Prinsip pemeriksaan metode

Elisa, PCR dan

Elektroforese
Dr.Ozar SSanuddin,, Sp
SpPK(K)
K(K)
Bagian Patologi Klinik
F k lt kkedokteran
Fakultas d kt r USU/UISU
Medan
Prinsip pemeriksaan Imunologis

Umumnya berdasarkan pada interaksi

antigen(Ag) dan antibodi(Ab).
Interaksi
I t k i antigen
ti dan antibodi
d tib di tba
tb :
- Tingkat primer.
- Tingkat sekunder.
- Tingkat tertier
tertier.
 Tingkat primer

Merupakan awal reaksi ikatan

molekuler antara Ag dan Ab
Reaksi tidak terlihat dengan mata
telanjang(biasa)
Perlu indikator
indikator :
- Radioisotop
- Enzim atau
- zat warna flouresen.

Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.

Nama metode pemeriksaan
pemeriksaan, untuk
menentukan interaksi antara Ag dan
Ab disesuaikan dengan nama
indikator diatas.
Ilmu yang mempelajari tentang reaksi
Ag dan Ab serologi
 Radioisotop Radio Immuno Assay
(RIA).
Enzim Enzyme Immuno Assay
(EIA) Elisa
Fl
Flouresen Immunoflouresensi
I fl i

Metode ini untuk menentukan kadar Ag

atau Ab yyangg rendah ng
g
Tingkat sekunder

Presipitasi
Aglutinasi.
Tingkat tertier

Interaksi antara Ag dan Ab terjadi

dalam tubuh manusia/ invivo.
Teknik ELISA

Untuk menentukan kadar Ag atau Ab.

Ab
Indikator berupa enzim dilenketkan
pada Ag atau Ab.
Ab
Ada beberapa metode.
 Prinsip Metode Elisa

Bila kita mau menditeksi

Bil kit dit k i antigen(Ag):
ti (A )
Ag(serum) + AbE Ag- AbE komplek

cuci i
Inkubasi dengan substrat kromogenik
(
(semula l ttakk b
berwarna)
) berwarna,bila
b bil
dihidrolisis oleh enzim intensitas
warna yang terjadidiukur dengan
fotometer/ spektrofotometer kadar
antigen.
Prinsip Metode Elisa[Sambungan]
Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam
a tu ttt
waktu ttt.
Reaksi berhenti bila ditambahkan asam
atau
a au basa kuat.
ua
Reaksi harus berlangsung dalam
p
keaadan optimal dimana
- kadar reaktan
- temperatur
- masa inkubasi yang telah ditentukan
secara eksperimental setiap reagen
dari fabrik ber beda prosedur berbeda.
 Reaksi optimal sudah ditentukan
secara eksperimental,dengan
penetapan
- kadar reaktan
t t
- temperatur
- masa inkubasi
setiap reagen dari fabrik berbeda
prosedur
p berbeda.
Metode Elisa

Metode kompotitif
Non kompotitif [Langsung]
Indirek
I di k atau
t sandwich
d i h
 Metode kompotitif

Umumnya untuk menentukan Ag Ag.

Ab spesifik [dilekatkan pada partikel
/sumur ] dicampur bersama sama Ag *
tambahkan serum [Ag] yang akan
b
bersaing
i d dengan A Ag*untuk
* t k mengikat
ik t
Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag
Metode Elisa[sambungan]

Non kompotitif[ menentukan Ab

atau Ag
Indirek/sandwich menentukan Ab
dan Ag
tib di yang
A Ab A tiAb* antibodi
- Ag-Ab-AntiAb*
dicari
- Abs Ag Ab*Ag yang dicari
Elektroforese

Dikenalkan oleh Tiselius

Tiselius,1930
1930
berkembang menentukan protein
serum dan urin
Elektroforese merupakan teknik
pemeriksaan yang berguna untuk
pemisahan dan mengukur kadar
makromolekul (protein)
Komponen komponen
El kt f
Elektroforese
Dapar/Buffer
Media pendukung.
- Media
M di gell agarosa
- Media selulosa asetat
Power suply unit
Pewarna Protein
Densitometer
Power suply unit

Menghasilkan energi pada kedua

elektroda p
pergerakan
g dan
pemisahan molekul protein.
Tegangan dan besar arus dapat
dikendalikan.
Pewarna Protein

Panceou red
amino black
Coomassie
C blue
i bl
Densitometer

Alat pengukur kuantitas berdasarkan

intensitas warna pita pada
elektroforese, saat media pendukung
melalui sistem optik yang bekerja
seperti fotometer
Prinsip Dasar Elektroforese

Tergantung pada :
A. Muatan partikel
B.
B Kecepatan
K t migrasi.
i i
A. Muatan :
Partkel bermuatan, dalam media pendukung
nya, listrik, akan
nya bila terpapar dengan medan listrik
bergerak kearah elektroda yang berlawanan.
Molokul protein bersifat ampoter
ampoter. Bila protein
berada pada lingkungan pH dibawah titik iso
elektrisnyaprotein
y p akan bermuatan neto
positip dan sebaliknya
Pada pH isoelektrik protein tidak bermuatan
listrik atau muatannya nol
B. Kecepatan Migrasi
Migrasi.
Kecepatan migrasi protein tergantung
pada :
1.Kekuatan medan listrik.
Makin besar perbedaan muatan
neto makin cepat gerakan.
2.Ukuran molekul :
Makin kecil mol makin cepat
gerakan
3.Media pendukung :
Pori pori media bersifat filter.
4 Viscositas media
4.Viscositas
Makin tinggi viscositas makin lambat
gerakan
5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik
besarmigrasi cepat
cepat.
6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan
arah dalam media pendukung
pendukung.
7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion
rendah migrasi cepat
8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.
6.Endoosmosis:
yaitu gerakan berlawanan arah dalam
media pendukung.
p g
7.Kadar ion dalam dapar:
kadar ion rendah migrasi cepat
8.Suhu:
suhu tinggi migrasi cepat.
Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis
Dengan gel agarosa :
- Prealbumin
- Albumin
- Alfa 1 globulin
- Alfa 2 globulin
g
- Beta globulin
- Gama globulin
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
pita
it yang spesifik
ifik lletaknya
t k dan
d
digambarkan densitometer berupa kurva
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
pita yang spesifik letaknya.
Densitometer menghasilkan fraksi
protein berupa kurva
Berdasarkan Pergerakan SPE
Prealbumin
- Fraksi
F k i protein
t i yang bbermigrasi
i i paling
li
dekat ke anoda.
Albumin,
- Fraksi pprotein terbanyak.
y
- Fungsi mempertahankan tekanan
osmotik
Alfa1 globulin
Alfa 2 globulin.
Beta1globulin.
B t 1 l b li
Beta 2 globulin.
Gamma globulin migrasi terdekat ke
katoda.
Polymerase
ym Chain Reaction(PCR).
( ).

Metode yang cepat dan sederhana

sederhana,
untuk mengkopi dan memperbanyak
urutan DNA spesifik yang dinginkan
dan divisualisasikan sebagai pita yang
jelas pada agarose gel
gel.
Scara mendasar sebenarnya PCR
mengulangi siklus :
- Denaturasi
- Hibridasi dari DNA yang dinginkan
d
dengan b t
bantuan DNA primer
i
- Extensi regio DNA tsb oleh enzim
DNA polymerase.
Pada PCR konvensional
- Target amplifikasi adalah asam
nukleat harus dilakukan terlebih
dahulu sampai selesai
B
- Baru didit k i
diditeksi.
Pada PCR yang baru amplifikasi
dilakukan terhadap sinyal sedangkan
target asam nukleat tidak diamplifikasi.
Pada PCR yang baru
Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.
Target
T t asam nukleat
kl t tidak
tid k di
amplifikasi.
 Prinsip PCR
1 Ekstraksi DNA
1.
2. Alat PCR
a. Target
g DNA
b. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA
danTaq DNA polymerase
c Denaturasi DNA
c.
Initial denaturation : 5 menit,t 94 C
Denaturation : 1 menit 94 C
Primer annealing : 1 menit 50 C
Copying of DNA by DNA polymerase
fi l elongation
final l ti 10 menit it ,72
72 C

Program
g alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklus