Asam Nukleat
Asam Nukleat
ASAM NUKLEAT
Pokok bahasan di dalam bab ini menguraikan struktur molekul dan komponen
asam nukleat, termasuk macam-macam ikatan kimia yang menghubungkan komponenkomponen tersebut. Selain itu, dijelaskan pula perbedaan struktur antara DNA dan RNA,
serta sifat-sifat fisika-kimia dan spektroskopik-termal asam nukleat, khususnya DNA.
Dengan mempelajari pokok bahasan ini akan diperoleh gambaran mengenai perubahan
struktur yang terjadi pada asam nukleat yang dimanipulasi, dan juga mekanisme
manipulasi asam nukleat yang pada dasarnya berkaitan dengan sifat-sifat fisikakimianya.
Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan
mampu menjelaskan:
1. struktur molekul dan komponen-komponen asam nukleat, termasuk macam-macam
ikatan kimia yang terdapat di dalamnya,
2. perbedaan struktur antara DNA dan RNA,
3. cara pembacaan sekuens suatu molekul asam nukleat,
4. sifat-sifat fisika-kimia asam nukleat, dan
5. sifat-sifat spektroskopik-termal asam nukleat
Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok
bahasan ini dengan lebih baik adalah sejarah penemuan asam nukleat beserta percobaanpercobaan yang membuktikan bahwa DNA merupakan materi genetik pada sebagian
besar organisme dan RNA merupakan materi genetik pada virus tertentu. Pengetahuan
tersebut telah diperoleh melalui mata kuliah Genetika pada semester VI. Adapun urutan
bahasan di dalam bab ini adalah struktur molekul asam nukleat, sifat-sifat fisika-kimia
asam nukleat, dan sifat-sifat spektroskopik-temal asam nukleat.
Struktur Molekul
Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan
sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi
genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari
sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur
15
yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida
(basa N).
Ada
dua
macam
asam
nukleat,
yaitu
asam
deoksiribonukleat
atau
deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA).
Dilihat dari strukturnya, perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini terutama
terletak pada komponen gula pentosanya. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa,
sedangkan pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C
nomor 2 sehingga dinamakan gula 2-deoksiribosa (Gambar 2.1.b).
Perbedaan struktur lainnya antara DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N,
baik pada DNA maupun pada RNA, mempunyai struktur berupa cincin aromatik
heterosiklik (mengandung C dan N) dan dapat dikelompokkan menjadi dua golongan,
yaitu purin dan pirimidin. Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan
basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA,
purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada
perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin
(C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U).
Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5
sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil.
O-
5 CH 2OH
5 CH 2OH
O
O - P-O
4
H
gugus fosfat
1
H
2 H
OH
a)
4
H
H
OH
1
H
2 H
OH
gula ribosa
gula 2-deoksiribosa
b)
NH2
6
N 1
N
7
NH2
6
HN 1
N
7
3
N
9
NH
adenin
4
N 3
4
5
HN 3
8
H2N
3
N
2
9
NH
O
1
NH
guanin
sitosin
c)
1
NH
16
17
Selain ikatan glikosidik yang menghubungkan gula pentosa dengan basa N, pada
asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang menghubungkan
antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5 gula pentosa dan gugus hidroksil pada posisi
3 gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan ikatan fosfodiester karena
secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester (Gambar 2.2).
OO
ikatan glikosidik
O 5
O
ikatan 3-5fosfodiester
3
O
O
G
ikatan glikosidik
O 5
O
ikatan 3-5fosfodiester
3
O
O-
ikatan glikosidik
O 5
O
3OH
Gambar 2.2. Ikatan fosfodiester dan ikatan glikosidik pada asam nukleat
Oleh karena ikatan fosfodiester menghubungkan gula pada suatu nukleotida
dengan gula pada nukleotida berikutnya, maka ikatan ini sekaligus menghubungkan
kedua nukleotida yang berurutan tersebut. Dengan demikian, akan terbentuk suatu rantai
polinukleotida yang masing-masing nukleotidanya satu sama lain dihubungkan oleh
ikatan fosfodiester.
Kecuali yang berbentuk sirkuler, seperti halnya pada kromosom dan plasmid
bakteri, rantai polinukleotida memiliki dua ujung. Salah satu ujungnya berupa gugus
fosfat yang terikat pada posisi 5 gula pentosa. Oleh karena itu, ujung ini dinamakan
ujung P atau ujung 5. Ujung yang lainnya berupa gugus hidroksil yang terikat pada
posisi 3 gula pentosa sehingga ujung ini dinamakan ujung OH atau ujung 3. Adanya
ujung-ujung tersebut menjadikan rantai polinukleotida linier mempunyai arah tertentu.
Pada pH netral adanya gugus fosfat akan menyebabkan asam nukleat bermuatan
negatif. Inilah alasan pemberian nama asam kepada molekul polinukleotida meskipun
di dalamnya juga terdapat banyak basa N. Kenyataannya, asam nukleat memang
merupakan anion asam kuat atau merupakan polimer yang sangat bermuatan negatif.
18
19
Oleh karena basa bisiklik selalu berpasangan dengan basa monosiklik, maka jarak
antara kedua rantai polinukleotida di sepanjang molekul DNA akan selalu tetap. Dengan
perkataan lain, kedua rantai tersebut sejajar. Akan tetapi, jika rantai yang satu dibaca
dari arah 5 ke 3, maka rantai pasangannya dibaca dari arah 3 ke 5. Jadi, kedua rantai
tersebut sejajar tetapi berlawanan arah (antiparalel).
3
20
21
komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik
antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat dikatakan bersifat
apurinik.
Pengaruh alkali
Pengaruh alkali terhadap asam nukleat mengakibatkan terjadinya perubahan
status tautomerik basa. Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan perubahan
struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut
kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya
sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami
denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral sekalipun,
RNA jauh lebih rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA karena adanya
gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya.
Denaturasi kimia
Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat
pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid
(COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat
merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi
berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.
Viskositas
DNA kromosom dikatakan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi karena
diameternya hanya sekitar 2 nm, tetapi panjangnya dapat mencapai beberapa sentimeter.
Dengan demikian, DNA tersebut berbentuk tipis memanjang. Selain itu, DNA
merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA akan mempunyai viskositas
yang tinggi. Karena sifatnya itulah molekul DNA menjadi sangat rentan terhadap
fragmentasi fisik. Hal ini menimbulkan masalah tersendiri ketika kita hendak melakukan
isolasi DNA yang utuh.
Kerapatan apung
Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung
(bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat
22
molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang
sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi
dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi ke
dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan
bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini dikenal
sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium density
gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik.
Oleh karena dengan teknik sentrifugasi tersebut pelet RNA akan berada di dasar
tabung dan protein akan mengapung, maka DNA dapat dimurnikan baik dari RNA
maupun dari protein. Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk keperluan analisis
DNA karena kerapatan apung DNA () merupakan fungsi linier bagi kandungan GCnya. Dalam hal ini, = 1,66 + 0,098% (G + C).
protein
CsCl 8M
sentrifugasi
DNA
RNA
23
Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Protein, dengan
maks = 280 nm, tentu saja mempunyai nisbah A260 /A280 kurang dari 1,0. Oleh karena itu,
suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan
terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai
A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein.
24
Superkoiling DNA
Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau closedcircular (CC), misalnya DNA plasmid dan kromosom bakteri serta DNA berbagai virus.
Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan satu sama lain dihubungkan sesuai
dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA tersebut.
Sejumlah sifat muncul dari kondisi sirkuler DNA. Cara yang baik untuk
membayangkannya adalah menganggap struktur tangga berpilin DNA seperti gelang
25
karet dengan suatu garis yang ditarik di sepanjang gelang tersebut. Jika kita
membayangkan suatu pilinan pada gelang, maka deformasi yang terbentuk akan terkunci
ke dalam sistem pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai superkoiling.
Interkalator
Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling dapat berubah akibat
beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya. Sebagai contoh, peningkatan
suhu dapat menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan kekuatan ionik
dapat menambah jumlah pilinan. Salah satu faktor yang penting adalah keberadaan
interkalator seperti etidium bromid (EtBr). Molekul ini merupakan senyawa aromatik
polisiklik bermuatan positif yang menyisip di antara pasangan-pasangan basa. Dengan
adanya EtBr molekul DNA dapat divisualisasikan menggunakan paparan sinar UV.