ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID

DALAM EKSTRAK METANOL DAUN PECUT KUDA

NURLAELA YUNI ASTUTI_066115705

Slide 2 :

Slide 3

Pembuatan Simplisia

1. Pengumpulan bahan

- Bagian tumbuhan yang dikehendaki adalah daun muda, dipetik satu persatu secara
manual.

- Bahan tumbuhan (sampel) yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun pecut
kuda yang diperoleh dari Desa Lintidu, Kecamatan Paleleh, Kabupaten Buol,
Provinsi Sulawesi Tengah sebanyak 1 kg.

2. Sortasi Basah

Dilakukan sortasi basah dengan cara membersihkan daun pecut kuda dari benda-benda
asing dari luar (tanah, batu dan sebagainya), dan memisahkan bagian tanaman yang tidak
dikehendaki.
 -

3. Pencucian

Pencucian dilakukan dengan cara daun pecut kuda dicuci dengan air bersih yang
mengalir,misalnya air sumur atau air PAM.

4. Perajangan

Daun pecut kuda dirajang kecil-kecil dengan alat mesin perajang khusus. Hal ini
untuk mempermudah proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan.

5. Pengeringan

Pengeringan pada daun pecut kuda dilakukan secara alamiah yaitu dengan cara
diangin-anginkan di udara terbuka yang terlindung dari sinar matahari langsung
selama satu malam. Hal ini untuk mendapatkan simplisia yang awet, tidak rusak dan
dapat digunakan dalam jangka relatif lama.

6. Sortasi Kering

Daun pecut kuda yang sudah diangin-anginkan di udara terbuka kemudian dilakukan
pemisahan dari benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak
diinginkan dan pengotor lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering.

7. Penggilingan dan Pengayakan

- Penggilingan dilakukan dengan cara dihaluskan dengan blender menggunakan

sedikit larutan metanol. Hal ini bertujuan meningkatkan luas permukaan bahan
sehingga memudahkan dalam proses ekstraksi bahan obat.
 - Pengayakan dilakukan setelah simplisia selesai diblender dengan menggunakan
nomor pengayak tertentu, untuk memperoleh serbuk daun pecut kuda yang benar-
benar halus.

8. Penyimpanan dan Pengepakan

Serbuk simplisia daun pecut disimpan pada kemasan terbuat dari kaca, tertutup rapat,
terlindung dari sinar matahari dan diberi silica gel (agar tahan lama) sehingga serbuk
simplisia daun pecut tidak mudah rusak dan berubah mutunya.

Slide 5

Ekstraksi

Sampel (serbuk daun pecut kuda) sebanyak 190 gr dimaserasi dengan pelarut metanol

selama 3 x 24 jam. Setiap 1 x 24 jam hasil maserasi disaring dan ditampung dalam
wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar. Kemudian ekstrak kembali
dimaserasi dengan metanol yang baru. Filtrat hasil maserasi yang diperoleh disatukan
kemudian di evaporasi menggunakan pompa vakum pada suhu30-40 0C. Diperoleh
ekstrak kental sebanyak 20,17 gr yang berwarna hijau kehitaman.

Slide 6

Skrining (Uji Pendahuluan Flavonoid)

- Ekstrak sebanyak 0,1 gr dilarutkan menggunakan 10 mL metanol. Setelah itu dibagi
kedalam 4 tabung reaksi. Tabung reaksi yang pertama sebagai kontrol, tabung reaksi
kedua, ketiga dan keempat berturut-turut ditambahkan serbuk Mg-HCl, H 2SO4 pekat,
dan NaOH pekat.

- Warna yang terbentuk dari masing-masing tabung tersebut dibandingkan dengan

kontrol. Jika terjadi perubahan warna menunjukkan adanya positif flavonoid.

- Berdasarkan hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak kental metanol daun
pecut mengandung senyawa-senyawa flavonoid. Hal ini disebabkan karena terjadinya
perubahan warna menjadi merah.

Slide 7

Isolasi Senyawa Flavonoid

1. Kromatografi Lapis Tipis

- Fase gerak berupa eluen secara bergradien berturut-turut dengan perbandingan

eluen n-heksan : etil asetat (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (5:5), (4:6), (3:7), (2:8),
dan (1:9).

- Hasil dari KLT secara bergradien dipilih eluen yang mempunyai jumlah spot/
noda terbanyak dan jarak pemisahan antar noda terpisah secara teratur, eluen
tersebut dapat digunakan untuk pemisahan kromatografi kolom.

2. Kromatografi Kolom

a. Fasa diam
 - Fasa diam berupa silika gel sebanyak 24 gr diaktifkan terlebih dahulu agar
pada proses elusi lempengan silika gel dapat menyerap dan berikatan
dengan sampel.

- Pengaktifan silika gel dilakukan dalam oven pada suhu 1100C selama 30
menit kemudian dilarutkan dengan n-heksan hingga terbentuk seperti
bubur (slurry).

- Pelarut n-heksan dimasukkan ke dalam kolom dan slurry mulai dialirkan

melalui dinding kolom secara perlahan dengan kran terbuka secara terus
menerus minimal selama 3 jam hingga silika gel menjadi padat dan diatur
sedemikian rupa untuk menghindari terjadinya patahan atau rongga udara.

- Perlakuan selanjutnya adalah 2 gr ekstrak kental metanol dilarutkan dengan

metanol hingga larut, kemudian ditambahkan silika gel sedikit demi sedikit
hingga terbentuk seperti bubur, lalu campuran tadi diaduk hingga kering dan
dimasukkan secara perlahan-lahan kedalam kolom. Setelah semua sampel
campuran tadi telah masuk kedalam kolom lalu dialirkan n-heksan secara
perlahan-lahan hingga tidak terbentuk patahan atau rongga udara

b. Fase gerak
Fase gerak yang digunakan yaitu variasi eluen bergradien secara berturut-turut
perbandingan n-heksan:etil asetat (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (5:5), (4:6), (3:7),
(2:8), dan (1:9) kemudian dilanjutkan dengan menggunakan fase gerak
bergradien kembali secara berturut turut dengan eluen etil asetat: metanol
(9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (5:5), (4:6), (3:7), (2:8), (1:9).

Slide 8

Hasil Isolasi Flavonoid

- Hasil pemisahan secara bergradien menghasilkan 157 fraksi. Fraksi-fraksi dianalisis

dengan KLT dengan memilih perwakilan warna dari masing-masing fraksi.
- Berdasarkan Gambar 1 fraksi F1-F7 merupakan gambaran senyawa yang dipisahkan
pada plat KLT, dimana semakin besar fraksinya, jarak pemisahannya semakin kecil.
Jarak pemisahan senyawa pada plat silika gel tergantung pada polaritasnya. Senyawa
yang tidak polar dan sedikit polar bergerak paling jauh dari titik awal penotolan,
sedangkan senyawa yang paling polar bergerak naik dengan jarak paling dekat dari titik
awal penotolan tersebut.

- Berdasarkan hasil KLT, Fraksi yang memiliki harga Rf yang sama digabung
(disatukan) dan didapatkan beberapa fraksi seperti pada Tabel 1 dibawah ini.

- Berdasarkan hasil KLT pada Gambar 1, dipilih fraksi F2 dimana terdapat kristal jarum
berwarna hijau yang masih kotor. Untuk memurnikan kristal tersebut direklistalisasi
menggunakan pelarut n-heksan hingga diperoleh kristal jarum berwarna kekuningan.

- Fraksi 2 digabungkan selanjutnya di KLT kembali dengan eluen yang berbeda yaitu

n-heksan : etil asetat (8:2), n-heksan : aseton (9:1) dan etil asetat : metanol (9:1). Pola
noda dari hasil KLT tersebut dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini
 - Bercak noda yang dihasilkan adalah noda tunggal yang diduga sebagai isolat murni
seperti terlihat pada Gambar 2. Adapun nilai Rf yang diperoleh dari bercak noda isolat
yaitu eluen (a) n-heksan : etil asetat (8:2), (b) n-heksan : aseton (9:1) dan (c) etil asetat :
metanol (9:1) masing-masing adalah (a) 0,20, (b) 0,325, dan (c) 0,560.

Analisis Kemurnian Isolat

- Analisis kemurnian terhadap isolat dilakukan dengan cara KLT dua dimensi dengan
menggunakan silika gel GF254 dengan variasi perbandingan fasa gerak n-heksan : etil
asetat (8:2) sebagai E1 dengan n-heksan : aseton (9:1) sebagai E 2 .

Berdasarkan hasil kromatografi lapis tipis 2 dimensi di atas, diperoleh nilai Rf

perbandingan n-heksan : etil asetat (8:2) dan n-heksan: aseton (9:1) masing-masing yaitu 0,3
dan 0,25.

Slide 9
Identifikasi Senyawa

- Identifikasi senyawa dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis dan

spektrofotometer Inframerah.

a. Spektrofotometer UV-Vis

Hasil spektrum UV-Vis pada isolat murni dapat dilihat pada Gambar 4.
- Berdasarkan Gambar 4 di atas dapat dilihat bahwa pada isolat murni dalam pelarut
metanol memberikan serapan pada panjang gelombang pita I pada panjang gelombang
348 nm dan pita II mempunyai panjang gelombang 219 nm.

- Isolat diduga adalah senyawa flavonoid yaitu ditandai dengan munculnya dua pita yang
berdasarkan literatur mendekati serapan maksimum dari senyawa flavanoid, dimana
spektrum senyawa flavanoid golongan flavon memberikan serapan panjang gelombang
maksimum utama 330-350 nm (Markham, 1988).

- Adanya serapan kuat pada daerah UV diakibatkan adanya kromoform C=C dari gugus
aromatik yang terkonjugasi sehingga kromoform (zat pembawa warna) tersebut
menyebabkan transisi n*. Transisi ini menyerap cahaya pada panjang gelombang
200-400 nm (Chreswell, dkk, 2005).

b. Spektrofometer Inframerah
- Spektrofotometer inframerah dalam penelitian digunakan untuk mengidentifikasi
gugus-gugus fungsi yang terkandung dalam isolat. Spektrum inframerah dari isolat
murni ditunjukan pada Gambar 5 di bawah ini.

Dari gambar 5 di atas data spektrum inframerah terlihat bahwa pola spektrum senyawa
yang diperoleh menunjukkan adanya beberapa gugus fungsi.
- Berdasarkan data interprestasi yang peroleh menunjukkan bahwa gugus-gugus fungsi
yang ditentukan dari hasil panjang gelombang IR merupakan gugus-gugus fungsi yang
terdapat ada senyawa flavonoid. Dengan daerah spektra yang terbaca berkisar antara
3000-500 cm-1 dan termasuk dalam IR tengah. Sehingga isolat murni yang didapatkan
pada hasil penelitian dapat diduga merupakan senyawa metabolit sekunder jenis
flavonoid, yang ditandai dengan adanya gugus fungsi OH, CH, C=O, C=C aromatik,
tekuk O -H, C-O alkohol dan C-H aromatik.

Slide 10

Kesimpulan dan Saran

Kesimpulan

1. Senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam daun pecut kuda dapat diisolasi
dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol.
2. Hasil uji fitokimia terhadap isolat menunjukkan bahwa daun pecut kuda positif
mengandung senyawa flavonoid.
3. Hasil analisis kemurnian terhadap isolat dengan KLT dua dimensi dengan eluen n-heksan
: etil asetat (8:2) sebagai E1 dan n-heksan : aseton (9:1) masing-masing yaitu 0,3 dan
0,25.
4. Identifikasi senyawa isolat hasil kromatografi kolom gravitasi menggunakan:
a. Spektroskopi UV-Vis menunjukkan bahwa isolat adalah senyawa flavonoid yang
ditandai dengan munculnya dua pita pada serapan panjang gelombang pita 1 pada
348 nm dan pita 2 219 nm;
 b. Spektroskopi Inframerah menujukkan adanya gugus fungsi O-H, C-H alifatik, C=O,
C=C aromatik, tekuk O-H, C-O alkohol dan C-H aromatik.

Saran

Berdasarkan hasil penelitian bahwa isolat daun pecut kuda menunjukkan positif terhadap
senyawa flavanoid, maka disarankan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
menentukan struktur dari isolat menggunakan metode GC-MS dan NMR.