Dr.

Heni Rachmawati

School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung

LATAR BELAKANG
Biologically active peptides and proteins are
becoming
m g an increasingly
g y important
mp
class of
f
drugs.
Their use for human and animal treatment is
problematic, however, because some of these
drugs are generally ineffective when taken
orally

STUDI PREFORMULASI
Formulasi protein/peptida sangat berbeda dengan formulasi
obat lainnya
lainnya, karena struktur protein (1,2,3,4)
(1 2 3 4) yang reaksi
degradasinya tidak satu tahap, hasil degradasi tidak bisa
dideteksi dengan hanya 1 metode analisis
Saat pengembangan formulasi harus diperhatikan:
Struktur protein
Faktor-faktor
f
y
yang
g mempengaruhi
p g
stabilitas kimia dan
fisika
Teknik yang digunakan untuk stabilisasi protein

Studi preformulasi:
9 Mempelajari data fisikokimia protein dan eksipiennya
9 Evaluasi kelarutan
9 Evaluasi stabilitasnya
9 Mempelajari metode analisisnya
Pemahaman data kelarutan, stabilitas, dan titik
isoelektrik akan menentukan pH yang paling sesuai pada
saat pengembangan formulasi

PROTEIN
9 Senyawa organik makromolekul (BM 5500
220.000 dalton atau 50 2000 asam amino)
9 Tersusun dari asam amino-asam amino
(BUILDING BLOCK)
9 Ikatan yang menghubungkan asam amino satu
dengan lainnya adalah ikatan peptida,
menghubungkan gugus karbonil dengan gugus
amin

ASAM AMINO ESENSIAL

BIOSINTESIS PROTEIN
9 Sintesis protein dikode oleh gen tertentu (genetic
code)
9 Setiap protein mempunyai sekuen (urutan) asam
amino yang unik yang diturunkan dari sekuen
nukleotida pengkode protein (genetic code)
9 Kode gen merupakan rangkaian terdiri dari 3
nukleotida disebut kodon.
9 Setiap kodon akan mengkode 1 asam amino

STRUKTUR PROTEIN
Primer:
sekuen dari rantai asam-asam amino
Sekunder:
Jika sekuen asam amino
dihubungkan oleh ikatan hidrogen
Tersier
Jika terjadi interaksi antara alfa
heliks dan beta sheet.Struktur
distabilisasi oleh ik hidrogen,
jembatan garam, disulfida, dan inti
hidrofobik
Kuarterner
Protein yang terdiri dari lebih dari 1
molekul protein: dimer, trimer,
oligomer, baik homomer atau
heteromer.

IKATAN KIMIA DALAM PROTEIN UNTUK STABILISASI PROTEIN

FUNGSI PROTEIN
(protein endogen = dihasilkan oleh tubuh)

Metabolisme: enzim,, hormon

Imunologi: antibodi, sitokin
Pertumbuhan: hormon, faktor pertumbuhan
Transport dan penyimpanan: hemoglobin
Dan lain-lain

Potensial sebagai obat

Karakteristik khusus senyawa protein

1. Merupakan senyawa makromolekul yang sangat
kompleks
2. Aktivitas biologinya sangat dipengaruhi oleh
struktur dan konformasinya (primer, sekunder,
tersier, dan kuarterner)
3. Sangat poten (dosis terapi sangat kecil)
4. Sangat tidak stabil oleh berbagai faktor

SIFAT PRODUKSI PROTEIN ENDOGEN

Beberapa protein endogen diproduksi

secara konstitutif (diproduksi pada kondisi
normal): hormon, enzim, albumin
Beberapa protein endogen diproduksi
secara induktif (diproduksi hanya kalau ada
stimulus): antibodi, sitokin, faktor
pertumbuhan, enzim
Beberapa protein diproduksi konstitutif
dan induktif: albumin, hormon, enzim

KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN ENDOGEN SEBAGAI OBAT

Jumlah protein yang diproduksi tidak mencukupi untuk terapi

roduks prote
n ter
nh b s /menurun pada kond
s tertentu
Produksi
protein
terinhibisi/menurun
kondisi

PERLU ASUPAN/TAMBAHAN PROTEIN DARI LUAR

TUBUH (PROTEIN EKSOGEN)

PROTEIN EKSOGEN HARUS DIISOLASI

KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN EKSOGEN SEBAGAI OBAT

Keterbatasan donor atau tidak memungkinkan

secara etik
Reaksi penolakan jika digunakan donor dari
spesies yang berbeda

PROTEIN REKOMBINAN

ORGANISME UNTUK REKOMBINASI PROTEIN TERAPI

BAKTERI
RAGI (YEAST)
TANAMAN
MAMALIA

TERGLIKOSILASI
((mengandung
d
gugus gula)
l )

TIDAK TERGLIKOSILASI
(tidak
(tid
k mengandung
d
gugus gula)
l )

AKTIVITAS?
STABILITAS?

DEGRADASI (PENGURAIAN PROTEIN)

KIMIA
FISIKA
BIOLOGI

10

PROSES DEGRADASI PROTEIN DAPAT TERJADI SELAMA:

ISOLASI
PEMURNIAN
PENYIMPANAN

PENYIAPAN BAHAN BAKU PROTEIN

REKOMBINAN

PENANGANAN LANJUT
PENGGUNAAN

DEGRADASI PROTEIN DAPAT MENYEBABKAN

PROTEIN KEHILANGAN AKTIFITASNYA

11

FAKTOR KIMIA PENYEBAB DEGRADASI PROTEIN

Reaksi kimia dapat merusak protein sehingga aktivitas

biologinya hilang
Sumber p
pemicu reaksi kimia
9 Air
9 Keasaman/kebasaan (pH)
9 Bahan tambahan yang digunakan dalam formulasi
9 Pelarut pembantu
9 suhu
9 senyawa garam
9 ion-ion logam
9 mekanik (pengocokan)
9 konsentrasi protein

12

p
Protein disusun oleh rantai p
polipetida
membentuk
struktur 3 dimensi yang unik
Struktur protein distabilisasi oleh kombinasi interaksi
elektrostatik dan hidrofobik, dengan fleksibilitas
molekul pada struktur bagian dalam yang tinggi
Dalam larutan, struktur molekul dapat terganggu jika
kondisi lingkungan berubah termasuk perubahan dalam
ukuran molekulnya.

Stabilitas protein dalam larutan

Reaksi kimia pemicu instabilitas protein

Deamidasi
Hidrolisis
Isomerisasi
Deglikosilasi
Oksidasi
Reaksi Maillard

13

Contoh reaksi degradasi protein

Degradasi

protein

Pemotongan (cleavage)
D
Deamidasi
id i
Deamidasi
Deamidasi
Deamidase
Oksidasi
Suksinimidasi

bFGF
hEGF
bFGF
insulin
RNase A
rhPTH
bFGF

kondisi
sangat asam
netral
t l basa
b
netral basa
pH < 5
pH tinggi
pH 10
pH 4 - 5

(DENATURASI)

Adalah perubahan lipatan global dari protein (gangguan

pada struktur molekul tertingginya, yaitu struktur
tersier)
Denaturasi juga sering terjadi karena perubahan pada
struktur sekundernya.

14

Agregasi dan presipitasi

AGREGASI

Bentuk non-native self association dari suatu protein

yang masih berada dalam larutan dan secara visibel
tidak dapat terlihat dengan mata telanjang
9 Proses utama dari instabilitas fisika.
9 Pada kondisi
k
tertentu, struktur
k
sekunder,
k
tersier dan
kuarterner protein dapat berubah, menyebabkan agregasi
Aktivitas

Kelarutan

Imunogenesitas berubah

PRESIPITASI

Suatu proses makroskopik yang menghasilkan perubahan

yang visibel (peningkatan viskositas atau kekeruhan pada
larutan)
Reaksi polimerisasi (kovalen) dan agregasi (nonkovalen) berperan
terhadap pembentukan presipitat yang tidak larut
Faktor fisik penyebab agregasi dan presipitasi
Suhu (peningkatan atau penurunan)
Kekuatan ion
mekanik (Vorteks)
pH
Penambahan pelarut organik, surfaktan

15

Perubahan suhu menyebabkan hilangnya struktur

natif protein:
Ikatan hidrogen menjadi lemah
Interaksi hidrofobik menjadi kuat
Gaya nonkovalen terganggu
Protein
rot n m
menjadi
nja lebih
hf
fleksibel
s
m
menyebabkan
ny a an
unfolding parsial
Frekuensi kolisi (tumbukan) meningkat
menghasilkan agregat

16

pH dari larutan protein merupakan faktor paling

penting dalam menentukan struktur protein.
pH rendah menurunkan stabilitas sebagai akibat
terjadinya interaksi elektrostatik yang dipicu oleh
peningkatan muatan positif dari protein.
pH tinggi menurunkan stabilitas melalui tolak-menolak
muatan negatif dari protein.
Kebanyakan protein menunjukkan stabilitas maksimum
pada atau mendekati titik isoelektrik, di mana muatan
netto protein adalah netral
Banyak protein membentuk struktut unfolded pada
pH asam (2-3)

Reversibilitas agregat protein

Reversibel

dapat dilarutkan kembali dalam zat

pereduksi/pendenatur
p
p

Tidak reversibel

tidak dapat dilarutkan kembali dalam

zat pereduksi/pendenatur

Dalam farmasi jika unfoleded protein tidak dapat kembali ke

keadaan natifnya melalui refolding mis dengan penurunan suhu,
maka denaturasinya disebut irreversible

Karakteristik fisika agregat yang reversibel dan tidak

reversibel adalah sama
Struktur agregat reversibel: secara energi lebih
stabil, susunannya lebih teratur, serta lebih longgar

17

EKSIPIEN PADA FORMULASI PROTEIN

1. SISTEM DAPAR
Dapar
p yang
y g bisa digunakan
g
untuk formulasi protein:
p
9 Fosfat (pH 6,2-8,2)
9 Asetat (pH 3,8 5,8)
9 Sitrat (pH 2,1 6,2; pK 3,15 dan 6,4)
9 Suksinat (pH 3,2 6,6; pK 4,2 dan 5,6)
9 Histidin (pK 1,8;6 dan 9)
9 Glisin (p
(pK 2,35 dan 9,8))
9 Arginin (pK 2,18 dan 9,1)
9 Trietanolamin (pH 7-9)
9 Tris-hidroksimetilaminometan (pK 8,1)
9 Maleat

Fungsi dapar dalam formulasi:

9 Menjaga stabilitas sediaan dan bioaktivitas protein
9 Mempengaruhi kelarutan protein, selain kekuatan ion
Muatan protein ~ titik isoelektrik
0 pada pH di titik isoelektriknya
+ pada pH di bawah titik isoelektriknya
- Pada pH di atas titik isoelektriknya
Pendaparan sangat dekat dengan titik isoelektrik
tidak disarankan

18

2. KELARUTAN PROTEIN
9 Kelarutan protein: sangat larut, agak larut, tidak larut
bergantung pada urutan asam amino dan konformasinya
9 Kelarutan asam amino berbanding terbalik dengan
ukuran dan bagian nonpolarnya
9 Kelarutan protein ditentukan oleh kemampuan gugus
polar berinteraksi dengan air
9 Kelarutan protein umumnya minimum pada titik
isoelektriknya karena muatannya 0 sehingga interaksi
antara protein
protein-protein
protein menjadi maksimum
Dipengaruhi:
9 pH
9 Jenis eksipien yang digunakan
9 Suhu

3. PENGAWETAN SEDIAAN
9 Sediaan mengandung protein rentan terkontaminasi
mikroba,
ik b ssehingga
hi
pengawett merupakan
k k
komponen
penting terutama untuk multiple dose
9 Pemilihan pengawet merupakan faktor kritik karena
dapat mempengaruhi stabilitas fisik sediaan
(presipitasi atau turbiditi larutan)
Contoh:
9 NaHSO3 sebagai pengawet sediaan injeksi
menyebabkan degradasi insulin pada pH 4-7

19

JENIS EKSIPIEN
1.Albumin (human serum albumin, HSA)
9 Protein (BM 66,4 kDa) berperan dalam ikatan
dengan berbagai macam senyawa
9 Karena kelarutan dan stabilitasnya luar biasa,
albumin banyak digunakan sebagai eksipien
(stabiliser dan mencegah adsorpsi peptida atau
protein lain pada berbagai permukaan)
9 Albumin mencegah adsorpsi protein lain pada
permukaan karena kompetisi adsorpsi dengan
protein lain di mana albumin lebih cenderung
teradsorpsi (preferentially adsorption)

Kekurangan albumin sebagai eksipien:

9 Mengganggu analisa protein lain
9 Kemungkinan kontaminasi oleh patogen (diatasi
dengan pengembangan rekombinan HSA)

20

2. Asam amino
Fungsi:
9 Mengurangi adsorpsi
9 Menghambat agregasi
9 Menstabilkan protein terhadap denaturasi
karena panas
9 Meningkatkan kelarutan protein
9 Asam amino y
yang
g sudah digunakan
g
untuk
formulasi protein: glisin, arginin, alanin

3. Karbohidrat
9 Senyawa gula berfungsi menstabilkan protein
terhadap situasi stres: panas, liofilisasi
9 Stabilisasi protein oleh gula adalah dari
efeknya terhadap struktur air
9 Melindungi agregasi protein yang dipicu oleh
lembap
Contoh: sukrosa, maltosa, laktosa, trehalosa
- Sukrosa,
Dapat meningkatkan tegangan permukaan air
oleh karenanya meningkatkan stabilitas protein
Zat yang paling efektif melindungi hemoglobin
dari oksidasi spontan menjadi methemoglobin
selama proses liofilisasi dan penyimpanan

21

4. Zat pengkhelat
Beberapa anion dan kation dapat berikatan dengan
protein dan menurunkan kelarutannya
p
y
Fungsi zat pengkhelat:
9 Menghilangkan ion-ion tersebut dan
mempertahankan kelarutan protein
9 Menghambat reaksi oksidasi gugus sulfidril dari
protein yang dipicu oleh logam
9 Meningkatkan stabilitas terhadap agregasi yang
dipicu oleh pana
9 Contoh pengkhelat: EDTA

5. Siklodekstrin
Siklodekstrin adalah senyawa karbohidrat tapi
mempunyai mekanisme stabilisasi yang lebih unik
dibandingkan karbohidrat lain
Fungsi:
9 Meningkatkan kelarutan protein
9 Menstabilkan protein (mencegah agregasi)
9 Pembawa dalam sistem penghantaran protein

22

Struktur siklodekstrin

9 Struktur ring siklodekstrin menjadikannya

mempunyai kemampuan membentuk kompleks
inklusi karena sifat hidrofobik dari bagian
dalamnya
9 Ukuran kantung sekitar 5-10
9 Siklodekstrin yang paling banyak dipakai adalah
siklodekstrin (walaupun kelarutan dalam air
sangat rendah)

Asam amino aromatik dapat membentuk kompleks

dengan siklodekstrin

23

6. Alkohol polihidrat
Contoh:
gliserol, eritritol, arabitol, xylitol, sorbitol, manitol
Fungsi:
F
g stabilisasi protein
p
(mencegah
(m
g agregasi)
g g )
7. Polietilen glikol
Fungsi:
9 Mengurangi adsorpsi protein pada permukaan
9 Meningkatkan stabilitas protein (fisik + kimia)
9 Meningkatkan kelarutan protein

Melalui ikatan kovalen

8. Senyawa Garam
Berfungsi meningkatkan kelarutan protein
pada kekuatan ion rendah (salting in) akan
tetapi jika konsentrasi garam terlalu tinggi,
maka terjadi kompetisi antara ion dan
protein untuk molekul air menghasilkan
penurunan kelarutan protein (salting out)

Konsentrasi garam harus diperhatikan

24

9. Surfaktan
9 Surfaktan berfungsi meningkatkan stabilitas
protein pada kondisi optimal
9 Surfaktan yang paling banyak digunakan dalam
formulasi protein adalah tween 80
9 Pada pemakaian tween 80 perlu diperhatikan
cemaran peroksida karena peroksida dapat
mempercepat degradasi protein
9 Mekanisme stabilisasi protein oleh surfaktan
diduga melalui preferential absorption pada
permukaan

+ surfaktan, tidak terjadi agregasi

Tanpa surfaktan dimerisasi agregasi

25

Pangsa
g pasar
p
protein
p
rekombinan
m
berkembang pesat
tuntutan keberhasilan
formulasi sediaan protein
Pertimbangan preformulasi dan
penapisan
p
p
bentuk molekul yang
y g formulable
Teknik yang mengindikasikan stabilitas
(memonitor pembentukan atau
peningkatan cemaran
Eksipien penstabil dan peranannya dalam
mencapai waktu simpan yang sesuai

Modifikasi struktur
Substitusi asam amino meningkatkan termostabilitas
Glikosilasi (menambahkan gugus gula) meningkatkan
k k i ik farmakokinetik,
karakteristik
f
k ki
ik resistensi
i
i proteolitik,
li ik stabilitas
bili
termal
Pembentukan ikatan disulfida: perlindungan protein terhadap
denaturasi
Pegilasi (+ PEG) dapat meningkatkan kelarutan, menurunkan
imunogenisitas, meningkatkan t1/2 dan menurunkan toksisitas

26

27

Penambahan eksipien
Cryoprotectants : mencegah pembentukan kristal es saat
menyimpan
y p protein
p
pada
p
suhu -20C
Contoh krioprotektan: senyawa gula (non-reducing sugar), poliol,
Inhibitor protease untuk mencegah degradasi proteolitik

Antimikroba (natrium azide, NaN3) pada konsentrasi akhir

0.02-0.05% (w/v) atau timerosal pada konsentrasi akhir 0.01%
Logam pengkhelat (EDTA) pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk
mencegah oksidasi yang dikatalisis oleh logam
Zat pereduksi (DTT, ditiotritiol dan merkaptoetanol, 2-ME)
pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk mempertahankan protein
dalam keadaan tereduksi dengan mencegah oksidasi sistein, Cys.
Polimer seperti serum albumin, siklodekstrin: mencegah
adsorpsi permukaan protein
Asam-asam amino, seperti histidin dan metionin: antioksidan

28

Formulasi sediaan protein rekombinan

Sediaan padat

Sediaan cair

Mengontrol ukuran partikel dan distribusi ukuran

partikel dalam sediaan cair protein merupakan hal
yang sangat sulit.

Formulasi dalam sediaan kering (lebih diminati)

Spray-drying

Teknologi cair
superkritik

Freeze drying/
liofilisasi

Protein yang stabil selama proses dan penyimpanan

29

Proses Spry freeze drying/liofilisasi untuk formulasi

sediaan protein serbuk
Atomisasi larutan protein + pembawa
ke dalam nitrogen cair

dispersi kasar

Pemindahan dispersi padat

ke precooled freeze dryer

Pengeringan menggunakan
program standar freeze drying

reconsitutable

Liofilisat protein
Kadar air < 3%

Stabilitas protein tetap terjamin:

Struktur
Aktivitas

30

Faktor-faktor yang perlu diperhatikan

dalam proses liofilisasi protein

1 Jenis dan konsentrasi krioprotektan

1.
2.Konsentrasi protein
3.Konsentrasi bulking agent

Liofilisasi versus stabilitas protein : aktivitas

Contoh formulasi tripsinogen dengan liofilisasi
Pengaruh konsentrasi terhadap aktivitas produk akhir

31

Pengaruh konsentrasi lioprotektan

Pengaruh konsentrasi lioprotektan

32

Pengaruh konsentrasi protein

AAPS PharmsciTech 2005

Liofilisasi versus stabilitas protein : agregasi

J.Pharm.Sci., 2001, 90

33

Pengaruh jenis dan konsentrasi lioprotektan

J.Pharm.Sci., 2001, 90

Pengaruh konsentrasi protein

34

Liofilisasi versus rekonstitusi

Pengaruh konsentrasi protein terhadapa struktur liofilisat
Konsentrasi protein

Pengaruh konsentrasi protein terhadap waktu rekonstitusi

10 min setelah rekonstitusi

35

Sediaan protein liofilisat

Freeze dryer

Sistem penghantaran
Merupakan bagian integral dari pengembangan produk farmasi
terutama untuk biomolekul.
Berperan tidak hanya dalam pengaturan siklus hidup suatu
molekul tapi juga pada aspek farmakologinya
Salah satu tantangan dalam terapi menggunakan protein adalah
b
bagaimana
im n sist
sistem
mp
penghantaran
n h nt n yang
n ttepat
p t
9 Nyaman bagi pengguna
9 Efektif
9 Efisien

36

RUTE INJEKSI
Sistem penghantaran pertama dan yang masih
dipertahankan sampai sekarang untuk protein dan
peptida

Ketidaknyamanan penggunaan
Merupakan rute invasif
Jaminan yang tinggi akan sterilitas sediaan
Biaya dan keterbatasan penggunaan
LIMITATION

Alternatif sistem penghantaran protein terapetik

1. Penghantaran protein melalui paru-paru (pulmonary
delivery): untuk insulin
2. Penghantaran
g
melalui oral :terutama untuk pengobatan
p g
jangka panjang: MOST TARGET
Penggunaan carrier untuk menghindari degradasi GI
Strategi pengembangan untuk meningkatkan absorpsi
3. Penghantaran melalui nasal
Merupakan pengembangan terkini penghantaran
protein melalui absorpsi transmukosa, sangat efektif
dan tidak iritan

Peluang pasar untuk sediaan protein terapetik

37

38

39

TUJUAN FORMULASI PROTEIN

Secara umum sama dengan tujuan formulasi senyawa obat:
11. Meningkatkan
k k penerimaan kepada
k
d pasien
2. Meningkatkan stabilitas dan efikasi
3. Memudahkan penggunaan
4. Meningkatkan performan

40