PRAKTIKUM I

PENGENALAN ALAT DAN BAHAN

TANGGAL PRAKTIKUM : SENIN, 19 APRIL 2010

PEMBIMBING : IBU TITA SUSANTI

Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman
(akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi
invitro (di dalam gelas/botol). Keuntungan dati kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu,
dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam
dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah
tanaman anggrek.

Pada pelaksanaan kultur jaringan, terdapat banyak bahan-bahan dan peralatan yang diperlukan.
Setiap tahapan proses kultur jaringan memerlukan peralatan dan bahan yang berbeda. Peralatan
ini akan digunakan dalam pembuatan media, persiapan eksplan (inisiasi), penanaman (inokulasi),
inkubasi dan aklimatisasi.

I. PERALATAN DAN BAHAN

A. Peralatan yang dibutuhkan untuk melaksanakan kultur jaringan :
1. Alat Pembuatan Media
2. Alat Persiapan Eksplan (Inisiasi)
3. Alat Penanaman (Inokulasi)
4. Alat Inkubasi
5.Alat Aklimatisasi

Masing-masing peralatan mempunyai fungsi tersendiri. Adapun fungsi masing-masing peralatan

yang digunakan :
1. Alat Pembuatan Media
NO ALAT FUNGSI
1. Gelas becker/piala Untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan
kimia dan air aquades dalam pembuatan media.
 Ukuran gelas piala bervariasi, 100ml, 300ml,
1000ml, 2000ml.
2. Pipet Untuk mengambil cairan.
Untuk menimbang bahan kimia yang diperlukan
3. Timbangan
dalam pembuatan media kultur.
Untuk mengambil bahan kimia yang diperlukan
4. Spatula
dalam pembuatan media kultur.
Untuk mengukur pH media ketika membuat
5. Indicator pH/ lakmus
media.
Untuk mengaduk media saat persiapan dan saat
6. Sendok kaca
pemanasan.
7. Panci Tempat memasak media.
8. Kompor Untuk pemanas saat memasak media.
Untuk mensterilkan semua peralatan dan media
9. Autoklaf kultur yang dipakai dalam kegiatan kultur
jaringan.
Tempat untuk mengkulturkan atau menanam
10. Botol kultur
eksplan.
Untuk penutup pada botol kultur dan sebagai
11. Plastik dan karet tahan panas
pengikat plastik dengan botol kultur.

2. Alat Penyiapan Eksplan (Inisiasi)

NO ALAT FUNGSI
Tempat untuk mengkulturkan atau menanam
1. Botol kultur
eksplan.
2. Scalpel Untuk pemotongan eksplan
3. Gunting Untuk memotong eksplan

3. Alat Penanaman (Inokulasi)

NO ALAT FUNGSI
Untuk menanam eksplan ke dalam botol dalam
1. Laminar air flow/enkas kondisi steril atau melakukan sub kultur yang
dilengkapi dengan blower dan lampu UV.
2. Pinset Untuk mengambil eksplan.
 Untuk mengambil eksplan berupa biji/plb
3. Spatula
anggrek.
Tempat untuk memotong-motong eksplan yang
4. Petridish
akan di tanam dalam botol kultur.
Untuk menggarang/membakar alat-alat kultur,
seperti alat-alat diseksi ketika melakukan
5. Bunsen
penanaman sehingga peralatan tersebut tetap
steril.

4. Alat Inkubasi
NO ALAT FUNGSI
Tempat untuk menyimpan botol-botol berisi
1. Rak kultur eksplan hasil inokulasi dan mengoptimalkan
pemanfaatan ruangan yang ada.
Untuk menjaga suhu ruangan agar tetap stabil
2. Air conditioner (AC)
sesuai dengan kondisi suhu untuk kultur jaringan.
Untuk memberikan penerangan dan cahaya bagi
3. Lampu
pertumbuhan tanaman.
Untuk mengatur waktu penyinaran pada tanaman
4. Timer listrik
kultur.
5. Termometer suhu ruangan Untuk mengetahui suhu ruangan

5. Alat Aklimatisasi
NO ALAT FUNGSI
Untuk tempat plantlet yang telah dikeluarkan dari
1. Ember
botol yang akan dicuci.
Tempat perendaman plantlet dengan fungisida dan
2. Gelas becker/piala
bakterisida.
3. Pinset Untuk mengeluarkan plantlet dari botol kultur.
4. Timbangan Untuk menimbang fungisida dan bakterisida.
Untuk mengaduk larutan fungisida dan
5. Pengaduk kaca
bakterisida.
6. Pot try Tempat menanam plantlet.
 Alas untuk mengeringkan tanaman yang sudah di
7. Kertas koran
rendam.

B. Bahan yang digunakan dalam praktek kultur jaringan antara lain:

Bahan yang digunakan dalam proses kultur jaringan berbeda satu sama lain tergantung dari
proses yang akan dilakuakan. Setiap tahap tersebut membutuhkan bahan tersendiri, diantaranya :
1. Bahan untuk membuat media MS praktis
2. Bahan persiapan dan sterilisasi Eksplan
3. Bahan penanaman (Inokulasi)
4. Bahan aklimatisasi

Gambar peralatan dan bahan kultur jaringan

Adapun bahan yang digunakan dalam pelaksanaan praktek kultur jaringan, antara lain :
N JENIS BAHAN
media ms Persiapan dan sterilisasi inokulasi aklimatisasi
O
eksplan
1 Media MS jadi Eksplan Alcohol Tanaman
2 bahan kimia untuk Air Aquadest Air
pembuatan media
3 hyponex Fungisida Betadin Fungisida
4 Gula Bakterisida eksplan Bakterisida
5 Agar HgCl2 - Media (pakis,
arang)
6 air Pemutih pakaian - -
7 - alkohol - -
 II. STERILISASI ALAT DAN BAHAN
Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-
alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting
dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus
untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi
tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara
sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, -
Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet

Autoklaf
Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang
sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan
sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan
air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini
tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf
ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi
dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif
murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara
yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Media dan Aquades

Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan
dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer
250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan
waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.

Untuk media kultur

Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile,
sterilisasi C, tekanan antara 15-17.5dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121 psi dengan
waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media
dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan
waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu
yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan
sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan
diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi
dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm.
Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk
volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat
labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan antibiotik: carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer
Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya
disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan
dipanaskan selama 4 jam pada C.temperatur 160 Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan.
Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus
ditutup dengan aluminium foil.

Enkas
Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer
berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah
enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru
kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan.
Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan
enkas.
Laminar
Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,
"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus
kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air
flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "
Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas
yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow
cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan
selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja.
Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat
kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.

III. RUANGAN YANG ADA DALAM KULTUR JARINGAN

Ruangan yang dibutuhkan dalam proses kultur jaringan pada dasarnya di bagi 3 kelompok, yaitu
ruang persiapan (preparasi), ruang penanaman (inikulasi), ruang pentimpanan (inkubasi). Selain
ketiga ruangan tersebut, ada beberapa rungan yang biasanya ada di laboratorium kultur jaringan
tergantung dari kebutuhan. Adapun penjelasan dari masing-masing ruangan yaitu sebagai
berikut:

a. Ruang persiapan
 Untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman : penimbangan,
pengeceran, penuangan kedalam wadah kultur dan sterilisasi.
 Sebagaitempat pencucian : kotoran bahan dari lapangan, pembuangan dan
pemotongan bagian yang tidak diperlukan dan sebagai perlakuan awal untuk
menghindari kontaminasi.
 Tempat penyimpanan alat-alat kultur jaringan.
 Gambar dalam ruang persiapan

b. Ruang transfer
Ruang transfer dimana pekerjaan aseptic dimulai
 Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi bagian tanaman, sterilisasi, dan
penanaman eksplan dalam media.
 Ruangan ini sedapat mungkin bebas debu dan serangga dan ruangan ini tersekat.
 Pintu penghubung harus selalu tertutup, ber AC dan punya pintu penghubung
antara ruangan yang satu dengan yang lainnya.

c. Ruang kultur atau inkubasi

Ruangan ini merupakan ruangan penyimpanan hasil inisiasi eksplan.

Gambar ruang inkubasi

Alat Fungsi
Rak kultur Tempat untuk menyimpan botol-botol
berisi eksplan hasil inokulasi dan
mengoptimalkan pemanfaatan ruangan
 yang ada.
Air conditioner (AC) Untuk menjaga suhu ruangan agar tetap
stabil sesuai dengan kondisi suhu untuk
kultur jaringan.
Lampu Untuk memberikan penerangan dan cahaya
bagi pertumbuhan tanaman.
Timer listrik Untuk mengatur waktu penyinaran pada
tanaman kultur jaringan.
Termometer suhu ruangan Untuk mengetahui suhu ruangan

d. Ruang penyimpanan bahan kimia

Ruangan ini digunakan untuk menyipan bahan-bahan kimia yang akan digunakan untuk
kultur jaringan.

Ruang penyimpanan bahan kimia