IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANISME SAMPEL

I.

Tujuan Percobaan :
Mampu menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang
telah didapat untuk menentukan genus kultur bakteri yang belum diketahui.
II.

Dasar Teori :

Spesies berasal dari bahasa Latin species

yang merupakan tingkatan dalam taksonomi
yang terkecil, biasanya digunakan untuk
mengklasifikasi organisme baik yang hidup
maupun organisme yang fosil.
Dalam biologi, species adalah salah satu
bentuk pengelompokan dalam klasifikasi
makhluk hidup.. Dalam sistem tatanama
binomial, nama suatu spesies makhluk
hidup terdiri atas dua kata: nama genusnya
(diawali dengan huruf kapital) dan nama penunjuk spesiesnya. Misalnya, dari
gambar di samping,Panthera pardus, Nama Panthera merupakan nama genus
atau marga sedangkan pardus merupakan nama species.
Berikut penjelasan singkat mengenai 3 spesies sampel yang kelompok kami
temukan. Ketiga spesies sampel kami antara lain adalah E. coli, Staphylococcus
epidermis dan Proteus mirabilis.
1.

E.coli
Escherichia coli, atau biasa disingkat E.
coli, adalah salah satu jenis spesies utama
bakteri gram negatif. Pada umumnya,
bakteri yang ditemukan oleh Theodor
Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat
menyebabkan

masalah

kesehatan

pada

manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli

banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai
vektor

untuk

menyisipkan

gen-gen

tertentu

yang

diinginkan

untuk

dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah

dalam penanganannya.
2.

Staphylococcus epidermis

Staphylococcus epidermis merupakan bakteri non-motil, jenis coccus grampositive cocci, dan berbeda dengan Staphylococcus aureus, bakteri ini tidak
memiliki enzim koagulase. Bakteri ini merupakan bakteri yang patogen dan
aktif dalam aliran darah melalui luka, jarum dll. Infeksi dari bakter in berakibat
pembengkakan pada daerah yang terinfeksi.
3.Proteus mirabilis
Proteus mirabilis merpakan bakteri gram negative dan bakteri fakultatif
anaerob. Bakteri ini memiliki kemampuan motalitas dan aktivitas urease.
P.mirabilis menyebabkan 90% infeksi yang disebabkan oleh jenis Proteus.
P.mirabilis dapat menggunakan urea dan citrate untuk produksi energi.
Bakteri ini dapat memproduksi gas hydrogen sulfide dan membentuk zona
bening pada media. P.mirabilis ini motil, memiliki peritrichous flagella yang
diketahui sebagai penyebab pergerakan. Bakteri ini pada umumnya ditemukan
pada intestinal manusia. P.mirabilis tidak pathogen pada guinea pigs atau ayam.
Uji uji biokimia pada P.mirabilis adalah sebagai berikut :
*Indole negative dan reduksi nitrat positif (tidak ada gas yang diproduksi)
*Metyl red positif dan Voges-Proskauer negatif
*Catalase positif and Cytochrome Oxidase negatif
Untuk mengidentifikasi spesies suatu bakteri, praktikan perlu melakukan
serangkaian uji yang berurutan sesuai dengan hasil percobaan yang telah ada.
Berikut adalah penjelasan berbagai uji yang harus dilakukan dalam
mengidentifikasi spesies sampel :
1.Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah suatu metode yang digunakan untuk membedakan

mikroorganisme berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme.
Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis reagen yaitu : crystal gentian
violet (Gram I), iodine (Gram II), alkohol 95% (GramIII), dan saphranin
(Gram IV). Dengan menggunakan metode pewarnaan gram, bakteri dapat
digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu : bakteri gram (+) yang akan
berwarna biru-ungu dan bakteri gram (-) yang berwarna merah.

Staphylcuococs (+)

E. coli (-)

Beberapa fungsi reagen dalam pewarnaan gram yang menentukan spesies

sampel termasuk dalam gram (+) atau gram (-) adalah sebagai berikut:

Pemberian kristal fiolet berfungsi untuk mewarnai semua sel. (baik

gram negatif maupun positif)

Iodin berfungsi sebagai mordan. Di dalam sitoplasma iodin

membentuk komplek dengan kristal fiolet. Pembentukan kompleks

mengakibatkan sel berwarna biru tua.

Pemberian alkohol memiliki 2 fungsi:

Pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi
sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet
tidak dapat keluar dari sitoplasma.
Pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan
lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci
keluar dan sel menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi sebagai couter staining. Safranin akan

memberi warna pada gram negatif sehingga gram positif dan negatif akan
terlihat berbeda secara jelas di bawah mikroskop.
Dari hasil pewarnaan gram, selain dapat membedakan mikroorganisme
berdasarkan susunan & struktur dinding sel mikroorganisme, praktikan juga
dapat mengidentifikasi morfologi dari bakteri tersebut. Berikut gambar
tentang berbagai bentuk morfologi dari bakteri sebagai berikut :

2.Uji Biokimia
Biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui metabolisme dan
reaksi yang dijalankan oleh suatu mikroorganisme. Jenis jenis uji biokimia
untuk mengidentifikasi spesies antara lain :
a.Reaksi Litmus Milk
Media yang digunakan

: litmus broth

Komposisi Media

: - Litmus

Lama inkubasi

(0,5 gr)

- Skim milk powder

(100 gr)

- Sodium sulfite

(0,5 gr)

: 24 48 jam pada 370C

Penyusun susu terbesar yang digunakan sebagai dasar uji biokimia dalam
media litmus milk adalah laktosa, protein susu yaitu kasein, lacto-albumin
dan lactoglobulin.Untuk melihat adanya perubahan metabolisme yang
diproduksi dalam medium, digunakan pH indicator yaitu oxidase-reduction

indicator litmus. Indicator ini akan menyatu dalam medium. Saat ini,litmus
milk merupakan medium yang baik untuk mikroorganisme yang dapat
mencerna substrat milk, tergantung dari komplemen enzimatik bakteri
tersebut. Beberapa perubahan biokimia dalam litmus milk :

Fermentasi Laktosa

Organisme mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon untuk

produksi energi, dengan menggunakan induksi enzim -galactosidase.
Degradasi laktosa dirumuskan sebagai berikut:

Adanya asam laktat dapat dengan mudah dideteksi karena litmus

bewarna ungu pada pH netral dan berubah menjadi merah muda ketika
medium menjadi asam yaitu pada pH sekitar 4.

Adanya gas

Produk akhir pada fermentasi laktosa adalah CO2

+ H2

Adanya gas

ini mungkin dapat dilihat sebagai pemisahan curd atau pembelahan

dalam curd sebagai akibat adanya gas yang naik ke permukaan.

Reduksi Litmus

Fermentasi adalah proses anaerobic yang meliputi biooksidasi yang

terjadi karena tidak ada molekul oksigen. Oksidasi ini mungkin akan
terlihat

sebagai

perpindahan

hydrogen

(dehydrogenation)

dari

substrat.Karena ion hidrogen tidak dapat dalam bentuk bebas/melayanglayang,hydrogen memerlukan akseptor elektron yang dapat mengikat ion
hydrogen jika hal tersebut tidak terjadi maka reaksi reduksi-oksidasi
tidak akan berjalan dan produksi energy tidak dapat dihasilkan. Pada tes
litmus milk, litmus berperan sebagai akseptor. Saat berada dalam
kondisi oksidasi, litmus berwarna ungu; ketika litmus menerima

hydrogen dari substrat, litmus akan tereduksi dan berubah menjadi putih
atau warna putih susu. Oksidasi laktosa ini memproduksi asam laktat,
asam butirat, gas CO2 dan gas H2.
Lactose

Glucose

Pyruvic acid

-Lactic acid
-Butyric acid
-CO2 + h2

Gas hydrogen dikenal sebagai hydrogen litmus acceptor, yang

menyebabkan perubahan menjadi putih dan menandakan bahwa laktosa
tereduksi.

Terbentuknya Curd

Aktivitas biokimia dari mikroorganisme yang berbeda ditumbuhkan

pada litmus milk menghasilkan produksi 2 tipe curd (clots) yang
berbeda. Curd yang terbentuk bergantung pada mekanisme biokimia
yang membentuk curd tersebut Ada 2 jenis curd yang mungkin
terbentuk yaitu :
-Acid curd
Asam laktat atau asam organic lain menyebabkan pengendapan milk
protein casein sebagai calcium caseinate menjadi bentuk gumpalan
yang tidak larut.
-Rennet curd
Beberapa organisme menghasilkan rennin, enzim yang berperan
mengubah casein menjadi bentuk paracasein, selain itu adanya calcium
ion diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan
yang tidak larut. Tidak seperti acid curd, curd jenis ini berupa gumpalan
semisolid yang lembut. Gumpalan ini akan mengalir perlahan saat
tabung dimiringkan.

Proteolysis (Peptonization)

Ketidakmampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan energi

melalui jalur fermentasi laktosa menandakan bahwa mikroorganisme
tersebut harus menggunakan sumber nutrisi lainnya sebagai protein
untuk menghasilkan energi. Dengan menggunakan enzim proteolitik,

organisme menghidrolisis milk protein, terutama casein, menjadi bentuk

dasarnya yaitu asam amino. Proses pencernaan protein disertai dengan
perubahan sejumlah besar ammonia yang dihasilkan dalam medium
dengan alkaline pH. Litmus berubah warna menjadi lapisan ungu yang
berada di atas/ permukaan dari tabung. reaksi sedangkan bagian
bawahnya kehilangan strukturnya dan membentuk cairan kecoklatan

Reaksi Alkaline

Reaksi alkaline dibuktikan ketika warna pada medium tidak berubah

atau berubah menjadi biru. Reaksi ini mengindikasikan partial
degradation dari casein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek,
dengan disertai pelepasan produk akhir alkaline yang menyebabkan
perubahan warna.
Beberapa kemungkinan hasil yang diperoleh dari uji Litmus Milk :

Keterangan gambar :A. Acid/Reduction/Curd

B. Reduction/Curd (arrow denotes gas pocket)
C. Uninoculated Control
D. Acid Formation
E. Proteolysis of casein
F. Alkaline Reaction
b.Fermentasi Karbohidrat
Media yang digunakan

: phenol red lactose, fructose, glucose,

mannitol broth

Komposisi Media

: - Casein peptone

(10 gr)

-Lactose/fructose/glucose/mannitol

Lama inkubasi

(5 gr)

- Sodium chloride

(5 gr)

- Phenol red

(0,018 gr)

: 24 - 48 jam pada 370C

Kebanyakan organisme memperoleh energi melalui suatu urutan reaksi

enzimatis tertentu dan terintegrasi,yang mengarah pada biooksidasi substrat,
seringkali karbohidrat. Organisme menggunakan karbohidrat secara
berbeda, tergantung pada komplemen enzimnya. Beberapa organisme
mampu memfermentasikan gula seperti glukosa secara anaerob, sedangkan
yang lain dengan aerob. Anaerob fakultatif mampu melakukan keduanya
sedangkan beberapa organisme justru tidak mampu mengoksidasi glukosa
secara anareob maupun aerob.
Pada fermentasi, substrat-substrat seperti karbohidrat dan alkohol
mengalami disimilasi secara anaerob dan menghasilkan asam organik
(sebagi contoh : laktat, format, atau asam asetat) yang disertai adanya gas
seperti hydrogen atau karbondioksida. Fermentasi digambarkan dengan baik
lewat degradasi glukosa melalui jalur Embden-Meyerhof, yang dikenal
dengan jalur glikolisis. Satu mol glukosa dikonversi menjadi dua mol asam
piruvat, yang mana merupakan senyawa intermediet utama yang dihasilkan
dari degradasi glukosa. Hasil metabolisme asam piruvat lebih lanjut tidak
sama untuk semua organisme, dan variasi produk akhir menunjukkan
kemampuan fermentasi mereka yang berbeda. Degradasi fermentasi secara
anaerob mengambil tube broth fermentasi yang mengandung tabung
Durham, yang berguna untuk mendeteksi gas yang dihasilkan. Medium
fermentasi karbohidrat mengandung :
-Nutrient broth untuk pertumbuhan semua organisme
-Karbohidrat spesifik yang berfungsi sebagai substrat untuk determinasi
kemampuan fermentasi organisme-organisme.
-pH indicator phenol red, yang merah pada pH netral (7) dan
kuning bila sedikit asam (pH 6,8).

menjadi

Inkubasi dilakukan dalam waktu 48 jam. Inkubasi yang berlebih dapat

menutupi reaksi produksi asam oleh produksi alkali yang disebabkan
kegiatan enzimatik pada substrat, selain karbohidrat.
Setelah inkubasi, karbohidrat yang telah difermentasi dengan hasil
sampingan asam akan menyebabkan phenol red menjadi kuning, yang
mengindikasikan reaksi positif. Pada beberapa kasus, produksi asam disertai
produksi gas (CO2) yang terlihat sebagai gelembung pada tabung Durham.
Kultur yang tidak mampu memfermentasi substrat karbohidrat tidak akan
merubah warna indicator, dan tabung tetap warna merah, serta tidak ada gas
pada tabung Durham. Ini merupakan reaksi negatif.
Kekurangan fermentasi karbohidrat oleh beberapa organisme tidak dapat
diartikan sebagai ketiadaan pertumbuhan. Organisme menggunakan nutrien
lain dalam medium sebagai sumber energi. Di antara nutrien tersebut adalah
pepton yang ada pada nutrient broth. Pepton dapat didegradasi oleh enzim
mikrobial menjadi asam amino yang secara enzimatis dikonversi menjadi
asam ketoamino lewat deaminasi oksidatif. Asam ketoamino tersebut lalu
dimetabolisme lewat siklus Krebs untuk menghasilkan energi. Reaksi
tersebut membebaskan ammonia hidroksida (NH4OH) dan menghasilkan
lingkungan alkalin, yang menimbulkan warna merah tua.
c.Produksi H2S
Media yang digunakan

: SIM agar deep tubes

Komposisi Media

: - Bacteriological agar

dua

- Ferric ammonium sulfate

(0,2 gr)

- Casein peptone

(20 gr)

- Meat peptone

(6,1 gr)

- Sodium thiosulfate

(0,2 gr)

: 24 48 jam pada 370C

Lama inkubasi
Terdapat

(3,5 gr)

jalur

fermentasi

utama

yang

mana

mikroorganisme mampu memproduksi hydrogen sulfide (H2S) :

beberapa

Jalur I : gas H2S dapat diproduksi oleh reduksi (hidrogenasi) sulfur

organic yang ada di asam amino sistein, yang mana merupakan

komponen peptone yang terdapat pada medium. Pepton tersebut
didegradasi oleh enzim microbial menjadi asam amino, meliputi sistein.
Asam amino ini dengan keberadaan sistein desulfurase, kehilangan atom
sulfur dan direduksi dengan penambahan hydrogen dari air untuk
membentuk H2S.

Jalur II : gas H2S dapat dihasilkan dari reduksi senyawa sulfur

anorganik seperti thiosulfat (S2O32-), sulfat (SO42-), atau sulfit (SO32-).

Medium yang mengandung sodium thiosulfat, dengan mikroorganisme
tertentu dapat direduksi menjadi sulfite dengan pembebasan H2S. Atom
sulfur bertindak sebagai akseptor hydrogen selama oksidasi senyawa
anorganik seperti ditunjukkan sebagai berikut :

Pada percobaan digunakan SIM medium yang mengandung peptone dan

sodium thiosulfat sebagai substrat sulfur, ferro sulfat (FeSO4) sebagai
indicator H2S, dan Agar untuk membuat medium menjadi semisolid dan
mendorong respirasi anaerob. Ferrous ammonium sulfat gas, membentuk
endapan tak larut ferrous sulfide berwarna hitam yang dapat dilihat di
sepanjang tusukan inokulasi, yang mengindikasikan terbentuknya H2S.
Ketiadaaan endapan menunjukkan reaksi negative. SIM agar juga dapat
digunakan untuk mendeteksi motilitas organisme. Motilitas disadari saat

pertumbuhan kultur dari organisme berflagellata tidak sesuai dengan garis

inokulasi. Pertumbuhan organisme nonmotil sesuai dengan garis inokulasi
ditunjukkan sebagai berikut :

d.Reduksi Nitrat
Media yang digunakan

:Nutrient Agar

Kompisisi Media

: - Peptone from casein

Reagen yang diperlukan

(10 gr)

- Meat extract

(3 gr)

- Agar

(12 gr)

:Solution A (asam sulfanilat),Solution B (naphthylamine) dan bubuk Zn.

Lama inkubasi

:24 48 jam pada 370C

Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme aerobik dan fakultatif

anaerobik terjadi dengan adanya molekul oksigen yaitu proses anaerobik.
Pada respirasi organisme anaerobic merupakan proses oksidatif karena itu

sel menggunakan substrat inorganic seperti nitrat (NO3- ) atau sulfat (SO42-)
untuk suplai oksigen yang kemudian menjadi akseptor hydrogen akhir selam
pembentukan energi. Perubahan nitrat menjadi nitrit dapat dilihat dari reaksi
di bawah ini:
Nitrat
-

NO3 + 2H + 2e
Nitrat

Reduktase

NO2- +

H2O

Nitrit

Hydrogen
electron

Air

Beberapa organisme mempunyai kapasitas enzimatik untuk mengurangi

jumlah nitrit menjadi ammonia (NH3+) atau molekul nitrogen (N2).
NO2-

NH3+

Nitrit

Ammonia

2NO3- + 12H+ + 10e-

N2 + 6H2O

Nitrat

Gas Nitrogen

Reduksi nitrat dapat diterangkan dengan mengkultivasi organisme dalam

medium nitrat broth. Pada dasarnya,medium mengandung nutrient broth
bersupplemen 0,1% kalium nitrat (KNO3) sebagai substrat nitrat. Dapat
ditambahkan agar medium menjadi semisolid yaitu dengan penambahan
0,1% agar. Kondisi agar yang semisolid akan menyebabkan difusi oksigen
ke dalam medium menjadi sedikit sehingga bakteri anaerob akan melakukan
reduksi nitrat
Setelah kultur diinkubasi, kemampuan organisme untuk mengurangi nitrat
atau nitrit dapat dibuktikan dengan penambahan 2 reagen: Larutan A yaitu
asam sulfanilat, diikuti dengan pemberian Larutan B yaitu -naphthylamine.
Adanya proses reduksi dengan penambahan Larutan A dan B akan
menghasilkan warna cherry red.
Nitrat
NO3-

Reduktase

NO2-

Kultur yang tidak memproduksi perubahan warna seperti yang tertera di

atas memiliki 2 kemungkinan :
*Nitrat tidak direduksi oleh organisme, atau
*Organisme mempunyai semacam potensi enzim nitrate reductase yaitu
nitrat secara cepat direduksi melalui nitrit menjadi ammonia atau bahkan
menjadi molekul nitrogen.
Untuk membuktikan ada tidaknya nitrat yang direduksi melalui
terbetuknya nitrite,bubuk besi ditambahkan sedikit ke kultur yang telah
diberi Larutan A dan B. Besi mereduksi nitrat menjadi nitrit. Bila ada
perubahan menjadi warna merah maka membuktikan nitrat tidak direduksi
menjadi nitrit oleh organisme. Jika nitrat tidak direduksi, reaksi reduksi
nitrat dikatakan negatif. Bila setelah penambahan besi tidak ada perubahan
warna, mak nitrat pada medium direduksi melalui nitrit menjadi ammonia
dan gas nitrogen. Ini adalah reaksi yang positif.

e.Produksi Indol
Media yang digunakan

: SIM agar deep tubes

Kompisisi Media

: - Bacteriological agar

(3,5 gr)

- Ferric ammonium sulfate (0,2 gr)

- Casein peptone

(20 gr)

- Meat peptone

(6,1 gr)

- Sodium thiosulfate

(0,2 gr)

Reagen yang diperlukan

: Kovacs reagent

Lama inkubasi

: 24 48 jam pada 370C

Triptofan adalah asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi

melalui beberapa aktifitas enzimatik bakteri. Konfersi triptofan menjadi
produk metabolit dilakukan oleh enzim triptofanase. Reaksinya sebagai
berikut :

Kemampuan hidolisis triptofan dan produksi indol bukan karakteristik

mikroorganisme dan oleh sebab itu dapat berfungsi sebagai penanda
biokimia.
Dalam uji ini digunakan agar SIM (Sulphite Indole Motility) yang
mengandung substrat trytophan. Keberadaan indol dideteksi dengan
menambahkan reagen Kovac yang menyebabkan lapisan reagen yang ada di
atas agar deep menjadi berwarna merah ceri. Indol diekstrak dari medium
ke lapisan reagen oleh komponen butyl alcohol yang diasamkan dengan
asam

klorida

(HCl)

dan

membentuk

kompleks

dengan

p-

dimetilaminobenzaldehid yang menghasilkan warna merah ceri. Kultur yang

menghasilkan lapisan reagen yang berwarna merah ceri setelah ditambah
dengan reagen Kovac mengindikasikan indol positif. Ketidakhadiran warna
merah ceri mengindikasikan bahwa substrat tryptophan tidak terhidrolisis
dan mengindikasikan reaksi indol negative.
f.Tes metil merah (MR)
Media yang digunakan

: MR-VP broth

Komposisi media

: - Peptone mixture

Reagen yang diperlukan

(7 gr)

- Potassium phosphate

(5 gr)

- Dextrose

(5 gr)

: Metyl red indicator

Lama inkubasi

: 24 48 jam pada 370C

Glukosa heksosa adalah substrat utama yang dioksidasi oleh seluruh

organisme enteric untuk produksi energi. Produk akhir dari reaksi ini dapat
bervariasi tergantung reaksi enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Pada
uji ini indicator methyl red mendeteksi keberadaan konsentrasi asam yang
besar pada hasil akhir dengan media MRVP Agar. Meskipun semua
mikroorganisme enteric memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam
organik, uji ini berguna dalam pemisahan E.coli dan E.aerogenes.
Kedua organisme ini menghasilkan produk akhir asam organik selama
masa inkubasi awal. Derajat keasaman yang rendah (pH = 4) distabilisasi
dan diatur oleh E.coli pada akhir masa inkubasi. Selama inkubasi
selanjutnya, E.aerogenes secara enzimatik mengubah asam ini ke hasil akhir
yang tidak asam seperti 2,3-butanadiol dan acetoin (asetilmetil-karbinol)
yang menghasilkan pH sekitar 6. Reaksinya sebagi berikut:
Glukosa + H2O

Asam laktat
Asam Asetat
Asam format

+ CO2 + H2 (pH 4.0)

Uji + ditunjukkan dengan warna

media yang menjadi merah.
Indikator metal red pada pH sekitar 4 akan berwarna merah yang
mengindikasikan bahwa hasil uji positif. Pada pH sekitar 6 masih tetap
mengindikasikan keberadaan asam tapi pada konsentrasi ion hydrogen yang
lebih rendah. Indikator berubah warna jadi kuning dan mengindikasikan
hasil uji yang negatif. Produksi dan deteksi produk akhir non asam dari
fermentasi glukosa E. areogenes diperkuat dengan uji Voges-Proskauer.
g.Tes Voges-Proskauer
Media yang digunakan

: MR-VP broth

Komposisi media

: - Peptone mixture
- Potassium phosphate

(7 gr)
(5 gr)

CH3
C
CH

CH3

OH
O

C
OH

40% KOH

Oksidasi

CH3

NH2

+ C

NH-R
(5 gr)

CH3
- Dextrose

Reagen yang diperlukan

Asetilmetilkarbinol -naftol
Lama inkubasi

Kompleks
berwarna
Pink

NH

: Barritts reagent A dan B

Diasetil
Guanidin
0
: 24 48 jam pada 37 C

Uji Voges-Proskauer
menentukan
Reaksi Asetilmetilkarbinol
dengan reagen
Barrit kemampuan beberapa organisme untuk
memproduksi produk akhir non asam atau netral seperti asetilmetil -karbinol
yang berasal dari metabolisme glukosa. Reagen yang digunakan dalam uji
ini adalah reagen Barrit yang mengandung campuran -naphthol alkoholik
dan larutan 40% potassium hydroxide (KOH). Deteksi acetylmethylcarbinol
membutuhkan hasil akhir ini untuk dioksidasi menjadi senyawa diasetil.
Reaksi ini terjadi pada keberadaan katalis -naphthol dan grup guanidine
yang ada pada peptone pada medium MRVP. Sebagai hasil, kompleks pink
terbentuk, sebagai warna mawar pada medium. Keberadaan warna mawar
tua pada kultur setelah penambahan reagen Barritt mengindikasikan
keberadaan acetylmethylcarbinol dan merupakan hasil positif, dan bila tidak
ada berarti hasilnya negatif.
CH3
OH
C O
CH

OH

CH3
C

40% KOH
C

Oksidasi

+ C

NH

CH3

NH-R

Diasetil

Guanidin

CH3
Asetilmetilkarbinol -naftol

NH2

Reaksi Asetilmetilkarbinol dengan reagen Barrit

h.Penggunaan Sitrat
Media yang digunakan

: Simmons citrate agar slant

Komposisi media

: - ammonium dihydrogen phosphate (1 gr)

- dipotassium hydrogen phospate (1 gr)
- sodium chloride

(5 gr)

- sodium citrate

(2 gr)

- magnesium sulfate

(0,2 gr)

Kompleks
berwarna
Pink

- bromthymol blue

(0,08 gr)

- bacterological agar

(15 gr)

: 24 48 jam pada 370C

Lama inkubasi

Pada ketiadaan glukosa atau laktosa yang dapat difermentasi, beberapa

mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk produksi
energi mereka. Kemampuan ini tergantung pada keberadaan enzim sitrat
permease yang memfasilitasi transport sitrat dalam sel. Sitrat merupakan
senyawa intermediet utama dalam sel dan diproduksi dengan kondensasi
asetil aktif dengan asam oksalaasetat. Sitrat, dengan keberadaan enzim
sitrase, menghasilkan asam oksalaasetat dan asetat. Produk tersebut
kemudian

secara

enzimatis

diubah

menjadi

asam

piruvat

dan

karbondioksida. Selama reaksi, medium menjadi alkalin-karbondioksida

yang dihasilkan berkombinasi dengan sodium dan air membentuk sodium
carbonate, sebuah produk alkalin. Kehadiran sodium carbonate mengubah
indicator bromthymol biru pada medium dari hijau menjadi biru tua Prussia.
Sitrat positif ditunjukkan pertumbuhan pada permukaan slant yang diikuti
warna biru, sedangkan negatif bila tanpa pertumbuhan dan medium tetap
berwarna hijau.
1.

COOH
CH2
HO C

COOH

CH2
COOH
C
itrate

2.

COOH
Citras
C O
e
+
CH2
COOH
COOH
Oxaloaseti
c acid

CH3
COOH

Acetic acid

COOH
C

CO2

CH3
COOH
Pyruvic
acid

Excess
carbon
dioxide

CO2 + 2Na+ + H2O Na2CO3 Alkaline pH perubahan warna dari hijau

ke menjadi biru

i.Aktifitas urease
Media yang digunakan

: Urea broth

Komposisi media

: - dipotassium phosphate
- phenol red

(9,5 gr)
(0,1 gr)

- monopotassium phosphate (9,1 gr)

Lama inkubasi

- urea

(20 gr)

- yeast extract

(0,1 gr)

: 24 48 jam pada 370C

Urease yang diproduksi oleh beberapa mikroorganisme merupakan enzim

yang secara khusus membantu mengidentifikasi Proteus vulgaris. Walaupun
organisme lain mungkin menghasilkan urease, peran mereka pada substrat
lebih lambat jika dibandingkan dengan spesies Proteus. Oleh karena itu, tes
ini dapat dengan cepat membedakan anggota dari genus ini dari
mikroorganisme lain yang tidak memfermentasi laktosa.
Urease adalah enzim hydrolitik yang menyerang ikatan nitrogen n karbon
pada komponen amida misalnya urea dan membentuk alkaline yang produk
akhirnya adalah ammonia .
Adanya urease dapat dideteksi ketika organisme ditumbuhkan dalam urea
broth medium yang mengandung pH indicator phenol red. Ketika substrat
urea dipisahkan dari produknya,adanya ammonia membuat lingkungan
alkaline yang menyebabkan phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini
menunjukkan reaksi positif terhadap adanya urease. Kegagalan perubahan
warna menjadi deep pink membuktikan reaksi negatif.

j.Aktivitas katalase
Media yang digunakan

:Nutrient Agar

Kompisisi Media

Lama inkubasi

: - Peptone from casein

(10 gr)

- Meat extract

(3 gr)

- Agar

(12 gr)

: 24 48 jam pada 370C

Selama respirasi aerobik, mikroorganisme memproduksi hydrogen

peroksida dan dalam beberapa kasus, secara ekstrem menghasilkan toxic
superoxide. Diperkirakan substansi ini akan dihasilkan dari organisme yang
mati jika tidak mereka dapat didegradasi secara enzimatik. Substansi ini
diproduksi ketika bakteri aerob, facultative anaerob, dan mikroaerophile
menggunakan jalur respirasi aerobic,di mana oksigen merupakan akseptor
electron terakhir, selama proses degradasi karbohidrat untuk produksi
energi. Organisme yang mampu memproduksi katalase secara cepat
mendegradasi hydrogen peroksida berdasarkan reaksi berikut :
2H2O2

2H2O

O2 (g)

Air
Hidrogen
Peroksida

Oksigen
bebas

Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi toxic

superoxide secara khusus menggunakan enzim superoxide dismutase; hasil
akhir dari superoxide dismutase adalah H2O2, tetapi H2O2 kurang berbahaya
bagi sel bakteri jika dibandingkan dengan superoksida.
Ketidakmampuan strict anaerob untuk mensintesis katalase, peroxidase,
atau superoxide dismutase mungkin menjelaskan mengapa oksigen menjadi
beracun untuk mikroorganisme. Bila enzim enzim di atas tidak ada maka
menyebabkan konsentrasi zat toksik dari H2O2 tidak dapat didegradasi ketika
organisme tersebut ditumbuhkan disertai adanya oksigen.
Produksi katalase dapat ditentukan dengan penambahan substrat H2O2
pada tryticase soy agar slant culture yang telah diinkubasi. Jika ada katalase,
seperti yang telah disebutkan pada reaksi kimia diindikasikan oleh
gelembung dari gas oksigen yang terbebas. Hal ini menunjukkan tes

katalase positif; sedangkan tidak terbentuknya gelembung adalah tes

katalase negative.
l.Uji Bile Esculin
Media yang digunakan

: Bile esculin agar

Lama inkubasi

: 24 48 jam pada 370C

Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group

D streptococcus menunjukkan atau -hemolysis pada blood agar plates.
Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin
menjadi

penyebab

infeksi

pada

urine.

Selain

itu,

ada

golongan

nonenterococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia

menggunakan laser. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten
dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.
Bile esculin test : Dengan adanya bile, Group D streptococci menghidrolisis
glycoside esculin menjadi 6,7-dihydroxy-coumarin yang bereaksi dengan iron
salt yang terkandung dalam medium. Hal ini menyebabkan timbulnya warna
cokelat hitam pada medium setelah diinkubasi. Bila tidak terdapat warna
hitam tidak mengidentifikasi organisme Group D streptococci.
m.Uji 6.5% sodium chloride broth
Media yang digunakan

: 6,5% NaCl Broth

Komposisi media

: brain heart infusion broth

NaCl 6,5%
: 24 48 jam pada 370C

Lama inkubasi

Media ini digunakan untuk mengidentifikasi group D streptococcus. Group

D streptococcus menunjukkan atau -hemolysis pada blood agar plates.
Group ini meliputi enterococcus seperti Enterococcus faecalis, yang mungkin
menjadi

penyebab

infeksi

pada

urine.

Selain

itu,

ada

golongan

nonenterococci seperti S. Bovis, yang digunakan dalam pengobatan manusia

menggunakan laser. Enterococcus memiliki kemampuan antibiotik resisten

dan yang lebih jarang sebagai vancomycin.
6.5% sodium chloride broth : Group D enterococci dapat diidentifikasi
dengan kemampuannya tumbuh pada medium ini jika dibandingkan dengan
non enterococci.
n.Aktivitas hemolytic
Media yang digunakan

: blood agar base

Komposisi media

: - proteose peptone

Lama inkubasi

(15 gr)

- liver digest

(2,5 gr)

- yeast extract

(5 gr)

- NaCl

(5 gr)

- Agar

(12 gr)

- Darah steril

(5%)

: 24 48 jam pada 370C

Aktivitas hemolytic ini adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi

adanya streptococci. Dari hasil penelitian, ada 3 tipe reaksi hemolytic pada
blood agar yaitu:
- ( ) Alpha-hemolysis merupakan bentuk hemolisis yang tidak sempurna.
Ditandai dengan adanya zona berwarna hijau di sekitar koloni. -hemolytic
streptococci, Streptococcus viridans merupakan bakteri yang tidak patogen.
Sedangkan yang lain, memiliki kemampuan untuk menyebabkan infeksi
pada manusia seperti subacute endocarditis dan gagal jantung.
- ( ) Beta-hemolysis merupakan penghancuran sel darah merah dengan
sempurna. Ditandai dengan terbentuknya zona bening sekitar 2 - 4 kali
diameter koloni. Streptococcus mampu memproduksi -hemolysins dan
bersimbiosis dengan bakteri patogen.
- ( ) Gamma-hemolysis diindikasikan dengan tidak adanya hemolysis di
sekitar koloni. Sebagian besar, -hemolytic streptococci bersifat avirulent.

o. Uji Bile Solubility

Media yang digunakan

: Bile solubility

Reagen yang digunakan

: Na-deoksikolat

Lama inkubasi

: 24 48 jam pada 370C

Adanya surface-active agents seperti bile dan bile salts (sodium

desoxycholate atau sodium dodecyl sulfate), menyebabkan dinding sel
pneumococcus mengalami lisis. Selain -hemolytic streptococci tidak akan
mengalami lisis oleh agen tadi dan tidak larut dalam bile. Setelah
diinkubasi, biakan yang larut dalam bile akan tampak jernih sedangkan yang
tidak larut dalam bile akan tampak keruh.
p. Uji Pigmen
Media yang digunakan

: Nutrient Agar

Kompisisi Media

: - Peptone from casein

Lama inkubasi

(10 gr)

- Meat extract

(3 gr)

- Agar

(12 gr)

: 24 48 jam pada 370C

Pada uji pigmen ini,apabila pada medium nutrient agar tidak terlihat warna
selain warna koloni, maka hal itu menandakan bahwa uji pigmen negatif.
Sedangan bila ditemukan warna yang lain berarti menandakan bahwa uji
pigment positif.
Selain dilakukan pewarnaan gram dan uji uji biokimia, ada juga yang
membutuhkan pewarnaan spora untuk mengidentifikasi lebih lajut. Berikut
adalah penjelasan tentang pewarnaan spora.
Pewarnaan spora
Peralatan yang diperlukan

: Bunsen, hotplate, staining tray, inoculating

loop, glass slides, bibulous paper, lens paper
dan mikroskop

Reagen yang dibutuhkan

: Malachite green dan safranin

Lama inkubasi untuk biakan : 48 - 72 jam pada media agar slant

Endospora

merupakan

struktur yang bersifat resisten,

dorman, dan berfungsi untuk
melindungi

bakteri

dari

lingkungan

yang

tidak

menguntungkan. Struktur ini

tidak dapat diwarnai dengan
metode pewarnan sederhana
maupun gram. Metode yang umum digunakan adalah Scaeffer-Fulton
endospore stain. Metode ini menggunakan malakit hijau sebagai pewarna
primer (primer stain) dan safranin sebagai caounterstain.Gambar tentang
berbagai bentuk spora sebagai berikut :
A: oval, terminal
B: rectangular, terminal
C: rectangular, subterminal
D: rectangular, central
E: circular, terminal
F: circular, central
G: inflated spore

Pedoman yang digunakan oleh praktikan dalam mengidentifikasi spesies

suatu sampel adalah pohon filogenik. Hal ini disebabkan masing- masing

spesies

memiliki

jalur

yang

berbeda

pengidentifikasiannya.Berikut skema pohon filogenik :

dalam

proses

Penjelasan tentang pohon filogenik sebagai berikut :

Setelah praktikan dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dan morfologi bakteri, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :
1a.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci
Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Micrococcus
spp, Staphylococcus spp dan Streptococcus spp. Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji
katalase.
1b.Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli
Beberapa

bakteri

yang

mungkin

terdapat

dalam

sampel

adalah

Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp.Untuk mengetahui lebih detail

tentang spesies sampel kita, maka dilakukan pewarnaan spora.
1c.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci

Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Branhamella

spp, Moraxella spp, dan Neisseria spp.Untuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji glukosa.
1d.Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli
Beberapa bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel adalah Citrobacter
spp, Enterobacter spp., Escherichia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., dan
Pseudomonas spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel
kita, maka dilakukan uji biokimia yaitu uji laktosa.
Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya cocci
Uji Katalase
2a. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Micrococcus spp. dan Staphylococcus spp. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji
mannitol.
2b. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Streptococcus spp.. Untuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji bile esculin.
Uji Mannittol
3a. Bila uji Mannitol menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Staphylococcus aureus.
3b. Bila uji Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah S. Saprophyticus, S.epidermis, M.luteus,
M.varians. Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Pigment.
Uji Bile Esculin
3c. Bila uji Bile Esculin menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah E. Faecalis dan S.bovis. Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji pada 6.5% NaCl
Broth.

3d. Bila uji Bile Esculin menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah S.pneumoniae, S.mitis dan S.pyogenes. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji
Hemolysis.
Uji Pigment
4a. Bila uji Pigment menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah M.luteus dan M. varians. Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa.
4b. Bila uji Pigment menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah S. Saprophyticus dan S.epidermis. Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi
Fruktosa.
Uji pada 6.5% NaCl Broth
4c. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah E. Faecalis.
4d. Bila uji pada 6.5% NaCl Broth menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S.bovis.
Uji Hemolysis
4e. Bila uji Hemolysis menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah alpha hemolysis yaitu S.pneumoniae dan S.mitis.
Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan
Uji Bile Solubility.
4f. Bila uji Hemolysis menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah S.pyogenes.
Uji Fermentasi Glukosa
5a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah M. varians.
5b.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah M. luteus.
Uji Fermentasi Fruktosa

5c. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah S. epidermis.
5d.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah S. saprophyticus.
Uji Bile Solubility
5e. Bila uji Bile Solubility menunjukkan positif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S.pneumoniae.
5b.Bila uji Bile Solubility menunjukkan negatif maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah S. mitis.
Bakteri Gram positif dan bentuk morfologinya Bacilli
2a Bila terdapat spora dalam sampel, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Bacillus spp.. Untuk mengetahui lebih detail tentang
spesies sampel kita, maka dilakukan uji mannitol.
2b. Bila tidak ditemukan adanya spora, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Corynebacterium spp. dan Lactobacillus spp. Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan uji
katalase.
Uji mannitol
3a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah B. Megaterium dan B.subtilis. Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Voges-Proskauer.
3b. Bila uji mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah B. cercus.
Uji katalase
3c. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Corynebacterium spp. Untuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat.

3d. Bila uji katalase menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah Lactobaciillus spp. Untuk mengetahui lebih detail
tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Fermentasi Glukosa.
.

Uji Voges-Proskauer

4a. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah B.subtilis.
4b. Bila uji mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah B. Megaterium.
Uji Reduksi Nitrat
4c. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah C. xerosis.
4d. Bila uji katalase menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang ada
dalam sampel adalah C. Kutscheri.
Uji Fermentasi Glukosa
4e. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif (terbentuk asam dan gas),
maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L.fermentum.
4f. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif (hanya terbentuk asam),
maka kemungkinan bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei dan L.
delbrueckii Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Fermentasi Mannitol.
Uji Fermentasi Mannitol.
5a. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah L. casei
5b. Bila uji Fermentasi Mannitol menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah L. delbrueckii.
Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya cocci
Uji Fermentasi Glukosa

2a. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan

bakteri yang ada dalam sampel adalah Neisseria spp .Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi Nitrat .
2b. Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Branhamella spp dan Moraxella
spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Reduksi Nitrat.
Uji Reduksi Nitrat
3a. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah N. mucosa .
3b. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah N.sicca .
3c. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah B.catarrhalis
3d. Bila uji Reduksi Nitrat menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah M. bovis
Bakteri Gram negatif dan bentuk morfologinya Bacilli
Uji Fermenatasi Laktosa
2a. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Citrobacter spp, Enterobacter spp.,
Escherichia spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang
spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi Indole .
2b. Bila uji Fermentasi Laktosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp., dan Pseudomonas
spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka
dilakukan Uji Fermentasi Glukosa
Uji Produksi Indole
3a. Bila uji produksi indol menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius dan E. coli.Untuk mengetahui

lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Penggunaan
Citrate .
3b.Bila uji produksi indol menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah C. freundii, Enterobacter spp., Escherichia
spp. dan Klebsiella spp.Untuk mengetahui lebih detail tentang spesies
sampel kita, maka dilakukan Uji Metyl Red .
Uji Fermentasi Glukosa
3c.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Proteus spp.Untuk mengetahui lebih
detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi Indole.
3d.Bila uji Fermentasi Glukosa menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah Pseudomonas spp.Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Reduksi
Nitrate.
Uji Penggunaan Citrate
4a. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan positif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah C. Intermedius
4b. Bila uji Penggunaan Citrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan
bakteri yang ada dalam sampel adalah E. coli.
Uji Metyl Red
4c. Bila uji Metyl Red menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah C. freundii dan K.ozaenae..Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi H2S.
(I)
4d. Bila uji Metyl Red menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah E. Aerogenes dan K. Pneumoniae.Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji
aktivitas urease. ( I )
Uji Produksi Indole

4e. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris dan P.rettgeri.Untuk mengetahui
lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji Produksi H2S.
( II )
4f. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis dan P. inconstans.Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji
aktivitas urease . ( II )
Uji Reduksi Nitrate
4g.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P.aeruginosa dan P.fluorescens.Untuk
mengetahui lebih detail tentang spesies sampel kita, maka dilakukan Uji
Litmus Milk.
4h.Bila uji Reduksi Nitrate menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P.mallei.
Uji Produksi H2S( I )
5a. Bila uji Produksi H2S menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah C. freundii
5b. Bila uji Produksi H2S menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah K.ozaenae..
Uji aktivitas urease( I )
5c. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah K. Pneumoniae.
5d. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah E. Aerogenes.
Uji Produksi H2S( II )
5e. Bila uji Produksi Indole menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. vulgaris.
5f. Bila uji Produksi Indole menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P.rettgeri.

Uji aktivitas urease( II )

5g. Bila uji aktivitas urease menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. mirabilis.
5h. Bila uji aktivitas urease menunjukkan negatif, maka kemungkinan bakteri
yang ada dalam sampel adalah P. inconstans.
Uji Litmus Milk
5i.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah P.aeruginosa yang mengalami peptonization
5j.Bila uji Litmus Milk menunjukkan positif, maka kemungkinan bakteri yang
ada dalam sampel adalah P.fluorescens yang mengalami reaksi alkaline.

III. Alat dan Bahan :

1.Alat :
- Tabung
- Cawan petri
- Objek glass
- Jarum ose
- Erlemeyer
- Beker glass
- Pipet
- Hotplate stirrer
- Lampu spiritus

2.Bahan :
- Sampel bakteri (Sampel 1, 2, 3)
- Crystal violet (Gram I)

- Phenol Red Lactose Broth

- Phenol Red Dextrose Broth

- Safranin (Gram IV)

- Phenol Red Sucrose Broth

- Etanol 95% (Gram III)

- Medium SIM Agar

- Grams iodine (Gram II)

- MRVP Broth

- Barrit A dan Barrit B

- Simmons Citrate Agar

- Reagen kovacs

- Urea Broth

- H2O2 3%

- Starch Agar

- Medium TSA

- Nutrien Gelatin Broth

- Medium Litmus Milk

- Nitrate Broth

IV. Cara Kerja :

1.Pewarnaan Gram:
a.Menetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa

tetes

larutan karbolgentian violet (Gram I), membiarkan selama 3 menit. Membilas

dengan air.
b.Menetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes.
Membiarkan selama 1 menit.
c. Membilas dengan air.
d. Mencuci dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara
memiringkan preparat kemudian menetesi perlahan- lahan dengan Gram
III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.
e. Membilas preparat secara hati-hati dnegan air

f.

Menetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes.

Mendiamkan selama 3 menit.

g. Membilas preparat dengan air. Kemudian mengeringkan di udara atau

dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue.
h. Mengamati preparat di mikroskop dan mencatat hasilnya.
2. Pembuatan Media untuk Stock Culture(Peremajaan)
TSA slant (40 gr/L)
-Menimbang TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquades
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave.
-Memiringkan tabung agar terbentuk media slant
3.Pembuatan Media untuk Uji Biokimia
a.Litmus Milk (100 gr/L)
Cara pembuatan media :
-Menimbang litmus milk kemudian melarutkannya ke dalam aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave.
Langkah inokulasi ke media :
1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Litmus Milk Broth
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut.
3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C.
b.Phenol Red Lactose Broth (20 gr/L)
-Menimbang phenol red lactose broth kemudian melarutkannya ke dalam
aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave.
c.Phenol Red Fructose Broth (20 gr/L)
-Menimbang phenol red fructose broth kemudian melarutkannya ke dalam
aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave.
d.Phenol Red Glucose Broth (20 gr/L)
-Menimbang phenol red glucose broth kemudian melarutkannya ke dalam
aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave
e.Phenol Red Mannitol Broth (20 gr/L)
-Menimbang phenol red mannitol broth kemudian melarutkannya ke dalam
aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave
Langkah inokulasi ke media fermentasi :
1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi media dengan berbagai macam
karbohidrat : phenol red lactose broth, phenol red sucrose broth, dan phenol
red dextrose broth.
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media media pada bagian 1.
3.Menginkubasi selama 24 - 48 jam pada suhu 370C.
e.SIM Agar Deep Tube (30 gr/L)
-Menimbang SIM medium kemudian melarutkannya ke dalam aquadest

-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer

-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave.
Langkah inokulasi pada media :
1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi SIM agar deep tubes
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media SIM dengan menusukkan ke dalam agar.
3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C.
4.Untuk tes produksi Indol ditambahkan reagen Kovac 3-5 tetes pada medium
yang telah diinkubasi.
f.Simmon Citrate Agar Slant (22,5 gr/L)
-Menimbang SCA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung kemudian
diautoclave.
-Memiringkan tabung agar terbentuk media slant
Langkah inokulasi pada media :
1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Simmons citrate agar slants
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.
3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C
g.Urea Broth (38,5 gr/L)
-Menimbang urea broth kemudian melarutkannya ke dalam aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer
-Mensterilkan campuran dengan memfiltrasinya
-Memasukkan campuran ke dalam masing-masing tabung
Langkah inokulasi pada media :
1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Urea Broth
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut.

3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C

h.Tryptycase Soy Agar (TSA) Plate (40 gr/L)
-Menimbang medium TSA kemudian melarutkannya ke dalam aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave
-Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya
memadat.
Langkah inokulasi pada medium :
1.Menyiapkan plate berisi TSA
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada media
tersebut dengan men-strict medium
3.Menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C
i.Nutrient Agar
-Menimbang Nutrient Agar kemudian melarutkannya ke dalam aquadest
-Menghomogenasikan campuran dengan hotplate stirer kemudian diautoclave
-Memasukkan campuran ke dalam cawan petri steril dan membiarkannya
memadat.
Langkah inokulasi pada medium :
1.Menyiapkan tabung reaksi yang berisi Nutrient Agar slant
2.Mengambil 1 ose biakan bakteri sampel secara aseptis, menanam pada
media tersebut dengan cara menggores zig-zag pada bagian yang miring.
3.Menginkubasi selama 24 48 jam pada suhu 370C
4.Untuk membuktikan adanya aktivitas katalase ditambahkan reagen H2O2 3%
pada medium yang tlah diinkubasi.

V.

Hasil Percobaan :
1.Pewarnaan gram
1a.Pewarnaan gram E.coli

1b.Pewarnaan gram Staphylococcus epidermis

1c.Pewarnaan gram Proteus mirabilis

2.Uji Biokimia
2.Uji Biokimia
2a.Uji Biokimia E.coli
-Uji Laktosa

-Uji Indol

-Uji Citrat

b.Uji Biokimia Staphylococcus epidermis

-Uji Katalase

-Uji Mannitol

-Uji Pigment

-Uji Fruktosa

c.Uji Biokimia Proteus mirabilis

-Uji Laktosa

-Uji Glukosa

-Uji Indole

-Uji Urea

3. Tabel Hasil Percobaan

3a. Tabel Hasil Percobaan E.coli
Macam Uji
Pewarnaan Gram
Morfologi
Fermentasi Laktosa
Produksi Indol (SIM medium)
Penggunaan sitrat

Hasil Uji
negative
coccobacill
+
+
-

3b. Tabel Hasil Percobaan Staphylococcus epidermis

Macam Uji
Pewarnaan Gram
Morfologi
Aktivitas katalase
Fermentasi mannnitol
Pigment
Fermentasi Fruktosa

Hasil Uji
positif
coccus
+
+

3c. Tabel Hasil Percobaan Proteus mirabilis

Macam Uji
Pewarnaan Gram
Morfologi
Fermentasi laktosa
Fermentasi glukosa
Produksi Indol (SIM medium)

Hasil Uji
negative
bacill
+
-

Aktivitas Urease

VI.Pembahasan
1.Sampel A
1a.Pewarnaan Gram & Morfologi
Hasil uji morfologi pada sampel A menunjukkan bahwa bakteri pada
sampel A termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk
coccobacill. Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan
pewarnaan gram. Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri

ini lebih sedikit sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan
luntur bersama dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram
III (alkohol) sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang
merupakan pewarna tandingan. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan
morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel A merupakan bakteri gram
negatif dan bentuknya coccobacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus
dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.
1b.Uji Fermentasi Laktosa
Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa
broth.Pada uji ini, bakteri sampel A tidak dapat memfermentasi laktosa. Hasil
uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah
menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh
karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon
filogenik adalah uji Produksi Indol.
1c.Uji Produksi Indol
Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan
penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium. Pada uji ini,
bakteri sampel A menunjukkan hasil positif yaitu terbetuk cincin pink setelah
penambahan reagen Kovac. Hal ini berarti bakteri sampel A memiliki enzim
triptofanase untuk memecah triptofan sesuai dengan reaksi berikut :

.
Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan
pohon filogenik adalah uji penggunaan citrat.
1d.Uji Penggunaan Citrat
Uji penggunaan sitrat menggunakan medium Simmons Citrate Agar yang
mengandung sitrat sebagai satu satunya sumber karbon. Pada uji ini, bakteri
sampel A menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak berubahnya
warna medium dari hijau menjadi biru. Hal ini berarti bakteri sampel A tidak
memiliki enzim citrase untuk mengubah sitrat menjadi oksaloasetat dan asam
asetat yang selanjutnya akan dirubah menjadi asam piruvat dan CO2 . Oleh
karena itu, dapat disimpulkan berdasrkan pohon filogenik bahwa bakteri
sampel A adalah E.coli.
2.Sampel B
2a.Pewarnaan Gram & Morfologi
Hasil uji morfologi pada sampel B menunjukkan bahwa bakteri pada sampel
B termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif dengan bentuk coccus.

Bakteri tersebut berwarna biru-ungu setelah diwarnai dengan pewarnaan gram.

Hal ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini cukup tebal
sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya tidak bisa luntur ketika
dicuci dengan gram III (alkohol) sehingga yang tersisa adalah warna biru-ungu
oleh reagen kristal-violet. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan
morfologi dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel B merupakan bakteri gram
positif dan bentuknya coccus sehingga untuk uji berikutnya yang harus
dilakukan sesuai dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas katalase.
2b.Uji Aktivitas Katalase
Uji aktifitas katalase dilakukan dengan menggunakan medium TSA dan
selanjutnya dilakukan penambahan reagen berupa H2O2 3%. Bakteri sampel B
menunjukkan hasil positif pada uji ini yang artinya bakteri sampel B memiliki
enzim katalase. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya gelembung
gelembung gas pada permukaan koloni ketika ditetesi dengan H2O2 3%. Hal ini
berarti bakteri sampel B dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan
karbondioksida sesuai reaksi berikut
Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan
pohon filogenik adalah uji fermentasi mannitol.
2c.Uji Fermentasi Mannitol
Uji Fermentasi Mannitol ini dilakukan pada medium phenol red mannitol
broth.Pada uji ini, bakteri sampel B tidak dapat memfermentasi mannitol. Hasil
uji negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah
menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh
karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon
filogenik adalah uji pigment.
2d.Uji Pigment

Uji Pigment ini dilakukan pada medium nutrient agar.Pada uji ini, bakteri
sampel B tidak menampakkan warna yang lain selain warna koloni yaitu putih
mengkilap. Hal itu berarti hasil uji pigment adalah negatif.Oleh karena itu,
untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik
adalah uji fermentasi fruktosa
2e.Uji Fermentasi Fruktosa
Uji Fermentasi Fruktosa ini dilakukan pada medium phenol red fructosa
broth. Pada uji ini, bakteri sampel B dapat memfermentasi fruktosa sehingga
hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan
berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya
produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas.Oleh karena
itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa bakteri sampel B
adalah Staphylococcus epidermis.
3.Sampel C
3a.Pewarnaan Gram & Morfologi
Hasil uji morfologi pada sampel C menunjukkan bahwa bakteri pada sampel
C termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif dengan bentuk bacill.
Bakteri tersebut berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarnaan gram. Hal
ini disebabkan oleh, lapisan lipopolisakarida pada bakteri ini lebih sedikit
sehingga pewarna gram I yang ada pada dinding selnya akan luntur bersama
dengan lapisan lipopolisakaridanya ketika dicucci dengan gram III (alkohol)
sehingga yang tersisa hanya warna merah dari safranin yang merupakan
pewarna tandingan. Oleh karena itu, dari hasil pewarnaan gram dan morfologi
dapat disimpulkan bahwa bakteri sampel C merupakan bakteri gram negatif dan
bentuknya bacill sehingga untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai
dengan pohon filogenik adalah uji fermentasi laktosa.
3b.Uji Fermentasi Laktosa

Uji Fermentasi Laktosa ini dilakukan pada medium phenol red lactosa broth.
Pada uji ini, bakteri sampel C tidak dapat memfermentasi laktosa. Hasil uji
negatif ini ditunjukkan oleh warna media yang tetap merah (tidak berubah
menjadi kuning) dan tidak ada gas di dalam tabung durham terbalik. Oleh
karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon
filogenik adalah uji fermentasi glukosa.
3c.Uji Fermentasi Glukosa
Uji Fermentasi Glukosa ini dilakukan pada medium phenol red glukosa
broth. Pada uji ini, bakteri sampel C dapat memfermentasi glukkosa sehingga
hasilnya positif. Hasil uji positif pada fermentasi laktosa ditandai dengan
berubahnya warna medium menjadi kuning yang disebabkan oleh adanya
produk akhir fermentasi yang bersifat asam, dan juga adanya gas. Oleh karena
itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai dengan pohon filogenik
adalah uji Produksi Indol.
3d.Uji Produksi Indol
Uji Produksi Indol ini dilakukan pada medium SIM dengan bantuan
penambahan reagen Kovac akan terlihat cincin pink pada medium, bila hasilnya
positif. Akan tetapi, pada bakteri sampel C tidak menunjukkan terbentuknya
cicncin pink setelah penambahan reagen Kovac sehingga hasilnya negatif.Hal
ini berarti bakteri sampel A tidak memiliki enzim triptofanase untuk memecah
triptofan. Oleh karena itu, untuk uji berikutnya yang harus dilakukan sesuai
dengan pohon filogenik adalah uji aktivitas urease.
3e.Uji aktivitas urease.
Uji aktivitas urease. ini dilakukan pada medium urea broth yang
mengandung pH indicator phenol red. Pada uji ini, bakteri sampel C berubah
warna menjad deep pink yang menandakan bahwa uji aktivitas urease
positif.Hal ini menandakan bahwa

Ketika substrat urea dipisahkan dari

produknya,adanya ammonia membuat lingkungan alkaline yang menyebabkan

phenol red berubah menjadi deep pink. Hal ini menunjukkan reaksi positif
terhadap adanya urease. Kegagalan perubahan warna menjadi deep pink
membuktikan reaksi negatif. Reaksinya sebagai berikut :

Oleh karena itu, dapat disimpulkan berdasarkan pohon filogenik bahwa

bakteri sampel C adalah Proteus mirabilis.
VII.

Kesimpulan :
Dalam melakukan identifikasi spesies dilakukan uji morfologi dan uji
biokimia. Selain itu, yang menjadi pedoman utama dalam pengidentifkasian
spesies adalah penggunaan pohon filogenik. Hal in disebabkan karena masing
masing spesies memiliki jalur yang berbeda baik dalam pewarnaan
gram/morfologi atau metabolismenya. Oleh karena itu,sampel kami berurutan
dari adalah Escherichia coli, Staphylococcus epidermis dan Proteus mirabilis.

VIII. Daftar Pustaka

Tortora, Gerard J, Berdell R. Funke, Christine L.Case, Microbiology-An
Introduction, Benjamin Cummings, San Francisco, 2001.
Cappuccino, James G, Natalie Sherman, Microbiology A Laboratory
Manual, seventh edition, Benjamin Cummings, San Francisco, 2005.
http://www.siue.edu/~cbwilso/250cho.htm
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab9.html