ABSTRACT
The objective of the experiment is to study the protein profile of Sarcoptes
scabiei mites, based on molecule weight. Sarcoptes scabiei protein have an
antigenic effect, therefore it can be use as diagnostic substances for controlling
scabies diseases which is caused by Sarcoptes scabiei mites. This research method
was started by isolation of Sarcoptes scabiei mites from goat that infected by
scabies. By scraping of goat skin until blood spot appearance. Sarcoptes scabiei
isolates was analysed by SDS-PAGE 12% to detect of whole protein on sarcoptes
which is measuring in relative moleculer weight (kDa). Results of the experiment
showed the whole protein of Sarcoptes scabiei was identified of 12 bands of
protein, and range about 26.7 kDa to 208.4 kDa with detail as follow as: 208.4
kDa, 187.4 kDa, 128.9 kDa, 98.2 kDa, 79.9 kDa, 58.5 kDa, 49.9 kDa, 43.9 kDa,
40.6 kDa, 35.0 kDa, 28.2 kDa, and 26.7 kDa. Several bands of protein which
appeared bold are: 208.4 kDa, 58.5 kDa, 49.9 kDa and 40.6 kDa.
Metode Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif laboratorik, yaitu suatu
penelitian yang dimaksudkan untuk menjawab pertanyaan tentang bagaimana
profil protein antigen tungau Sarcoptes scabiei var.caprae.
Penelitian ini menggunakan bahan dasar tungau Sarcoptes scabiei
var.caprae dewasa. Bahan kimia yang digunakan pada penelitian berupa: PBS,
acrylamide, Tris HCl pH 8,8, SDS 10%, aquadest, TEMED, APS, buthanol, Tris
HCl pH 6,8, Laemmli buffer, electrophoresis buffer, methanol, acetic acid,
glutaraldehyde 10%, AgNO3, NaOH 0,36%, NH3, Formaldehyde, Zitronensaure.
Koleksi dan Isolasi tungau Sarcoptes scabiei dimulai dengan proses scraping pada
bagian keropeng scabies menggunakan pisau scalpel hingga terdapat bintik-bintik
darah, hal ini untuk mendapatkan tungau Sarcoptes scabiei yang berada di
terowongan lapisan tanduk, kemudian diletakkan pada petridish (Lastuti dkk.,
2006). Hasil scraping keropeng tersebut dimasukkan dalam tabung konikel
berukuran 10 ml dan dilarutkan dalam PBS 10% kemudian disentrifus dengan
kecepatan 2.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan debris dan tungau.
Supernatan hasil sentrifus dikumpulkan, sedangkan endapan yang berisi
kerak dilarutkan kembali dengan PBS 10% dan disentrifus lagi untuk
mendapatkan supernatan yang banyak mengandung sarcoptes. Supernatan
diperiksa, diletakan di petridish dan dilakukan preparasi di bawah mikroskop
disecting dengan perbesaran 40 kali dan sarcoptes yang terlihat diambil satu
persatu dengan menggunakan pipet kemudian dimasukkan dalam tabung berisi
PBS 10% (Lastuti dkk., 2006).
Sebagian isolat dicuci dengan PBS 10% dan disentrifus dengan kecepatan
3.000 rpm selama 10 menit. Pencucian tersebut dilakukan tiga kali. Endapan yang
terbentuk berupa pellet disimpan dalam freezer -80°C yang siap digunakan untuk
elektroforesis protein sarcoptes. Kemudian dilakukan teknik sonikasi. Isolat
dilarutkan dalam satu ml PBS dan disonikasi pada 30 kHz, diulang sebanyak 16
kali, masing-masing selama 4 menit dengan waktu istirahat 2 menit. Larutan hasil
sonikasi disentrifus dengan kecepatan 16.000 rpm selama 5 menit, kemudian
supernatan yang dihasilkan siap digunakan sebagai sampel protein untuk SDS-
PAGE dan didiamkan semalam sebelum digunakan dan konsentrasinya diukur
menggunakan spektrofotometer (Lastuti dkk., 2006).
Karakterisasi protein dilakukan melalui elektroforesis whole protein
dengan menggunakan teknik SDSPAGE. Menurut Rantam (2003) adapun cara
kerja dari SDS-PAGE sebagai berikut:
a. Mencetak running gel 12% Bahan-bahan running gel 12% dicampur
sampai homogen (acrylamide 2,5 ml, Tris HCl (pH 8,8) 1,2 ml, SDS 10%
1,2 ml, aquadest 1,1 ml, TEMED 5 μl, APS 10% 30 μl) kemudian
campuran tersebut dimasukkan dalam gelas plate melalui dindingnya agar
tidak terbentuk gelembung, sampai kira-kira satu cm dari atas. Buthanol
ditambahkan di atasnya sampai penuh (lebih kurang 1 ml) dan dibiarkan
selama 25 menit pada suhu kamar agar gel membeku, selanjutnya sisa
buthanol dibuang dan dibersihkan dengan PBS lalu dikeringkan.
b. Mencetak stacking gel 5% Cara pembuatan stacking gel sama seperti
mencetak running gel. Bahanbahan stacking gel 5% dicampur hingga
homogen (acrylamide 0,66 ml, Tris HCl (pH 6,8) 0,8 ml, SDS 10% 0,8 ml,
aquadest 0,8ml, TEMED 4 μl, APS 10% 20 μl) kemudian campuran
tersebut dimasukkan di atas running gel yang telah mengeras hingga
penuh. Comb dimasukkan dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 15-
25 menit sampai stacking gel mengeras. Langkah terakhir yaitu melepas
serta mencuci stacking gel dengan electrophoresis buffer.
c. Persiapan sampel Sampel sebanyak 15 μl dicampur dengan Laemmli
buffer dengan perbandingan 2:1lalu dimasukkan ke dalam appendorf yang
telah di lubangi tutupnya dengan jarum ½ tusukan (3 lubang). Campuran
tersebut dipanaskan dengan waterbath pada suhu 100°C selama 5menit.
d. Elektroforesis dimulai dengan memasang gelas plate dan dirangkai dengan
frame dari bio-Rad.. Sampel dan marker yang telah dibuat dimasukkan ke
dalam lubang comb. Marker yang digunakan adalah protein dengan berat
molekul 14.4 – 200 kDa. Elektroforesis dijalankan dengan kecepatan 125
V dan kuat arus 40 mA. Proses ini dihentikan setelah warna biru turun
(Laemmli turun) kurang lebih tiga sampai empat jam.
e. Pencucian terhadap hasil running Gel hasil elektoforesis dimasukkan ke
dalam petridish dan dilakukan 4 kali pencucian. Pencucian pertama
menggunakan methanol 25 ml, acetic acid 3,75 ml, aquadest. Pencucian
kedua menggunakan methanol 2,5 ml, acetic acid 3,75 ml, aquadest.
Pencucian ketiga menggunakan glutaraldehyde 10 %. pencucian keempat
menggunakan aquadest 100 ml sebanyak 3 kali pencucian. Masing-
masing pencucian selama 30 menit.
f. Pewarnaan Silver Gel hasil elektroforesis yang telah mengalami proses
pencucian kemudian di masukkan ke dalam petridish yang berisi larutan
AgNO3 0,8 gram dan 4 ml aquadest, NaOH 0.36% 21 ml, NH3 1,4 ml,
tambahkan aquadest 73,5 ml. Goyang dengan kecepatan 42 rpm selama
30 menit. Buang larutan dan dilanjutkan pencucian menggunakan
aquadest sebanyak 3 kali, masing-masing selama 2 menit.
g. Pengembang Warna Pita Protein Gel dimasukkan larutan pengembang
warna yang terdiri dari 100 μl zitronensaure 5%, 50 μl formaldeyide 37%,
100 ml aquadest dan goyang hingga timbul pita proteinnya.
h. Stop Reaksi Setelah semua pita proteinnya terlihat, kemudian stop reaksi
menggunakan larutan acetic acid 10%, selanjutnya gel disimpan dalam
larutan gliserin 10%.
i. Analisis Hasil Perhitungan berat molekul dilakukan membandingkan
standart marker.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil karakterisasi dengan SDS-PAGE 12%, profil protein
dari tungau Sarcoptes scabiei var.caprae yang diisolasi dari hewan kambing yang
terinfeksi scabies menunjukkan telah teridentifikasi 12 pita (band) protein, yang
berkisar antara 26,7 kDa sampai 208,4 kDa dengan rincian sebagai berikut: 208,4
kDa, 187,4 kDa, 128,9 kDa, 98,2 kDa, 79,9 kDa, 58,5 kDa, 49,9 kDa, 43,9 kDa,
40,6 kDa, 35,0 kDa, 28,2 kDa, dan 26,7 kDa. Beberapa pita protein tampak tercat
tebal yaitu 208,4 kDa, 58,5 kDa, 49,9 kDa, dan 40,6 kDa.
Daftar Pustaka
Arlian, L.G., M.S. Morgan, D.L. Vyszenski-Moher, and B.L. Stemmer. 1994.
Sarcoptes scabiei: the circulating antibody respone and induced immunity to
scabies. Exp.Parasitol.78:37-50
Damriyasa, I.M., Failing., R Volmer., H.Zahner and C.Bauer. 2004. prevalence,
risk factor and economic importance of infestations with Sarcoptes scabiei
and Haematopinus suis in sows of pig breeding farms in Hesse, Germany.
Medical and Veterinary Entomology 18:361-367
Dorny, P.T.V., Wyngaarden, J.Vercruysse, C.Symeons, and A.Jalia,A. 1994.
survey on the importance of mange in the aetiologi of skin in goats in
peninsular Malaysia. Trop.Mad.Parasitol 26:81-86
Gabay, M.M.,W.N.Beesley and M.A.Awan. 1992. A survey on farm animals in
Libya. Ann.Trop.Med.Parasitol.86;537-542
Guldbakke, K.K. 2006. Crusted scabies: a clinical review journal of drugs in
dermatology. (http://findaricles.com/p/articles/ mi_mOPDE).
Gutierrez., J.F., J.Mendez De Vigo, J.Castella, E. Munoz and D. Ferrer. 1996.
Prevalence of sarcoptic mange in fatening pigs sacrifieced in a
sleughterhouse of northeasthern spain. Vet.Parasitol.61:145-149
Harumal, P., M.Morgan., S.F Walton., D.C. Holt., J. Rode., L.G. arlian., B.J.
Currie and D.J. Kemp. 2003. Identification of homologue of a house dust
mite allergen in cDNA library from Sarcoptes scabiei var.hominis and
evaluation of its vaccine potential in Sarcoptes scabiei var.canis.
Am.J.Trop.Med.Hyg.68(1):54-60
Hungerford, T.G. 1975. Disease of Livestock. 8th ed. Mc.Graw-Hill Book
Company. Sydney. 894-895
Karthikeyan, K. 2004. Treatment of scabies: never prespectives. Postgraduate
medical Jornal 2005:81:7-11.
Kambarage, D.M., P.Msolla and J.Falmer-Hansen, 1990. Epidemiological studies
of Sarcoptes mange in Tazmanian pig herds. Trop.anim.Health.22:226-230
Kemp, D.J, Shelley F Walton, Pearly Harumal and Bart J Currie. 2002. The
Scourge of scabies (http:// www.google.com/TheScourgeofScabies/pdf)
Kusnoto, 2003. Isolasi dan Karakterisasi Protein Immunogenik Larva stadium II
Toxocara cati Isolat lokal. Tesis. Progam Pascasarjana Universitas
Airlangga. Surabaya.
Lastuti, N.D.R., Kadek R., Ririen N.W. 2006. Karakterisasi Protein Antigenik
Sarcoptes scabiei untuk pengembangan kit diagnostik pada kambing.
Laporan Penelitian Proyek Due Like Batch III. Universitas Airlangga.
Surabaya.
Levine, N.D. 1994. Buku Pelajaran Parasitologi Veteriner (terjemahan). Gajah
Mada University Press. Yogyakarta. 325-327
McCarthy, J.S, D.J. Kemp, S.F Walton and B.J. Currie. 2004. Scabies more than
just an irritation. Poatgraduate Medical Journal 2004;80:382-387
Noble, E.R and G.A. Noble. 1989. Parasitologi : the Biology of animals Parasites
5th ed. Lea and Febiger. Philadelphia. 785-786
Ralph, E.W., Robert D Hall, Alberto B. Bruce, philip J. Scholl. 1985. livestock
Entomology. A Wiley Interscience Publication. Texas.265-267
Rantam, Fedik A. 2003. Metode Immunologi. Airlangga University Press.
Surabaya. 145-155
Sasmita, R., Poedji H., Agus S. Dan Ririen N.W. 2005. Buku Ajar Ilmu Penyakit
Arthropoda Veteriner. Laboratorium Entomogi dan Protozoologi.
Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga. Surabaya.
Schumann, R.J., Morgan, M.S., Glass R. And Arlian L.G. 2001. Charakterization
of House dust mite and scabies mite allergens by use of canine serum
antibodies. American Journal of Veterinary vol 62 no 9 pp 1344-1348
Sutiman, B. Sumitro, Sri Rahayu, Fatiyah, Sri Widyarti Esti. 1989. Diktat Kuliah
dan Praktikum. Kursus Teknik-teknik dasar Analisis Protein dan DNA.
Soulsby, E.J.L. 1986. Helmint, Arthropods And Protozoa of Domesticated
Animal. 7th ed.
Bailliere Tindall. W.B. Sounders. England. 482-486
Tarigan, S. 2004. Antibody responses in naive and sensitised goats infested by
Sarcoptes scabiei. JITV.7(4):265-271
Urquhart, G.M., Armour, J.L., Duncan, A.M. Dunn and F.W. Jennings. 1989.
Veterinary Parasitology. Departement of Veterinary Parasitology. The
Faculty of Veterinary Medicine The University of Glasgow. Scotland. 184-
187
Wongsosupantio, S. 1989/1990. pedoman kuliah Elektroforesis Gel Protein. Pusat
Antar Universitas- Bioteknologi. Universitas Airlangga. Yogyakarta. 29