ENZIM FUMARASE (FUMARATE HYDRATE)

4.2.1.2

PAPER
Diajukan guna Memenuhi Tugas Matakuliah Teknologi Enzim

Oleh :
Okky Santi S
111810301028

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2014

I. PENDAHALUAN
Enzim merupakan senyawa organik bermolekul besar yang berfungsi untuk
mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tumbuhan tanpa mempengaruhi
keseimbangan reaksi. Enzim tidak ikut bereaksi, struktur enzim tidak berubah baik sebelum
dan sesudah reaksi tetapi enzim sebagai biokatalisator Bagian enzim yang aktif adalah sisi
aktif dari enzim
Enzim dibagi menjadi beberapa kelompok yakni oxidoreductase, transferase,
hidrolase, liase, isomerase, daan ligase. Berikut penjelasannya :
1. Oxidoreduktase : mengkatalisis reaksi redoks. Contohnya : D asam amino oksidase
2. Transferase

: memindah gugus fungsional. Contohnya : aminotransferase

3. Hidrolase

: menyebabkan reaksi hidrolisis. Contohnya : peptidase

4. Liase

: pengurangan gugus untuk membentuk ikatan rangkap, ikatan C-O,

C-C atau C-N. Contohnya : fumarase

5. Isomerasi

: penyusunan kembali gugus fungsional, isomerasi. Contohnya :

epimerase
6. Ligase

: pembentukan ikatan yang berpasangan dengan hidrolsis ATP,

penggabungan 2 molekul. Contohnya : piruvat karboksilase

Gambar 1. Kelompok dan subkelompok enzim

II. PEMBAHASAN
2.1 Fumarase
Fumarase merupakan enzim yang termasuk dalam kelompok liase. Fumarase hydratase
(Fumarase) adalah enzim yang mengkatalisis reaksi reversible hidrasi/ dehidrasi fumarat
menjadi malat pada Siklus Krebs dalam mitokondria.

Gambar 1. Reaksi fumarat menjadi S-malat

Enzim ini juga berada di sitosol yang berperan dalam metabolisme asam amino dan fumarat.
Organisme yang mengandung
II.2 Tata Nama enzim Fumarase
Enzim fumarase termasuk ke dalam kelas lyase yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi
pemutusan ikatan. Sub kelasnya adalah carbon-oxygen lyase yang memutus ikatan karbon
oksigen, sedangkan sub sub kelas fumarase adalah hydrolase yang berarti pemutusan ikatan
ini dibantu oleh air. Reaksi yang terjadi :

Gambar 1. Reaksi fumarat menjadi S-malat

Enzim ini telah diperoleh dalam bentuk kristal dari jantung babi dengan berat molekul
200.000, mengandung 4 subunit rantai polipeptida dan tidak memerlukan koenzim pada
struktur quatenernya. Enzim ini memiliki 3 domain. Enzim ini memiliki panjang 467 residu
asam amino. Struktur sekundernya memiliki 22 heliks dengan panjang 274 residu ; 12 beta
sheet dengan panjang 35 residu. Enzim ini terdiri dari 3 domain dengan 65 residu. Bagian
tengah dari seikat 20 -heliks dari 5 helix mengikat 2 domain. Ikatan samping dari 3 subunit
menghasilkan sebuah tempat ikatan untuk anion anion yakni A site (sisi katalitik) dan B
site (sisi non-katalitik) yang terpisah oleh 12A. A site terlibat dalam transfer substrat/ produk
antara sisi aktif dan pelarut juga mengikat efektor alosterik. pH optimum 5,5 11,5.

Gambar 2. Struktur Fumarase

Berdasarkan penyusunan subunit, kebutuhan logam dan ketermostabilan fumarase
terbagi menjadi 2 subtipe yaitu Fumarase class I dan Fumarase class II. Fumarase class I
adalah enzim fumarase yang dapat menjadi non-aktif ketika terkena panas dan radiasi,
sensitif terhadap anion superoksida dan merupakan protein dimer dengan berat molekul
120kD. Fumarase class II adalah enzim fumarase yang memilik bentuk homotetramer dengan
berat molekul 200kD. Prokaryotik memiliki jenis fumarase yakni fumarase A, fumarase B
dan fumarase C. Fumarase A memiliki berat molekul 60.167kD, Fumarase B memiliki berat
molekul 60.091kD, dan Fumarase C memiliki berat molekul 50.488kD.

Gambar 3. Struktur fumarase

2.2 Mekanisme Kerja Enzim Fumarase
Fuamarase bersifat spesifik, enzim ini menghidrasi ikatan ganda trans dari fumarat
tetapi tidak bekerja terhadap maleat yaitu isomer sis dari fumarat (asam asam
monokarboksilat tidak jenuh dengan ikatan gandanya sis). Pada arah baliknya (dari L-malat
menuju fumarat), fumarase bersifat optik spesifik, enzim ini tidak mengaktalisis dehidrasi
D- malat. Fumarase A dan C tergantung dengan cAMP dan Fumarase B tumbuh maksimum
pada kondisi anaerobic. Kofaktor untuk fumarase yakni besi.

Gambar 4. Mekanisme reaksi

Residu katalitiknya yakni His 188 dan Lys 324. Lys 324 dan Asn 326 penting untuk
mengkoordinasi karboksilat dari substrat dan Ser 139 dan 140 adalah rantai samping yang
penting dalam sisi aktif Fumarase C. Mekanisme reaksi katalisis enzim fumarase, terdapat
dua grup asam basa yang mengkatalisis transfer proton dan ionisasi ini yang didefinisikan
menjadi E1 dan E2 . E1 mengikat fumarat dan mengfasilitasi transformasi fumarat menjadi

malat. E2 mengikat malat menjadi fumarat. Dua bentuk tersebut mengalami isomerisasi
dengan katalitik turnover masing masing. Namun mekanisme fumarat menjadi S- malat
masih belum sepenuhnya diketahui secara lengkap. Reaksi dari fumarat menjadi L- malat
lebih mudah dipahami dan melibatkan hidrasi stereospesifik melalui penambahan 1,4 trans
dari kelompok hidroksil.
2.3 Isolasi dan Purifikasi Enzim Fumarase dari E.coli
Enzim

fumarase

berasal

dari

bakteri

(Escherchia

coli,

Euglena

gracilis,

Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Brucella abortus 2308, E.coli K-12, Thermus

thermophilus HB8), archae (Archaeoglobus fulgidus), dan eukariotik (homo sapiens dan
saccharomyces cerevisiae). Pada E.coli Isolasi enzim fumarase dari E.coli pertama yang
dilakuakan yakni sel ditumbuhkan pada kondisi aerobic pada medium kompleks dengan
0,4% L- malate yang akan menghasilkan crude enzim. Aktivitas spesifik ekstrak crude dari
sel yang tumbuh pada kondisi aerobik dan anaerobik secara berurutan yakni 11 dan 1,5
unit/mg. Aktivitas Fe-dependent tidak dapat dibedakan dari Fe-independent ketika enzim
dalam keadaan aktif. Dalam hal ini crude enzim dari sel aerobik diambil 12 dari total
aktivitas untuk mewakili aktivitas Fe- independent dan 88% untuk mewakili aktivitas Fedependent karena waktu inaktivnya hanya dalamwaktu 24jam pada suhu 40C. Pada
perbedaanya, enzim Fe-dependent bertanggungjawab 50% dri total aktivitas pada sel kondisi
anaerobik.
Langkah yang kedua yakni memisahkan enzim fumarase Fe-dependent dari FeIndependent. 20gram Crude enzim (sel yang aerob) disuspensikan dalam 100mL buffer A.
Pemurnian ini dilakukan dari sel aerob dikarenakan jumlah pertumbuhan Fe-dependent
fumarase sangat besar. Buffer A merupakan campuran dari 10mM buffer Tris-asetat (pH7,3),
5mm 2-mercaptoetanol, 0,1M KCl dan 5% etilenglikol. Kemudian diganggu dengan sonikasi
((20kHz, 120W) dalam 20 menit. Setelah itu sel disentrifugasi selama 20menit. Crude enzim
ditambahkan dengan 2,5% streptomisin sulfat selama 60menit dan disentrifugasi selama
20menit. Kemudian supernatan ditambahkan (NH4)2SO4 sambil diaduk selama 60 menit
untuk akhir dari penjenuhan sebesar 60% . Pelet ditambahkan 20mL buffer B. Buffer B
merupakan campuran dari 10mM buffer Tris-asetat pH 7,3 yang mengandung 5mM 2mercaptoetanol, 50mM KCl dan 5% etilenglikol. Setelah ditambahkan buffer, campuran
didialisis selama 2 kali. Setelah didialisis, persiapan selanjutnya yakni menggunakan kolom
Q-sepharose dengan buffer B. Setelah kolom telah dicuci dengan 400mL buffer B , elusi
ditunjukkan dengan gradien konsentrasi KCl (3liter, 50 -50mm) dalam buffer yang sama pada
laju alir 140mL/jam. Fe-dependent fumarase dipisahkan dari Fe-independent dengan

menggunakan metode kromatografi ini dengan kondisi temperatur 0-50C. Berikut adalah
garfiknya :

Gambar 5. Kurva hasil kromatografi

Langkah selanjutnya yakni hasil pemurnian Fe-dependent fumarase dari kromatografi
diaplikasikan ke alkil-superose HR5/5 colom yang diseimbangkan dengan buffer C (10mM
buffer tris-asetat (pH7,3) mengandung 5mM 2-mercaptoetanol, 2M (NH4)2SO4 dan 5%
etanolglikol. Setelah kolom dicuci dengan 5mL buffer C, elusi ditunjukkan dengan gardien
konsentrasi linear dari (NH4)2SO4 dalam buffer yang sama pada laju alir 0,3mL/min. Elusi
dari fumarase dimonitor dengan penentuan aktivitas setelah reaktif dari fraksi. Reaktivitas
yang telah terbentuk oleh inkubasi anaerobic dengan 0,5mM besi ammonium sulfat dan
50mM 2-mercaptoetanol pada 24jam. Pada tahap ini Fe-dependent fumarase secara bertahap
kehilangan aktivitasnya dan setelah terjadi pertukaran ion dalam kromatografi Q-sepha hanya
satu puncak aktivitas sekitar 0,17M Kc1 sebelum ditambahkan etinolglikol dan KCl untuk
buffer melindungi enzim dari reversible serta inaktivasi reversible sampai batas tertentu,
aktivitas spesifik enzim sebesar 700U/mg. Gel elektrofesis SDS- poliakrilamida pada enzim
memberikan pita protein tunggal sesuai dengan Mr 60.000 dan urutan asam amino NH2terminal enzim ini identik dengan produk deduksi gen fumA. Selanjutnya hasil dari gel filtasi

menunjukkan berat molekul enzim dalam kondisi tidak terenaturasi adalah 200.000. Hasil ini
menunjukkan bahwa Fe-dependent fumarase terdiri dari 2 subunit identik dengan Mr 60.000
dan merupakan produk dari gen fumA (FUMA).
Langkah selanjutnya yakni purifikasi dari Fe-Independent fumarase. Fraksi yang
diperoleh pada kromatografi Q-Sepharose mengandung Fe-independent fumarase yang
diaplikasikan ke Fenil-Superose HR5/5 yang diseimbangkan oleh buffer D (10mM buffer
kalium fosfat (pH 7,3) mengandung 5mM 2-mercaptoetanol dan 2M (NH4)2SO4. Setelah
kolom dicuci dengan 5mL buffer D, elusi ditunjukkan dengan gradien konsentrasi dari
(NH4)2SO4 pada buffer yang sama pada laju alir 0,3mL/menit. Kemudian eluat didialisis
dengan menggunakan 3 liter buffer E (10mM buffer tris-asetat (pH7,3) yang mengandung
5mM 2-merkaptoetanol) dan kemudian diterapkan pada kolom matrex gel red A yang
diseimbangkan dengan penyangga E. Kolom dicuci dengan 20mL buffer E dan kemudian
aktivitas fumarase dengan selektif dielusi dengan buffer yang sama dicampurkan dengan
10mM L-malat pada laju alir 1mL/menit. Elektroforesis gel SDS- poliakrilamida dari enzim
memberikan pita protein tunggal sesuai dengan Mr 48.000 dan hasil dari filtrasi gel
menunjukkan bahwa enzim adalah tetramerik. Selanjutnya, Fe-independent fumarase dari sel
aerobik menunjukkan termasuk dalam produk gen FUMC

Gambar 6. Hasil Elektroforesisi

Gambar 7.squence asam amino NH2-terminal

Gambar 8. Tabel purifikasi dari Fe-dependent dan Fe-independent fumarase dari E.coli
2.4 Kinetika Enzim Fumarase
Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan cara spektrofotometri. Langkah yang
pertam yang dilakukan yakni enzim ditambahkan dengan 100mM pada buffer HEPES KOH
dengan pH 8,0 yang mengandung 50mM L-malat dengan volume total 1mL pada suhu 30 0C.
kemudian diukur absorbansi pada panjang gelombang 250nm. Untuk menentukan nilai Km
dan nilai K untuk piromelitat, pengujian dilakukan dalam buffer 10mM tris-asetat dengan pH
7,3 dan pada suhu 300C.

Gambar 9. Tabel nilai Km dan K1

Nilai Km untuk L-malat, nilai K untuk piromeltat, dan pH optimum untuk reaksi
dehidrasi malat ditentukan untuk FUMA, FUMC, dan enzim jantung babi. Pyromellitate
menghambat enzim jantung babi. Nilai Km untuk L- malat dan fumarat pada FUMA dan
FUMC mirip dan FUMA memiliki pH lebih sedikit lebih tinggi daripada pH optimum FumC.
Dalam kasus FumA, nilai K1untuk pyromelitat tidak jauh berbeda dari nilai Km untuk Lmalat. ATP juga meruapakn inhibitor dari enzim jantung babi, juga menghambat FUMA dan
FUMC dengan konsentrasi L-malat yang rendah. Dalam percobaan ini juga S-2,3dekarboxiyazirdine yang merupakan inhibitor protein dari babi dumarase jantung. Inhibitor
enzim fumarase yakni sitrat, sitrasonat, ammonium persulfat, gliserol dan trans- glutakonat.
2.5 Bioinformatika Enzim
Informasi yang didapat dari NCBI mengenai bioinformatika enzim fumarase dari
E.Coli yakni sebagai berikut :

Gambar 10. Protein Squence

Gambar 11. Hasil blasting

Gambar 12. Protein squence dari fumarase class I E.coli

Berdasarkan gambar di atas terlihat bahwa fumarase E.coli str.L-12substr.MG1655 99%
kemiripannya dengan anaerobic class I fumarase (E.coli)

III. Daftar Pustaka

Purification and Characterization of Two Types of Fumarase from
Escherichia coli1
Structure of Free Fumarase C from Escherichia coli . Todd Weaver. Acta Cryst. (2005). D61.
1395-1401
The role of the allosteric B site in the fumarase reaction. Irwin A. Rose and Todd M. Weaver.
www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0307524101