HPLC LENGKAP

HPLC ADALAH
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut
dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik
dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa,
alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau
perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter
pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun
dengan
meningkatnya
polaritas
pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase
gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan
analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai
kisaran
polaritas
yang
luas.4)
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran
air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak
yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum
dibanding
dengan
fase
terbalik.2)
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak
dengan
kecepatan
20
mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa
dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan
aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak
yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa
dengan
tekanan
konstan.6)
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam
fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan
alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

sampel

Posisi pada saat menyuntik

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk
berlangsungnya
proses
pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom

mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena
adanya
residu
gugus
silanol
(Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil
yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air

yang

digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
detektor
UV-Vis,
detektor
fluoresensi,
dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak.2)
7. Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan
karakteristik detektor seperti berikut :
Detektor
Sensitifi Kisar Karakteristik
tas
an
(g/ml)
linier
Absorbansi
Uv-vis
5 x 10-10 104
Sensitivitas bagus,
Fotometer
5 x 10-10 105
paling
sering
5
filter
> 2 x 10
digunakan, selektif
Spektrofotom 10-10
terhadap
guguseter
gugus dan strukturspektrometer
struktur yang tidak
photo-diode
jenuh.
array
Fluoresensi
10-12
104
Sensitifitas sangat
bagus,
selektif,
Tidak
peka
terhadap
perubahan
suhu
dan kecepatan alir
fase gerak.

Indeks bias

Elektrokimi
a
Konduktimetr
i
Amperometri

5 x 10-7

104

Hampir
bersifat
universal
akan
tetapi
sensitivitasnya
sedang.
Sangat
sensitif
terhadap
suhu,
dan
tidak
dapat
digunakan
pada
elusi
bergradien

10-8
10-12

104
105

Peka
terhadap
perubahan
suhu
dan kecepatan alir
fase gerak, tidak
dapat
digunakan
pada
elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi
solutsolut
ionik.
Sensitifitas sangat
bagus,
selektif
tetapi
timbul
masalah
dengan
adanya kontaminasi
elektroda.

JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik
(jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya).
Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
menjadi HPLC
fase
normal
dan HPLC
fase
terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut,
dengan
jenis-jenis
HPLC
sebagai
berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase
diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat
secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3)
2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi

secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang
paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan
pemisahannya
adalah
fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air
atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau
basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak
diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya
spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam
menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih
cepat.3)
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang
beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya
adalah
polistiren
resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi
penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar
garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk
gugus
penukar
ion
pada
resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada
metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan
yang
berlawanan.2)
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat
molekul
>
2000
dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat
porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh
lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang
ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi
lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan

fase

diam

seperti

tipe

kromatografi

yang

lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang
hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana
dalam
interaksi
antara
antigen
dan
antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim)
dari
campuran
yang
sangat
kompleks.2)
DERIVATISASI PADA HPLC
Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan
suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan
utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:
1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan
menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UVVis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau
menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada
panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu
metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu
berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.7)
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut,
yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar
ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa
berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses
derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin
(100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi
dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu
pemisahan
kromatografi.7)
Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :
Gugus
Reagen untuk dapat Reagen
untuk
fungsional
dideteksi dengan UV- dapat dideteksi
Vis
dengan
Fluoresen
Asam-asam
p-nitrobenzil-N,N4-bromometil-7kaboksilat;
diisopropilisourea
asetoksikumarin;
asam-asam
(PNBDI);
3,5- 4-bromometil-7-

lemak;asamasam fosfat

dinitrobenzil-N,Nmetoksikumarin;
diisopropilisourea
(DNBDI);
pbromofenasil bromida
(PBPB)
Alkohol
3,5-dinitrobenzil
klorida (DNBC); 4dimetilaminiazobenze
n-4-sulfinil
(DabsylCl); 1-naftilisosianat
(NIC-1).
Aldehid;
p-nitrobenziloksiamin Dansil hidrazin
keton
hidroklorida (PNBA);
3,5dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer
Fluoresamin
o-ftalaldehid
(OPA)
Amin primer 3,5-dinitrobenzil
7-kloro-4o
(1 )
dan klorida (DNBC); N- nitrobenzo-2sekunder
suksinimidil-poksa-1,3-diazol
o
(2 )
nitrofenilasetat
(NBD-Cl);
7(SNPA);
N- fluoro-4suksinimidil-3,5nitrobenzo-2dinitrofenilasetat
oksa-1,3-diazol
(SDNPA);
4- (NBD-F); Dansil
dimetilaminiazobenze klorida
n-4-sulfinil
(DabsylCl); 1-naftilisosianat
(NIC-1).
Asam-asam
4Fluoresamin
amino
dimetilaminiazobenze o-ftalaldehid
(peptida)
n-4-sulfinil (Dabsil-Cl) (OPA)
7-kloro-4nitrobenzo-2oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl);
7fluoro-4nitrobenzo-2oksa-1,3-diazol
(NBD-F);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (precolumn derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column
derivatization).
Referensi:

1. Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for

Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.
2. Meyer,
F.R.,
2004,
Practical
High-Performance
Chromatography, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York.

Liquid

3. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry,

BIOS Scientific Publishers Limited, New York.
4. Kenkel, J., 2002, Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition.,
CRC Press, U.S.A.
5. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC
Method Development, John Wiley & Son, New York.
6. Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part
A and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga
University Press, Surabaya.
7. Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999, Chromatography in Food science
and Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel.

Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan

menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk
yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan
semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga
pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini,
selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi

untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi
sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan

untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang
sama

3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
4. Berdasarkan area kromatogram
5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal
kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang
menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar
peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam
identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

Isolasi
Etil
p-metoksi
(Kaempferia galanga)
Skenario Pembelajaran

Sinamat

Dari

Rimpang

Kencur

HPLC
September 5, 2012 oleh TEweWe
Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid
chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk
zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik
kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan
yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan
fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan
beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas
selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan
bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, HPLC adalah alat
untuk mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif maupun
secara kuantitatif. HPLC sendiri singkatan dari High Performance Liquid
Chromatography. Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi
kandungan antibiotik pada susu dan daging udang, terutama

kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula untuk kegiatan perikanan

lainnya.
Kromatografi
cair
kinerja
tinggi
(High
Performance
Liquid
Chromatography, HPLC)
Metode pemisahannya didasarkan pada
perbedaan keseimbangan distribusi komponen sampel antara dua fasa:
diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir). Tekanan tinggi
diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah
absorpsi, partisi, pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang
digunakan al. spektrofotometrik (absorpsi sinar UV atau tampak,
fluorometri,
penggunaan
senyawa
pendar/fluoresen,
senyawa
elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi).
Prinsip Dasar HPLC
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar
dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari
masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada
dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang
pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses
identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam
keberhasilan proses analisa.
Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, prinsip kerja dari
HPLC adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang berulang kali dari
komponen yang dipisahkan. Pada saat komponen tersebut dibawa oleh
fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena
adanya perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang
didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen
tersebut antara kedua fasa.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom
dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400
atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil
untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas
permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekulmolekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih
baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan
yang
lebih
luas
melalui
kromatografi
kolom
mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan.
Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom
dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel

penunjang 50m sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang

tinggi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan
penentuan kuantitatif.
Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan
menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk
yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan
semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga
pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini,
selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi

untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi
sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan

untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang
sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
4. Berdasarkan area kromatogram
5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal
kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang
menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar
peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam
identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

Komponen Instrumen HPLC

Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC
adalah sebagai berikut:
Fasa gerak
HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak
cair, dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis.
Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi:

Fasa normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam

Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam

Fase normal HPLC

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar
misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6
mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250
mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat
lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non
polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat
melewati kolom.
Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi
tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan
pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh
karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan
waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung
membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi
gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam
pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana
halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau
metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan
menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam
kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat
melalui kolom.
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah
salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi
yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada
beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan sample recovery
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena
prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal
biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4)
merupakan yang sangat penting.
Pompa
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom.
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant
pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan
konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:

Pompa reciprocating.

Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur

(pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam
elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang
stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya
ialah ukuran reservoir tidak terbatas.

Pompa syringe

Memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan
dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual
melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a)
Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini
bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi
tidak dipengaruhi
b)
Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan
yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat
digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini
tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor)
dapat menyebabkan penyumbatan.
c)
Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk
menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan
cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai,
volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada
posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila
VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Berikut digambarkan sampel injektor pada HPLC yaitu

Injektor :

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit

mungkin

Mudah digunakan

Keberulangn tinggi

Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung
pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih
besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan Liquid
Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid Chromatography (LLC) Ion
Exchange Chromatography(IEC), Exclution Chromatography (EC).

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masingmasing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui
detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi
kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang
lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa
pada
kondisi
yang
sama.
Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur
kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa
tertarik
dalam
senyawa
tertentu,
X.
Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X
yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat
merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat
menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa
yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang

melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui
layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam
gambar
(sangat
sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang
meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat

digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan
meskipun
dalam
jumlah
kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua
substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah

anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya

jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area
dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari
X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang
gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah
besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya
memberikan puncak yang kecil.