1.

TUJUAN UMUM
Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi suatu ekstrak menggunakan kromatografi
kolom.

2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Klasifikasi Tanaman
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Sub Kingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)
Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
Kelas : Magnoliopsida (Berkeping dua / dikotil)
Sub Kelas : Rosidae
Ordo : Myrtales
Famili : Myrtaceae (suku jambu-jambuan)
Genus : Psidium
Spesies : Psidium guajava L.
Pohon jambu biji banyak ditanam sebagai pohon buah-buahan. Pohon jambu biji sering tumbuh
liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 1 m sampai 1.200 m dari permukaan laut
(Dalimartha, 2001). Batangnya berkayu, keras, kulit batang licin, berwarna coklat kehijauan.
Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan, daun muda berambut halus, permukaan
atas daun tua licin.

Helaian daun berbentuk bulat telur agak jorong, ujung tumpul, pangkal membulat, tepi
rat agak melekuk ke atas, pertulangan menyirip, panjang 6 sampai 12 cm, lebar 3 cm sampai
6 cm. Bunga tunggal, bertangkai, keluar dari ketiak daun, berkumpul 1 sampai 3 bunga,
berwarna putih. Buahnya buah buni, berbentuk bulat sampai bulat telur, berwarna hijau sampai
hijau kekuningan. Daging buah tebal, buah yang masak bertekstur lunak, berwarna putih
kekuningan atau merah jambu. Biji buah banyak mengumpul ditengah, kecil-kecil, keras,
berwarna kuning kecoklatan (Dalimartha, 2001).
2.2 Fraksinasi
Di alam senyawa kimia umumnya terdapat dalam bentuk campuran, oleh sebab itu diperlukan
pemisahan, fraksinasi adalah proses pemisahan suatu zat dari campuran zat tersebut,
pemisahan dilakukan tehnik yang bermacam macam seperti kromatografi (KKt, KLT, KCKT,
KCV, KK, KGC) dan ekstraksi cair-cair. terkadang digunakan kombinasi keduanya,
seringkali dilakukan secara berulang-ulang agar didapat fraksi zat yang lebih banyak.

Metode fraksinasi/pemisahan umumnya:

1. Ekstraksi Cair-cair
Ekstraksi cair-cair adalah metode pemisahan dengan menggunakan dua cairan pelarut yang
tidak saling bercampur, sehingga senyawa tertentu terpisahkan menurut kesesuaian sifat
dengan cairan pelarut (prinsip solve dissolve like).

2. Kromatografi
Kromatograsi adalah teknik pemisahan zat dari campuran berdasarkan perbedaan migrasi
komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh fase gerak. pemisahan ini dilakukan
berdasarkan sifat fisika-kimiaumum dari molekul seperti :
1. kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)
2. kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorbsi/penjerapan)
3. kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian)

2.3 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini

memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan berat
beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang
didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan
pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada sampel dijerap oleh fase diam yang
telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang terdapat pada kolom, namun apabila
dialirkan pelarut secara kontinyu maka akan terjadi migrasi senyawa dan senyawa tersebut
terbawa oleh pelarut sesuai dengan polaritasnya. Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat
konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam
eluen dan akan menyebabkan pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat
berlangsung dengan baik. Dan apabila kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang
baik dan tidak berdasarkan tingkat polaritasnya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan
menyebabkan fase diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkanterjadi cracking. Permukaan
adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya
cacat yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan.
Cara kerja kromatografi kolom adalah komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa
adsorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi,
terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing- masing senyawa dalam
komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses
berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan
mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi
kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan
mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut meggunakan spektroskopi.
METODE PEMISAHAN KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara
5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 m dengan keran dan pengisi (dengan
sumbat kaca atau serat kaca – untuk mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah. Dua
metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom adalah: metode kering dan metode
basah.

 Pada metode kering, kolom pertama kali diisi dengan serbuk kering fasa diam,
kemudian kolom dialiri fasa gerak hingga seluruh kolom terbasahi. Mulai titik ini,
fasa diam tidak diperkenankan mengering.
 Pada metode basah, fasa diam dibasahi dengan fasa gerak hingga
menjadi bubur di luar kolom, dan kemudian dituangkan perlahan-lahan ke dalam
kolom. Pencampuran dan penuangan harus ekstra hati-hati untuk mencegah
munculnya gelembung udara. Larutan bahan organik diletakkan di bagian atas
fasa diam menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya ditutup dengan lapisan kecil
pasir atau katun atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari
tuangan eluen. Eluen kemudian dialirkan perlahan melalui kolom sambil
membawa sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen sferis atau corong
pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas kolom.
PROSEDUR KERJA
A. Lakukan optimasi ekstrak dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan mengganti-
ganti eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan
untuk fraksinasi.
B. Siapkan kurang lebih 50 gram silica gel.
C. Siapkan eluen dari butir (a) sebanyak 300 ml
D. Silica gel dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen,
kocok selama 15 menit.
E. Campur butir (d) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas.
F. Tuangkan ke dalam kolom sampai penuh, tutup deengan aluminium foil, biarkan
semalam.
G. Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak
ditambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur denga silica gel sama
banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogeny dan kering.
H. Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel
I. Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan kedalam kolom (diatas
permukaan silica gel), lalu ditambahkan eluen kira-kira setinggi 3 cm. Eluen
dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan
eluen, sementara penetesan tetep dilakukan. Kecepatan penetesan diatur.
J. Penempungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml.
K. Dilakukan uji KLT untuk setiap kelipatan 10 vial (vial no. 1, 10, 20, 30, 40 dst). Pada
uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase gerak pada kromatografi
kolom.
L. Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diantaranya dapat digabung.
M. Bila uji KLT memberikan noda yang berbeda, maka uji KLT dilakukan pada vial
diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no 115 dilakukan uji KLT)
N. Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada uji KLT.
O. Hasil penggabungan berdasarkan kemiripan profil kromatogram, dilakukan uji KLT
P. Dokumentasikan pada sinar UV 254nm dan 365nm dan visual.
HASIL PENGAMATAN GAMBAR

Kromatografi Kolom

Penotolan Pertama (Fraksi 1)

No. Vial  1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80

Penotolan Kedua (Fraksi 2)

No. Vial  5, 15, 25, 35, 55, 65

Fraksi 1 & Fraksi 2
Penotolan 3 (Fraksi 3)

No. Vial  3, 13, 18, 28, 33, 53, 63

Penotoloan 4 (Fraksi 4)

No. Vial  2, 12, 14, 17, 29, 32, 51, 52, 62

Penotolan 5 (Hasil dari Masing-masing Fraksi)

No. Vial  (1-2), (3-10), (11-17), (18-2), (29-31), (32-50), (51-62), (63-80)
 PEMBAHASAN

Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan golongan

utama kandungan yang satu dari kandungan golongan utama yang lainnya. Fraksinasi
merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan kepolaran
tergantung dari jenis senyawa yang terkandung dalam tumbuhan.Kromatografi kolom adalah
salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian campuran dengan memakai kolom.
Sebelum melakukan percobaan kromatografi perludipastikan kondisi dari eluennya, seperti
pemilihan pelarut yang cocok. Pada pemisahan menggunakan kromatografi kolom ini,
campuran yang akan dipisahkan diletakkan dibagian atas kolom yang terlebih dahulu telah
dibuat.pelarut fase gerak dibiarkan mengalir melewati kolom, karena aliran yang disebabkan
oleh gaya berat (gravitasi) atau didorong dengn tekanan. Pita senyawa larut bergerak melalui
kolom dengan laju berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi-fraksi ketika keluar dari
kolom ( sudjadi 1986).
Pada praktikum kali ini Hal pertama yang dilakukan adalah menyiapkan 83,28 gram silica
gelbeserta eluen dengan perbandingan n-heksan dan etil asetat (4:1) dibuat sebanyak 300ml
silica geldimasukan kedalam erlenmeyer sedikit demisedikit dan ditambahkan eluen
secukupnya, kocok homogen. Kemudian dituang kedalam kolom yang telah disiapkan,
masukkan sedikit demisedikit campuran sambil dijaga eluen agar terusdialirkan menggunakan
pipet. Untuk mengalirkan silica gel yang menempel di dinding kolom saat penuangan. Fase
diam terus dituang hingga setinggi 35 cm. Selanjutnya memadatkan fase diam dengan cara
eluen ditambahkan dalam kolom hingga penuh. Tutup dengan aluminium foil dibagian atas.
Kemudian atur tetesan untuk mencegah fase diam kering (keringnya fase diam menyebabkan
cacking).

Selanjutnya fraksinasi dilakukan dengan penambahan ekstrak(10% dari bobot fase diam)
ekstrak sebelumnya telah dikeringkandengan siloca gel sama banyakeluen dialirkan terus
menerus dengan tetesan 1 tetes/detik hingga penam[ungan dapat dimulai saat fraksi yang
terpisah (dilihat dari warna fraksi yang semakin turun) sudah berada dibawah (mendekati kran
kolom). Penampungan dilakukan pada 80 vial masing-masing 5ml dengan kecepatan rata-rata4
menit untuk 1 vial. Selanjutnya hasil fraksinasi di cek pada noda menggunakan KLT.
Penambahan fraksisnasi menggukan kromatografi kolom

Pada praktikum fase diam yang digunakan adalah silica gel yang bersifat polar. Adapaun eluen
(fase gerak) yang digunakan adalah n-heksan : etil asetat (4:1) yang memiliki konstanta
dielektrik 2,716 sehingga eluen bersifat nonpolar. Pada proses eluasi terjadi migrasi senyawa
dari senyawa yang terjerap pada ekstrak dan silica gel menuju eluen menggunakan prinsip like
disolve like. Karena eluen bersifat nonpolar maka kemungkinan senyawa yang tertarik paling
awal adalah senyawa yang lebih nonpolar dibandingkan senyawa lainnya pada ekstrak.
 Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan maka dapat ditarik kesimpulan, fraksinasi
secara kromatografi kolom dari ekstrak tanaman Psidium guajava dengan eluen n-heksana :
etil asetat dengan perbandingan 4:1 menghasilkan 7 fraksi.
Pelarut yang digunakan pada kromatografi kolom harus dioptimasi terlebih dahulu dan harus
dilakukan penggantian pelarut secara bertahap, non polar-semi polar-polar agar terbentuk
fraksi yang beragam. harus dipilih pula eluen yang tepat untuk melakukan analisa pada KLT.