PEMULIAAN TANAMAN

SECARA IN VITRO
Tujuan Instruksional Khusus:
Setelah mengikuti kuliah ini mahasiswa dapat
mengetahui dan melaksanakan kegiatan
pemuliaan tanaman secara in vitro

Permasalahan peningkatan produksi pertanian

adanya kendala:
Lahan marginal [tanah ultisol (PMK), tanah
gambut, tanah salin dan lahan pasang surut]
Iklim [kekeringan dan suhu tinggi]
Gulma
Hama & penyakit
perlu jenis tanaman unggul utk kendala tersebut

Pertanian Berkelanjutan dan mengkonsepsi Lingkungan

Tanaman dgn masukan yg rendah tetapi dengan
hasil yg tinggi (low input with high output)
Tanaman yg dikehendaki:
1. Dapat memfiksasi N dari udara
2. Efisien dalam penyerapan dan penggunaan hara
3. Dapat mempertahankan diri terhadap hama &
penyakit
4. Efisien dlm fotosintesis dan penggunaan air

Pemuliaan Tanaman
1. Secara konvensional
usaha perbaikan
kualitas dan kuantitas tan melalui teknik
pemuliaan di lapangan & rumah kaca
2. Non konvensional atau secara modren
melalui kultur in vitro

Program pemuliaan di Indonesia ditujukan pada:

a. Resistensi atau toleransi
b. Daya dan kualitas
c. Efisiensi
4

Keuntungan pemuliaan melalui kultur in vitro:

a. kemungkinan melakukan seleksi pada tingkat
sel (kultur sel dan kultur protoplasma)
b. mempercepat diperolehnya tanaman homozigot
(kultur anther)
c. kemungkinan melakukan hibridisasi jarak jauh
pada tanaman yang secara seksual
inkompatibel (fusi protoplasma).
d. kemungkinan menambahkan atau
memodifikasikan gen khusus
e. kemungkinan memperbaiki sifat dari tanaman
yg steril atau sukar menghasilkan bunga (kultur
sel, kultur protoplasma)
5

Keberhasilan pemuliaan in vitro

dapat menghasilkan
tanaman dewasa yang telah mengalami perubahan genetik
pada kultur in vivo
Kegagalan dapat terjadi:
- sewaktu pemindahan (dari heterotrop menjadi autotrop)
- tumbuh tidak semestinya karena keadaan lingkungan in
vivo yg tak terkendali
membutuhkan serangkaian penelitian yg
berkesinambungan

Metode pemuliaan tanaman in vitro:

Penyelamatan embryo
Kultur haploid
Seleksi mutan/somaklonal (sel atau protoplas)
Fusi protoplas
Koleksi plasma nutfah
Transformasi genetik/klon DNA/rekayasan
genetik

Penyelamatan embryo

Silangan jarak jauh utk mendptkan resistensi thdp penyakit,

hama, kekeringan, suhu tinggi/rendah, toleran garam atau
Al tinggi dari tetua donor yg berasal dari tetua liar.
Silangan2 F1 berharga (silangan berbeda jauh)
embrionya gugur dan tidak terbentuk biji utk seleksi
berikutnya (sifat inkompatibelitas) seksual

Inkompatibilitas

menyebabkan ketidaksempurnaan
pembentukan endosperm

Contoh: - antar spesies Arachis hipogea X Arachis glabrata

- antar genera Hardeum spp X Secale spp

Kultur haploid
Utk mendapatkan tanaman haploid secara in vitro, dpt dilakukan
melalui:
1. Kultur anther
Keuntungan : teknik isolasi lebih mudah
Kerugian
: ada kemungkinan tanaman berasal dr jaringan
sporofik spt dinding anther dan conective tissue
2. Kultur Polen
Keuntungan : a. Kepastian haploid yg lebih tinggi
b. Perkembangan androgenesis dpt diikuti
c. Studi transformasi & mutagenesis baik kimia dan
fisik mudah dilakukan karena polen terdiri dari
sel tunggal
Kerugian
: Keberhasilan masih rendah
3. Kultur ovule yg belum diserbuk (unpolinated ovules)
Keuntungan : Sebagai alternatif untuk spesies yg haploid, yg tdk
dpt diinduksi dari anther atau cara2 lain.
Kerugian
: Sulit mengisolasi sel telur
9

Seleksi mutan/somaklonal (sel atau protoplas)

Induksi mutasi sangat mungkin terjadi karena perbanyakan

secara vegetatif melalui kultur in vitro sebagai akibat
penggunaan bahan kimia murni atau lingkungan terkendali yg
mengalami gangguan.

Keragaman dlm perbany. in vitro akan muncul sekalipun dlm

frekuensi yg rendah.

Keragaman ini

seleksi sbg varietas baru yg menguntungkan.

c/ tahan thdp cekaman lingkungan, tahan terhadap hama &

penyakit, memp penampilan morfologis (ukuran, bentuk, warna,
tekstur maupun struktur daun bunga/batang/buah) yg menarik

10

Fusi protoplas

11

Contoh aspek tujuan pemuliaan secara in vitro

Program pemuliaan
perlu adanya koleksi plasma
nutfah & membebaskan penyakit sistemik dari
koleksi tersebut.
Pembebasan penyakit:
- Pemuliaan konvensional
kurang begitu penting
- Pemuliaan in vitro
karena menggunakan sel
somatis
keharusan

12

Pelestarian Plasma Nutfah

Secara in situ (pada habitatnya)
Secara ex situ (diluar habitat; kebun raya, kebun koleksi,
penyimpanan benih dan pelestarian in vitro)
Pelestarian in vitro
tan dgn viabilitas singkat dan
tan yg diperbanyak secara vegetatif

Keuntungan pelestarian in vitro:

Hemat dlm pemakaian ruang
Dapat menyimpan tanaman langka yg hampir punah
Untuk tanaman yg tdk menghasilkan biji
Bebas gangguan hama, penyak & gangguan alam lain.
Dapat disimpan dlm keadaan bebas penyakit
13

Pelestarian in vitro
dpt dgn cara kriopreservasi
(penyimpanan dibawah titik beku 196C) dan
pertumbuhan minimal.

Pertumbuhan minimal
menggunakan retardan
(CCC, ancymidol, SADH, paclobutrazol), suhu
rendah (8-15C untuk tanaman tropis) atau
kombinasi suhu rendah dan retardan (lebih baik)
Paclobutrazol lebih baik dr yg lain
Eksplan yg terbaik
meristem, tunas dan
embrio
14

Pembebasan Penyakit Sistemik

Kultur in vitro
hanya penyakit luar yg
dihilangkan sewaktu sterilisasi atau tidak
selalu bebas penyakit, oleh karena ada
penyakit yg tdk tampak tetapi akan muncul
ekspresinya dlm subkultur atau pertumbuhan
selanjutnya.
Penyebab penyakit dalaman
virus, viroid,
mikoplasma, ricketsia dan bbrp bakteri

15

Eliminasi tanaman bebas penyakit dpt dilakukan:

1. Termoterapi
2. Kultur meristem
3. Kombinasi 1 dan 2
4. Pembentukan tunas adventif
5. Penyambungan mikro
Pengujian bebas virus
(1) menggunakan tan indikator,
(2) serologi (LAT dan ELISA),
(3) mikroskop elektron dan NASH

16

Tanaman in vitro bebas virus dr penyakit sistemik

sumber bahan tanaman untuk keperluan penukaran
plasma nutfah, pelestarian plasma nutfah, bahan
perbanyakan dan bahan pemuliaan.
Tiga konsep pemakaian bahan bebas penyakit:
1. Konsep bibit bebas penyakit
- penyakit virus menurunkan produksi tanaman
semusim
- ekspor bunga2 segar dihambat oleh peraturan
karantina yg ketat di beberapa negara Eropa.

17

2. Konsep proteksi silang pd tan buah2an.

Tan buah2an yg berumur panjang tdk ada gunanya
menghasilkan bibit bebas virus tanpa diimunisasi
dgn strain virus yg lemah karena dilapangan akan
terjangkit lagi.
3. Konsep proteksi daerah yg belum terjangkit
penyakit tertentu.
Pemberian buah2an spt pisang pd para transmigran
sebaiknya dr bibit kultur jaringan utk menghindari
terbawanya penyakit layu dan virus ke lokasi
transmigran yg semula bebas penyakit tsb.
18

Terima kasih
19

PEMULIAAN TANAMAN
SECARA IN VITRO
Tujuan Instruksional Khusus:
Setelah mengikuti kuliah ini mahasiswa dapat
mengetahui dan melaksanakan kegiatan
pemuliaan tanaman secara in vitro

Permasalahan peningkatan produksi pertanian

adanya kendala:

Lahan marginal [tanah ultisol (PMK), tanah
gambut, tanah salin dan lahan pasang surut]

Iklim [kekeringan dan suhu tinggi]

Gulma

Hama & penyakit
perlu jenis tanaman unggul utk kendala tersebut

Pertanian Berkelanjutan dan mengkonsepsi Lingkungan

Tanaman dgn masukan yg rendah tetapi dengan
hasil yg tinggi (low input with high output)
Tanaman yg dikehendaki:
1. Dapat memfiksasi N dari udara
2. Efisien dalam penyerapan dan penggunaan hara
3. Dapat mempertahankan diri terhadap hama &
penyakit
4. Efisien dlm fotosintesis dan penggunaan air

Pemuliaan Tanaman
1. Secara konvensional usaha perbaikan
kualitas dan kuantitas tan melalui teknik
pemuliaan di lapangan & rumah kaca
2. Non konvensional atau secara modren
melalui kultur in vitro

Program pemuliaan di Indonesia ditujukan pada:

a. Resistensi atau toleransi
b. Daya dan kualitas
c. Efisiensi
4

Metode pemuliaan tanaman in vitro:

 Penyelamatan embryo
 Kultur haploid
 Seleksi mutan/somaklonal (sel atau protoplas)
 Fusi protoplas
 Koleksi plasma nutfah
 Transformasi genetik/klon DNA/rekayasan
genetik

Keuntungan pemuliaan melalui kultur in vitro:

a. kemungkinan melakukan seleksi pada tingkat
sel (kultur sel dan kultur protoplasma)
b. mempercepat diperolehnya tanaman homozigot
(kultur anther)
c. kemungkinan melakukan hibridisasi jarak jauh
pada tanaman yang secara seksual
inkompatibel (fusi protoplasma).
d. kemungkinan menambahkan atau
memodifikasikan gen khusus
e. kemungkinan memperbaiki sifat dari tanaman
yg steril atau sukar menghasilkan bunga (kultur
sel, kultur protoplasma)
6

Keberhasilan pemuliaan in vitro dapat menghasilkan

tanaman dewasa yang telah mengalami perubahan genetik
pada kultur in vivo

Kegagalan dapat terjadi:

- sewaktu pemindahan (dari heterotrop menjadi autotrop)
- tumbuh tidak semestinya karena keadaan lingkungan in
vivo yg tak terkendali
membutuhkan serangkaian penelitian yg
berkesinambungan

Penyelamatan embryo


Silangan jarak jauh utk mendptkan resistensi thdp penyakit,

hama, kekeringan, suhu tinggi/rendah, toleran garam atau
Al tinggi dari tetua donor yg berasal dari tetua liar.

Silangan2 F1 berharga (silangan berbeda jauh)

embrionya gugur dan tidak terbentuk biji utk seleksi
berikutnya (sifat inkompatibelitas) seksual

Inkompatibilitas menyebabkan ketidaksempurnaan

pembentukan endosperm

Contoh: - antar spesies Arachis hipogea X Arachis glabrata

- antar genera Hardeum spp X Secale spp

Kultur haploid
Utk mendapatkan tanaman haploid secara in vitro, dpt dilakukan
melalui:
1. Kultur anther
Keuntungan : teknik isolasi lebih mudah
Kerugian
: ada kemungkinan tanaman berasal dr jaringan
sporofik spt dinding anther dan conective tissue
2. Kultur Polen
Keuntungan : a. Kepastian haploid yg lebih tinggi
b. Perkembangan androgenesis dpt diikuti
c. Studi transformasi & mutagenesis baik kimia dan
fisik mudah dilakukan karena polen terdiri dari
sel tunggal
Kerugian
: Keberhasilan masih rendah
3. Kultur ovule yg belum diserbuk (unpolinated ovules)
Keuntungan : Sebagai alternatif untuk spesies yg haploid, yg tdk
dpt diinduksi dari anther atau cara2 lain.
Kerugian
: Sulit mengisolasi sel telur
9

Seleksi mutan/ Keragaman somaklonal

(sel atau protoplas)


Induksi mutasi sangat mungkin terjadi karena perbanyakan

secara vegetatif melalui kultur in vitro sebagai akibat
penggunaan bahan kimia murni atau lingkungan terkendali yg
mengalami gangguan.

Keragaman dlm perbany. in vitro akan muncul sekalipun dlm

frekuensi yg rendah.

Keragaman ini seleksi sbg varietas baru yg menguntungkan.

c/ tahan thdp cekaman lingkungan, tahan terhadap hama &
penyakit, memp penampilan morfologis (ukuran, bentuk, warna,
tekstur maupun struktur daun bunga/batang/buah) yg menarik

10

Fusi protoplas

11

Contoh aspek tujuan pemuliaan secara in vitro

Program pemuliaan perlu adanya koleksi plasma
nutfah & membebaskan penyakit sistemik dari
koleksi tersebut.
Pembebasan penyakit:
- Pemuliaan konvensional kurang begitu penting
- Pemuliaan in vitro karena menggunakan sel
somatis keharusan

12

Pelestarian Plasma Nutfah

Secara in situ (pada habitatnya)
 Secara ex situ (diluar habitat; kebun raya, kebun koleksi,
penyimpanan benih dan pelestarian in vitro)
Pelestarian in vitro tan dgn viabilitas singkat dan
tan yg diperbanyak secara vegetatif


Keuntungan pelestarian in vitro:

Hemat dlm pemakaian ruang

Dapat menyimpan tanaman langka yg hampir punah

Untuk tanaman yg tdk menghasilkan biji

Bebas gangguan hama, penyak & gangguan alam lain.

Dapat disimpan dlm keadaan bebas penyakit
13

Pelestarian in vitro dpt dgn cara kriopreservasi

(penyimpanan dibawah titik beku 196C) dan
pertumbuhan minimal.





Pertumbuhan minimal menggunakan retardan

(CCC, ancymidol, SADH, paclobutrazol), suhu
rendah (8-15C untuk tanaman tropis) atau
kombinasi suhu rendah dan retardan (lebih baik)
Paclobutrazol lebih baik dr yg lain
Eksplan yg terbaik meristem, tunas dan
embrio
14

Pembebasan Penyakit Sistemik

Kultur in vitro hanya penyakit luar yg
dihilangkan sewaktu sterilisasi atau tidak
selalu bebas penyakit, oleh karena ada
penyakit yg tdk tampak tetapi akan muncul
ekspresinya dlm subkultur atau pertumbuhan
selanjutnya.
Penyebab penyakit dalaman virus, viroid,
mikoplasma, ricketsia dan bbrp bakteri

15

Eliminasi tanaman bebas penyakit dpt dilakukan:

1. Termoterapi
2. Kultur meristem
3. Kombinasi 1 dan 2
4. Pembentukan tunas adventif
5. Penyambungan mikro
Pengujian bebas virus
(1) menggunakan tan indikator,
(2) serologi (LAT dan ELISA),
(3) mikroskop elektron dan NASH

16

Tanaman in vitro bebas virus dr penyakit sistemik

sumber bahan tanaman untuk keperluan penukaran
plasma nutfah, pelestarian plasma nutfah, bahan
perbanyakan dan bahan pemuliaan.

Tiga konsep pemakaian bahan bebas penyakit:

1. Konsep bibit bebas penyakit
- penyakit virus menurunkan produksi tanaman
semusim
- ekspor bunga2 segar dihambat oleh peraturan
karantina yg ketat di beberapa negara Eropa.

17

2. Konsep proteksi silang pd tan buah2an.

Tan buah2an yg berumur panjang tdk ada gunanya
menghasilkan bibit bebas virus tanpa diimunisasi
dgn strain virus yg lemah karena dilapangan akan
terjangkit lagi.
3. Konsep proteksi daerah yg belum terjangkit
penyakit tertentu.
Pemberian buah2an spt pisang pd para transmigran
sebaiknya dr bibit kultur jaringan utk menghindari
terbawanya penyakit layu dan virus ke lokasi
transmigran yg semula bebas penyakit tsb.
18

Transformasi genetik/klon DNA/rekayasan

genetik

Requirement
1. a suitable transformation method
2. a means of screening for transformants
3. an efficient regeneration system
4. genes/constructs
 Vectors
 Promoter/terminator
 reporter genes
 selectable marker genes
 genes of interest

Transformation methods
DNA must be introduced into plant cells

Indirect

- Agrobacterium tumefaciens

Direct

- Microprojectile bombardment
- Electroporation
- Polyethylene glycol (PEG)
- Glass-beads
- Silicon carbide whiskers

Method depends on plant type, cost, application

Agrobacteriummediated transformation
Transformation by the help of agrobacterium

Agrobacterium is a natural genetic engineer

i.e. it transfers some of its DNA to plants

Agrobacterium



A natural genetic engineer

2 species
A.tumefaciens (produces a
gall)
 A. rhizogenes (produces
roots)


Oncogenes (for auxin and

cytokinin synthesis) +
Opines

In the presence of
exudates (e.g.
acetosyringone) from
wounded plants, Virulence
(Vir) genes are activated
and cause the t-DNA to be
transferred to plants.
Everything between the
left and right border is
transferred.

Agrobacterium
tumefaciens


Characteristics



Plant parasite that causes Crown Gall Disease

Encodes a large (~250kbp) plasmid called Tumor-inducing (Ti)
plasmid


Portion of the Ti plasmid is transferred between bacterial

cells and plant cells  T-DNA (Tumor DNA)

T-DNA integrates stably into plant genome

Single stranded T-DNA fragment is converted to dsDNA
fragment by plant cell

Then integrated into plant genome

2 x 23bp direct repeats play an important role in the
excision and integration process

Agrobacterium
tumefaciens
Lives in intercellular spaces of the plant
Plasmid contains genes responsible for the disease
 Part of plasmid is inserted into plant DNA
 Wound = entry point  10-14 days later, tumor forms

What is naturally encoded in T-DNA?

Enzymes for auxin and cytokinin synthesis

hormone imbalance  tumor formation/undifferentiated callus

Mutants in enzymes have been characterized
Causing

Opine

synthesis genes (e.g. octopine or nopaline)

Carbon

and nitrogen source for A. tumefaciens growth

Insertion genes
Virulence (vir) genes
Allow excision and integration into plant genome

Ti plasmid of A. tumefaciens

Ti plasmid of A. tumefaciens
1. Auxin, cytokinin, opine
synthetic genes
transferred to plant
2. Plant makes all 3
compounds
3. Auxins and cytokines
cause gall formation
4. Opines provide unique
carbon/nitrogen source
only A. tumefaciens can
use!

Agrobacterium tumefaciens


How is T-DNA modified to allow genes of

interest to be inserted?


In vitro modification of Ti plasmid









T-DNA tumor causing genes are deleted and replaced with

desirable genes (under proper regulatory control)
Insertion genes are retained (vir genes)
Selectable marker gene added to track plant cells
successfully rendered transgenic [antibiotic resistance
gene  geneticin (G418) or hygromycin]
Ti plasmid is reintroduced into A. tumefaciens
A. tumefaciens is co-cultured with plant leaf disks under
hormone conditions favoring callus development
(undifferentiated)
Antibacterial agents (e.g. chloramphenicol) added to kill A.

tumefaciens




G418 or hygromycin added to kill non-transgenic plant cells

Surviving cells = transgenic plant cells

Agrobacterium and genetic engineering:

Engineering the Ti plasmid

Co-integrative and binary vectors

LB

RB

Co-integrative

Binary vector

Terima kasih
30