora sebagai berikut :
&edoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies
suatu sampel adalah pohon filogenik. Bal ini disebabkan masing* masing
A: oval, terminal
B: rectangular, terminal
C: rectangular, subterminal
D: rectangular, central
E: circular, terminal
F: circular, central
G: infated spore
spesies memiliki jalur yang berbeda dalam proses
pengidentifikasiannya."erikut skema pohon filogenik :
&enjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut :
Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dan morfologi bakteri, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :
'a."akteri <ram positif dan bentuk morfologinya cocci
"eberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus
spp, Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. 3ntuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji
katalase.
'b."akteri <ram positif dan bentuk morfologinya "acilli
"eberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah
Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp.3ntuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan pewarnaan spora.
'c."akteri <ram negatif dan bentuk morfologinya cocci
"eberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella
spp, Moraella spp, dan !eisseria spp.3ntuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa.
'd."akteri <ram negatif dan bentuk morfologinya "acilli
"eberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter
spp, Enterobacter spp., Escherichia spp., "lebsiella spp., Proteus spp., dan
Pseudomonas spp.3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel
kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa.
$a%&eri Gra! posi&i. *an ben&u% !or.o'o-in,a cocci
#ji Ka&a'ase
+a. "ila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Staphylococcus spp. 3ntuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji
mannitol.
+b. "ila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Streptococcus spp.. 3ntuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji bile esculin.
#ji Manni&&o'
#a. "ila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Staphylococcus aureus.
#b. "ila uji Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus, S.epidermis, M.luteus,
M.)arians. 3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan 3ji &igment.
#ji $i'e Escu'in
#c. "ila uji "ile %sculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah %. Caecalis dan S.bo)is. 3ntuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji pada H.=0 !a7l
"roth.
#d. "ila uji "ile %sculin menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah S.pneumoniae, S.mitis dan S.pyogenes. 3ntuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji
Bemolysis.
#ji Pi-!en&
;a. "ila uji &igment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah M.luteus dan M. )arians. 3ntuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji Cermentasi <lukosa.
;b. "ila uji &igment menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah S. Saprophyticus dan S.epidermis. 3ntuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji Cermentasi
Cruktosa.
#ji pa*a 9.:5 Na6' $ro&)
;c. "ila uji pada H.=0 !a7l "roth menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah %. Caecalis.
;d. "ila uji pada H.=0 !a7l "roth menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S.bo)is.
#ji +e!o',sis
;e. "ila uji Bemolysis menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.pneumoniae dan S.mitis.
3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
3ji "ile Solubility.
;f. "ila uji Bemolysis menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah S.pyogenes.
#ji Fer!en&asi G'u%osa
=a. "ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah M. )arians.
=b."ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah M. luteus.
#ji Fer!en&asi Fru%&osa
=c. "ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S. epidermis.
=d."ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S. saprophyticus.
#ji $i'e So'ubi'i&,
=e. "ila uji "ile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae.
=b."ila uji "ile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S. mitis.
$a%&eri Gra! posi&i. *an ben&u% !or.o'o-in,a $aci''i
+a "ila terdapat spora dalam sampel, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Bacillus spp.. 3ntuk mengetahui lebih detail tentang
spesies sampel kita, maka dilakukan uji mannitol.
+b. "ila tidak ditemukan adanya spora, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp. 3ntuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji
katalase.
#ji !anni&o'
#a. "ila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah ". Megaterium dan ".subtilis. 3ntuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji 6oges*&roskauer.
#b. "ila uji mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah ". cercus.
#ji %a&a'ase
#c. "ila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah 7orynebacterium spp. 3ntuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji Eeduksi !itrat.
#d. "ila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. 3ntuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji Cermentasi <lukosa.
. #ji 1o-es2Pros%auer
;a. "ila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah ".subtilis.
;b. "ila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah ". Megaterium.
#ji Re*u%si Ni&ra&
;c. "ila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah 7. 9erosis.
;d. "ila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah 7. $utscheri.
#ji Fer!en&asi G'u%osa
;e. "ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas,
maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L.fermentum.
;f. "ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam,
maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei dan L.
delbrueckii 3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan 3ji Cermentasi Mannitol.
#ji Fer!en&asi Manni&o'.
=a. "ila uji Cermentasi Mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei
=b. "ila uji Cermentasi Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah L. delbrueckii.
$a%&eri Gra! ne-a&i. *an ben&u% !or.o'o-in,a cocci
#ji Fer!en&asi G'u%osa
+a. "ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah !eisseria spp .3ntuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji Eeduksi !itrat .
+b. "ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraella
spp.3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan 3ji Eeduksi !itrat.
#ji Re*u%si Ni&ra&
#a. "ila uji Eeduksi !itrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah !. mucosa .
#b. "ila uji Eeduksi !itrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah !.sicca .
#c. "ila uji Eeduksi !itrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah ".catarrhalis
#d. "ila uji Eeduksi !itrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah M. bo)is
$a%&eri Gra! ne-a&i. *an ben&u% !or.o'o-in,a $aci''i
#ji Fer!ena&asi La%&osa
+a. "ila uji Cermentasi Laktosa menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp, Enterobacter spp.,
Escherichia spp. dan "lebsiella spp.3ntuk mengetahui lebih detail tentang
spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji &roduksi -ndole .
+b. "ila uji Cermentasi Laktosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp., dan Pseudomonas
spp.3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan 3ji Cermentasi <lukosa
#ji Pro*u%si In*o'e
#a. "ila uji produksi indol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius dan E. coli.3ntuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji &enggunaan
7itrate .
#b."ila uji produksi indol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. freundii, Enterobacter spp., Escherichia
spp. dan "lebsiella spp.3ntuk mengetahui lebih detail tentang spesies
sampel kita, maka dilakukan 3ji Metyl Eed .
#ji Fer!en&asi G'u%osa
#c."ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.3ntuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji &roduksi -ndole.
#d."ila uji Cermentasi <lukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp.3ntuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji Eeduksi
!itrate.
#ji Pen--unaan 6i&ra&e
;a. "ila uji &enggunaan 7itrate menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius
;b. "ila uji &enggunaan 7itrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah E. coli.
#ji Me&,' Re*
;c. "ila uji Metyl Eed menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah C. freundii dan ".o#aenae..3ntuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji &roduksi B+S.
( -
;d. "ila uji Metyl Eed menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah %. Derogenes dan $. &neumoniae.3ntuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji
akti)itas urease. ( -
#ji Pro*u%si In*o'e
;e. "ila uji &roduksi -ndole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. )ulgaris dan &.rettgeri.3ntuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji &roduksi B+S.
( --
;f. "ila uji &roduksi -ndole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis dan &. inconstans.3ntuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji
akti)itas urease . ( --
#ji Re*u%si Ni&ra&e
;g."ila uji Eeduksi !itrate menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah &.aeruginosa dan &.fluorescens.3ntuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan 3ji
Litmus Milk.
;h."ila uji Eeduksi !itrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P.mallei.
#ji Pro*u%si +"S/ I 0
=a. "ila uji &roduksi B+S menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah C. freundii
=b. "ila uji &roduksi B+S menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah ".o#aenae..
#ji a%&i7i&as urease/ I 0
=c. "ila uji akti)itas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah $. &neumoniae.
=d. "ila uji akti)itas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah %. Derogenes.
#ji Pro*u%si +"S/ II 0
=e. "ila uji &roduksi -ndole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. )ulgaris.
=f. "ila uji &roduksi -ndole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah &.rettgeri.
#ji a%&i7i&as urease/ II 0
=g. "ila uji akti)itas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis.
=h. "ila uji akti)itas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah &. inconstans.
#ji Li&!us Mi'%
=i."ila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah &.aeruginosa yang mengalami peptoni,ation
=j."ila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah &.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.
III. A'a& *an $a)an :
1.A'a& :
2 (abung
* 7awan petri
* 8bjek glass
* ?arum ose
* %rlemeyer
* "eker glass
* &ipet
* Botplate stirrer
* Lampu spiritus
".$a)an :
* Sampel bakteri (Sampel ', +, # * &henol Eed Lactose "roth
* 7rystal )iolet (<ram - * &henol Eed De9trose "roth
* Safranin (<ram -6 * &henol Eed Sucrose "roth
* %tanol .=0 (<ram --- * Medium S-M Dgar
* <ram2s iodine (<ram -- * ME6& "roth
* "arrit D dan "arrit " * Simmon2s 7itrate Dgar
* Eeagen ko)ac2s * 3rea "roth
* B+8+ #0 * Starch Dgar
* Medium (SD * !utrien <elatin "roth
* Medium Litmus Milk * !itrate "roth
I1. 6ara Kerja :
1.Pearnaan Gra!:
a.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa tetes
larutan karbolgentian )iolet (<ram -, membiarkan selama # menit. Membilas
dengan air.
b.Menetesi preparat dengan larutan lugol (<ram -- beberapa tetes.
Membiarkan selama ' menit.
c. Membilas dengan air.
d. Mencuci dengan larutan <ram --- (alkohol .H0 dengan cara
memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan* lahan dengan <ram
--- hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.
e. Membilas preparat secara hati*hati dnegan air
f. Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (<ram -6 beberapa tetes.
Mendiamkan selama # menit.
g. Membilas preparat dengan air. $emudian mengeringkan di udara atau
dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue.
h. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.
". Pe!bua&an Me*ia un&u% S&oc% 6u'&ure/Pere!ajaan0
TSA s'an& /34 -r;L0
*Menimbang (SD kemudian melarutkannya ke dalam aMuades
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e.
*Memiringkan tabung agar terbentuk media slant
<.Pe!bua&an Me*ia un&u% #ji $io%i!ia
a.Li&!us Mi'% /144 -r;L0
7ara pembuatan media :
*Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e.
Langkah inokulasi ke media :
'.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk "roth
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut.
#.Menginkubasi selama +; 4 ;@ jam pada suhu #A
/
7.
b.P)eno' Re* Lac&ose $ro&) /"4 -r;L0
*Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam
aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e.
c.P)eno' Re* Fruc&ose $ro&) /"4 -r;L0
*Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam
aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e.
*.P)eno' Re* G'ucose $ro&) /"4 -r;L0
*Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam
aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e
e.P)eno' Re* Manni&o' $ro&) /"4 -r;L0
*Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam
aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e
Langkah inokulasi ke media fermentasi :
'.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam
karbohidrat : phenol red lactose broth, phenol red sucrose broth, dan phenol
red de9trose broth.
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media 4 media pada bagian '.
#.Menginkubasi selama +; * ;@ jam pada suhu #A
/
7.
e.SIM A-ar Deep Tube /<4 -r;L0
*Menimbang S-M medium kemudian melarutkannya ke dalam aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e.
Langkah inokulasi pada media :
'.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi S-M agar deep tubes
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media S-M dengan menusukkan ke dalam agar.
#.Menginkubasi selama +; 4 ;@ jam pada suhu #A
/
7.
;.3ntuk tes produksi -ndol ditambahkan reagen $o)ac #*= tetes pada medium
yang telah diinkubasi.
..Si!!on 6i&ra&e A-ar S'an& /""(: -r;L0
*Menimbang S7D kemudian melarutkannya ke dalam aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung kemudian
diautocla)e.
*Memiringkan tabung agar terbentuk media slant
Langkah inokulasi pada media :
'.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut dengan cara menggores ,ig*,ag pada bagian yang miring.
#.Menginkubasi selama +; 4 ;@ jam pada suhu #A
/
7
-.#rea $ro&) /<=(: -r;L0
*Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
*Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya
*Memasukkan campuran ke dalam masing*masing tabung
Langkah inokulasi pada media :
'.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi 3rea "roth
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut.
#.Menginkubasi selama +; 4 ;@ jam pada suhu #A
/
7
).Tr,p&,case So, A-ar /TSA0 P'a&e /34 -r;L0
*Menimbang medium (SD kemudian melarutkannya ke dalam aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautocla)e
*Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya
memadat.
Langkah inokulasi pada medium :
'.Menyiapkan plate berisi (SD
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media
tersebut dengan men*strict medium
#.Menginkubasi selama +;*;@ jam pada suhu #A
/
7
i.Nu&rien& A-ar
*Menimbang !utrient Dgar kemudian melarutkannya ke dalam aMuadest
*Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautocla)e
*Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya
memadat.
Langkah inokulasi pada medium :
'.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi !utrient Dgar slant
+.Mengambil ' ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut dengan cara menggores ,ig*,ag pada bagian yang miring.
#.Menginkubasi selama +; 4 ;@ jam pada suhu #A
/
7
;.3ntuk membuktikan adanya akti)itas katalase ditambahkan reagen B+8+ #0
pada medium yang tlah diinkubasi.
1. +asi' Percobaan :
'.&ewarnaan gram
'a.&ewarnaan gram %.coli
'b.&ewarnaan gram Staphylococcus epidermis
'c.&ewarnaan gram Proteus mirabilis
+.3ji
"iokimia
+.3ji "iokimia
+a.3ji "iokimia %.coli
*3ji Laktosa
*3ji -ndol
*3ji 7itrat
b.3ji "iokimia Staphylococcus epidermis
*3ji $atalase
*3ji Mannitol
*3ji &igment
*3ji Cruktosa
c.3ji "iokimia &roteus mirabilis
*3ji Laktosa
*3ji <lukosa
*3ji -ndole
*3ji 3rea
#. (abel Basil &ercobaan
#a. (abel Basil &ercobaan %.coli
Maca! #ji +asi' #ji
&ewarnaan <ram negati)e
Morfologi coccobacill
Cermentasi Laktosa >
&roduksi -ndol (S-M medium >
&enggunaan sitrat *
#b. (abel Basil &ercobaan Staphylococcus epidermis
Maca! #ji +asi' #ji
&ewarnaan <ram positif
Morfologi coccus
Dkti)itas katalase >
Cermentasi mannnitol *
&igment *
Cermentasi Cruktosa >
#c. (abel Basil &ercobaan &roteus mirabilis
Maca! #ji +asi' #ji
&ewarnaan <ram negati)e
Morfologi bacill
Cermentasi laktosa *
Cermentasi glukosa >
&roduksi -ndol (S-M medium *
Dkti)itas 3rease >
1I.Pe!ba)asan
1.Sa!pe' A
1a.Pearnaan Gra! > Mor.o'o-i
Basil uji morfologi pada sampel D menunjukkan bahwa bakteri pada
sampel D termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk
coccobacill. "akteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan
pewarnaan gram. Bal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri
ini lebih sedikit sehingga pewarna gram - yang ada pada dinding selnya akan
luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram
--- (alkohol sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang
merupakan pewarna tandingan. 8leh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan
morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel D merupakan bakteri gram
negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus
dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.
1b.#ji Fer!en&asi La%&osa
3ji Cermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa
broth.&ada uji ini, bakteri sampel D tidak dapat memfermentasi laktosa. Basil
uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah
menjadi kuning dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. 8leh
karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon
filogenik adalah uji &roduksi -ndol.
1c.#ji Pro*u%si In*o'
3ji &roduksi -ndol ini dilakukan pada medium S-M dengan bantuan
penambahan reagen $o)ac akan terlihat cincin pin$ pada medium. &ada uji ini,
bakteri sampel D menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah
penambahan reagen $o)ac. Bal ini berarti bakteri sampel D memiliki en,im
triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut :
.
8leh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan
pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat.
1*.#ji Pen--unaan 6i&ra&
3ji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmon2s 7itrate Dgar yang
mengandung sitrat sebagai satu 4 satunya sumber karbon. &ada uji ini, bakteri
sampel D menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya
warna medium dari hijau menjadi biru. Bal ini berarti bakteri sampel D tidak
memiliki en,im citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam
asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piru)at dan 78+ . 8leh
karena itu, dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa ba%&eri
sa!pe' A a*a'a) E.co'i.
".Sa!pe' $
"a.Pearnaan Gra! > Mor.o'o-i
Basil uji morfologi pada sampel " menunjukkan bahwa bakteri pada sampel
" termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus.
"akteri tersebut berwarna biru*ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.
Bal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal
sehingga pewarna gram - yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika
dicuci dengan gram --- (alkohol sehingga yang tersisa adalah warna biru*ungu
oleh reagen kristal*)iolet. 8leh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan
morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel " merupakan bakteri gram
positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus
dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji akti)itas katalase.
"b.#ji A%&i7i&as Ka&a'ase
3ji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium (SD dan
selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa B+8+ #0. "akteri sampel "
menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel " memiliki
en,im katalase. Basil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung 4
gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan B+8+ #0. Bal ini
berarti bakteri sampel " dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan
karbondioksida sesuai reaksi berikut
8leh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan
pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol.
"c.#ji Fer!en&asi Manni&o'
3ji Cermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol
broth.&ada uji ini, bakteri sampel " tidak dapat memfermentasi mannitol. Basil
uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah
menjadi kuning dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. 8leh
karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon
filogenik adalah uji pigment.
"*.#ji Pi-!en&
3ji &igment ini dilakukan pada medium nutrient agar.&ada uji ini, bakteri
sampel " tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih
mengkilap. Bal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif.8leh karena itu,
untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik
adalah uji fermentasi fruktosa
"e.#ji Fer!en&asi Fru%&osa
3ji Cermentasi Cruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa
broth. &ada uji ini, bakteri sampel " dapat memfermentasi fruktosa sehingga
hasilnya positif. Basil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan
berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya
produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas.8leh karena
itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa ba%&eri sa!pe' $
a*a'a) S&ap),'ococcus epi*er!is.
<.Sa!pe' 6
<a.Pearnaan Gra! > Mor.o'o-i
Basil uji morfologi pada sampel 7 menunjukkan bahwa bakteri pada sampel
7 termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill.
"akteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Bal
ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit
sehingga pewarna gram - yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama
dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram --- (alkohol
sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan
pewarna tandingan. 8leh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan morfologi
dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel 7 merupakan bakteri gram negatif dan
bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai
dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.
<b.#ji Fer!en&asi La%&osa
3ji Cermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth.
&ada uji ini, bakteri sampel 7 tidak dapat memfermentasi laktosa. Basil uji
negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah
menjadi kuning dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. 8leh
karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon
filogenik adalah uji fermentasi glukosa.
<c.#ji Fer!en&asi G'u%osa
3ji Cermentasi <lukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa
broth. &ada uji ini, bakteri sampel 7 dapat memfermentasi glukkosa sehingga
hasilnya positif. Basil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan
berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya
produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas. 8leh karena
itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik
adalah uji &roduksi -ndol.
<*.#ji Pro*u%si In*o'
3ji &roduksi -ndol ini dilakukan pada medium S-M dengan bantuan
penambahan reagen $o)ac akan terlihat cincin pin$ pada medium, bila hasilnya
positif. Dkan tetapi, pada bakteri sampel 7 tidak menunjukkan terbentuknya
cicncin pin$ setelah penambahan reagen $o)ac sehingga hasilnya negatif.Bal
ini berarti bakteri sampel D tidak memiliki en,im triptofanase untuk memecah
triptofan. 8leh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai
dengan pohon filogenik adalah uji akti)itas urease.
<e.#ji a%&i7i&as urease.
3ji akti)itas urease. ini dilakukan pada medium urea broth yang
mengandung pB indicator phenol red. &ada uji ini, bakteri sampel 7 berubah
warna menjad deep pin$ yang menandakan bahwa uji akti)itas urease
positif.Bal ini menandakan bahwa $etika substrat urea dipisahkan dari
produknya,adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan
phenol red berubah menjadi deep pink. Bal ini menunjukkan reaksi positif
terhadap adanya urease. $egagalan perubahan warna menjadi deep pink
membuktikan reaksi negatif. Eeaksinya sebagai berikut :
8leh karena itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa
bakteri sampel 7 adalah &roteus mirabilis.
1II. Kesi!pu'an :
Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji
biokimia. Selain itu, yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian
spesies adalah penggunaan pohon filogenik. Bal in disebabkan karena masing
4 masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan
gramFmorfologi atau metabolismenya. 8leh karena itu,sampel kami berurutan
dari adalah Escherichia coli% Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis.
1III. Da.&ar Pus&a%a
(ortora, <erard ?, "erdell E. Cunke, 7hristine L.7ase, Microbiology-&n
Introduction, "enjamin 7ummings, San Crancisco, +//'.
7appuccino, ?ames <, !atalie Sherman, NMicrobiology ' & Laboratory
ManualO, se)enth edition, "enjamin 7ummings, San Crancisco, +//=.
http:FFwww.siue.eduFPcbwilsoF+=/cho.htm
http:FFwww.slic+.wsu.edu:@+FhurlbertFmicro'/'FpagesF'/'lab..html