DEFINISI

 Senyawa organik yang tidak termasuk dalam protein,

karbohidrat, lemak yang terdapat dalam jumlah kecil
dalam bahan makanan tapi sangat penting peranannya
bagi tubuh
 Senyawa organik dengan berat molekul rendah yang
dibutuhkan oleh manusia dan organisme hidup lainnya
sebagai sumber nutrisi yang diperlukan dalam jumlah
kecil untuk metabolisme normalnya.
 Manusia tidak dapat mensintesis sebagian besar vitamin
dan kebutuhan akan vitamin diperoleh dari makanan dan
suplemen.
 Kekurangan vitamin  defisiensi
Analisa Vitamin
 Informasi komposisi vitamin makanan
diperlukan untuk menentukan intake guna
mengetahui kecukupan dan perbaikan
status gizi manusia.
 Metode pengujian yang reliable (dapat
dipercaya/handal) sangat diperlukan untuk
menjamin akurasi food labeling
Yang Perlu diperhatikan
 Akurasi dan presisi
 Faktor ekonomis
 Jumlah sampel/ketersediaan sampel
 Metode yang dapat diaplikasikan
 Kondisi seperti cahaya, oksigen, pH dan
panas  supaya tidak merusak
 Homogenisasi sampel
Kestabilan Vitamin

Vitamin pH 7 pH<7 pH>7 O2 Sinar Panas %SM

Vit A S T S T T T 40
Vit C T S T T T T 100
Biotin S S S S S T 60
Karoten S T S T T T 30
Kolin S S S T S S 5
B-12 S S S T T S 10
Vit D S - T T T T 40
As.folat T T S T T T 100
Kestabilan Vitamin
Vitamin pH 7 pH<7 pH>7 O2 Sinar Panas %SM
Vit K S T T S T S 5
Niasin S S S S S S 75
As.Pant S T T S S T 50
otenat
A p-A S S S T S S 5
benzoat
B-6 S S S S T T 40
B-2 S S T T T T 75
B-1 T S T T S T 80
Vit E S S S S T T 55
keterangan
 S = stabil
T = tidak stabil
 SM = Susut akibat dimasak
Ekstraksi
 Kecuali bioassay, analisa vitamin sebagian besar
melibatkan ekstraksi untuk memisahkan vitamin dari
matriks biologisnya
 Secara umum meliputi satu atau beberapa perlakuan
seperti panas, asam, alkali, pelarut dan enzim.
 Prosedur ekstraksi spesifik untuk setiap vitamin dan
didisain untuk menstabilkan vitamin.
 Prosedur ekstraksi dapat diaplikasikan untuk beberapa
vitamin. Misalnya untuk tiamin dan riboflavin dan
beberapa vitamin larut lemak.
 Contoh
 Asam askorbat : ekstraksi dingin dengan asam
metafosforat/asam asetat
 V. B1 dan B2  pemanasan dalam asam +
perlakuan enzim
 Niasin  autoklaving dalam asam (Non cereal)
atau dalam alkali (cereal)
 Vitamin A, E dan D  Pelarut organik,
saponofikasi, dan reekstraksi dengan pelarut
organik.
 Untuk vitamin-vitamin yang tidak stabil (A, E, D),
perlu ditambahkan antioksidan untuk menghambat
oksidasi
Analisa Vitamin
 Bioassay  manusia dan hewan
 Microbiological assay  bakteri, yeast dan
jamur
 Physicochemical assay 
spektrofotometri, fluorometri, kromatografi,
enzimatis, immunologi dan radiometri
Bioassay
 Sampai saat ini baru digunakan untuk
vitamin D dan B12
 Vitamin D  Menggunakan Metode
standard dari AOAC yang dikenal
dengan Metode Line Test yang
didasarkan pada pengapuran tulang.
 Karena menggunakan pengapuran
tulang  hanya terbatas pada uji
hewan coba saja tidak pada manusia
Prosedur Bioassay Vitamin D
 Preparasi sampel  AOAC
 Periode deplesi (Penghabisan)  pemberian diet
Rachitogenic selama 18-25 hari. Tikus yang digunakan
berumur ≤30 hari dengan berat badan ≥ 44 g tetapi ≤ 60
g
 Pengujian  mulai hari terakhir deplesi sampai 8 atau
11 hari setelah deplesi. Selama pengujian, tikus
terdeplesi diberi vitamin D dengan jumlah diketahui
(standard) dan tidak diketahui (sampel)
 Jumlah vitamin dalam sampel ditentukan oleh Line Test
dari warna tulang tibia (tulang kering) proximal paling
akhir atau tulang radius atau ulna distal paling akhir.
Mikrobiological assay
 Terbatas pada vitamin yang larut air
 Sangat sensitif dan spesifik untuk tiap
vitamin
 Memakan waktu dan harus patuh pada
prosedur analisa  untuk hasil yang
akurat
 Pertumbuhan mikroba sebanding dengan
kebutuhan akan vitamin.
 Microbiological assay  menguji pertumbuhan
mikroba dalam ekstrak sampel yang
mengandung vitamin dibandingkan dengan
pertumbuhan mikroba dalam vitamin dengan
jumlah yang diketahui.
 Bakteri, yeast dan jamur digunakan sebagai
organisme uji
 Pertumbuhan diukur dengan turbiditas
(kekeruhan), produksi asam, gravimetri dan
respirasi
Niasin

 Bakteri L.plantarum
 Preparasi stok kultur  inokulasi freeze dried
culture pada agar bacto-lactobacili dan
diinkubasi pada 37 C selama 24 jam.
 Secara umum pertumbuhan diukur dengan
turbiditas, namun jika menggunakan
laktobacillus maka dapat diukur dengan
asidimeter
 Tahap analisa
 Preparasi sampel
 Timbang sampel (kira-kira mengandung 0,1 mg niasin)
dan tambahkan NH2SO4, autoklaf selama 1 jam dan
dinginkan. Atur pH sampai 6,8 dan encerkan sampai
volume (konsetrasi 0,1 g niasin/ml), campur dan saring
 Preparasi tabung pengujian
 Pengulangan sedikitnya menggunakan 0.0, 0.5, 1.0, 2.0,
3.0, 4.0 dan 5.0 ml sampel kemudian tambahkan air
sampai mencapai 5 ml. Tambahkan 5 ml Difco Basal
Medium untuk niasin ke dalam masing-masing tabung,
autoklaf selama 10 menit pada suhu 121 C dan
dinginkan
 Preparasi standar
 Sama dengan cara preparasi tabung pengujian.
 Standar  larutan yang mengandung 0,1 µl/ml Niasin
 Inokulasi dan inkubasi (37 C, 16-18 jam)
 Tambahkan 1 tetes inokulum ke masing-masing
tabung, tutup tabung dan inkubasi pada suhu 37 C
selama 16-18 jam sampai kekeruhan maksimum
pada tabung dengan konsentrasi niasin paling
tinggi.
 Pengukuran
 Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540-
660 nm
Folat
 Terdiri dari tiga komponen yang terikat
 Gugusan pteridina
 Asam para amino benzoat
 Asam glutamat
 Sedikit larut dalam air, mudah teroksidasi
dalam asam dan cahaya dan hilang ketika
pemasakan
 Karena instabil dan beragam bentuk 
menyulitkan dalam analisanya
 Untuk menghitung bioavailabilitas folat dalam
fortifikasi dan dalam makanan telah dibuat
DFE (Dietary Folate Equivalent)
 Berdasarkan hasil penelitian dilaporkan
bahwa
 Asam folat  85% bioavailable
 Folat dalam makanan  50% bioavailable
 Asam folat dalam produk fortifikasi  1,7 kali lebih
bioavailable dibanding dengan folat dalam
makanan
 µg DFE = µg food folate + (1.7x µg asam
folat).
 Perhitungan µg DFE untuk beberapa
makanan memerlukan jumlah asam folat
sebagai bagian yang terpisah dari folat
makanan.
 Saat ini, metode kromatografi cair sangat
penting untuk memastikan jumlah asam folat
dan bentuk ragam folat dalam makanan
 Baru-baru ini, kolaborasi prosedur mikrobiologi
yang berdasarkan ektraksi trienzim dapat
menghitung hanya total folat dan tidak dapat
membedakan antara folat fortifikasi dan folat
makanan.
Folat
 Prinsip :
 Folat dalam sampel diekstraksi dalam buffer pada
suhu 100 C (air mendidih).
 Hasil esktraksi didigesti dengan -amilase dan
protease (untuk membebaskan ikatan folat dengan
makromolekul) dan konjugase (untuk memecahkan
poly--glutamyl folat menjadi PteGln3 atau yang lebih
kecil).
 Pertumbuhan mikroba uji diukur dengan %
transmitan. Transmitan berpengaruh pada
konsentrasi folat.
Yang perlu diperhatikan
 Harus dilakukan upaya untuk melindungi folat
yang labil dari oksidasi dan degradasi fotokimia.
 Pengurangan senyawa-senyawa termasuk
asam askorbat, -mercaptoetanol dan ditiotreitol
adalah cara efektif dalam mencegah oksidasi.
 Patuh pada prosedur analisa adalah penting
untuk menguji folat dengan tepat.
 Preparasi sampel
 1,2-2g sampel ditambahkan 50 ml buffer,
dihomogenkan, dan didigesti (sampel tinggi lemak
harus diekstrak dengan heksan dan semua sampel
harus dihindarkan dari cahaya dan udara)
 Pemecahan trienzim
 Panaskan sampel selama 5 menit, dinginkan pada
suhu ruang, digesti sampel dengan -amilase,
protease dan cojugase. Inaktifasi enzim dengan
pemanasan selama 5 menit, dinginkan, filter dan
encerkan dengan aquades sampai konsentrasi 0,15
ng/ml
 Preparasi kurva standar dan tabung
blanko
 Buat 8 titik kurva standard dengan
menggunakan larutan folat. Tambahkan 5 ml
L.casei ke dalam masing-masing tabung.
Siapkan blanko tanpa inokulasi dan blanko
inokulasi dan dinolkan (spektrofotometer) dan
enzim blanko untuk mengetahui kontribusi
enzim dalam pertumbuhan mikroba
 Pengujian
 Asam folat diuji berdasarkan pertumbuhan
L.rhamnosus (AOAC). Tabung sampel, kurva
standard, blanko inokulasi, blanko uninokulasi
dan blangko enzim diautoklaf pada suhu 121
C selama 5 menit, kemudian diinokulasi
dengan 1 tetes inokulum L.rhamnosus per
tabung. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37 C
selama 20-24 jam, pertumbuhan mikroba
dinyatakan dalam % transmitan pada 550 nm
Kimiawi
 Vitamin A
 Vitamin E
 Vitamin C
 Vitamin B1
 Vitamin B2
Vitamin A
 Sensitif terhadap cahaya (UV), udara (beberapa
prooksidan), suhu tinggi dan kelembaban
 Perlu tahap-tahap untuk menghindari perubahan
yang merugikan seperti pengaruh dari
penggunaan barang pecah belah, nitrogen dan
vakum sebagaimana pengaruh dari suhu tinggi.
 Direkomendasikan untuk menambahkan
antioksidan di awal prosedur
 HPLC  metode yang dapat diterima dalam
pengukuran Vitamin A (karena akurat)
 Sampel disaponofikasi, vitamin A akan
terekstrak ke dalam larutan organik dan
terkonsentrasi. Semua trans-retinol dan
13-cis-retinol ditentukan dengan HPLC
dengan kolom silika.
Yang perlu diperhatikan
 Semua pekerjaan harus dilakukan
dalam cahaya dengan intesitas rendah
 Harus menjaga terjadinya oksidasi
retinol selama analisa
 Evaporasi larutan harus menyeluruh di
bawah aliran nitrogen dan heksadekan
ditambahkan untuk mencegah destruksi
selama evaporasi
Prosedur
 Preparasi Sampel
 Transfer sampel (makanan formula atau susu
cair) ke dalam tabung digesti 100 ml,
tambahkan 10 ml etanolik pirogallol (2%
pirogallol dalam 95% etanol) dan sabunkan
dengan etanolik KOH (10% KOH dalam 90%
etanol) pada suhu ruang selama 18 jam atau
pada suhu 70 C dengan menggunakan reflux
vessel.
 Ekstraksi
 Pipet 3 ml sampel yang telah terdigesti ke dalam
tabung sentrifus 15 ml dan tambahkan 2 ml air.
Ekstrak dengan 7 ml heksan-dietileter (85:15).
Ulangi ekstraksi sebanyak 2 x. Masukkan sampel
terekstrak ke dalam tabung volumetrik 25 ml.
Tambahkan 1 ml heksadekan (heksadekan (1) +
hexan (100)) dan encerkan sampai 25 ml dengan
heksan. Pipet 15 ml ekstrak yang sudah
diencerkan ke dalam tabung sentrifus dan uapkan
dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 ml
heptan
Parameter Kromatografi
 Kolom  15 cm x 4.5 mm dipadati dengan
3 mm silika (Apex m silika)
 Fase mobil  Isokratik, heptane dan
isopropanol (1-5%)
 Deteksi  UV , 340 nm
 Flow rate  1-2 ml/menit
Perhitungan
 Semua trans retinol (mg/ml) =
(At/Ast x Wt x DF)/V
Ket :
At = area puncak sampel
Ast= area puncak standar
Wt = berat sampel
V = volume sampel
DF = faktor pengenceran
Vitamin E
 Dalam bentuk 8 komponen yang berbeda dalam
makanan dan semuanya adalah 6-
hidroksikroman
 Famili vitamin E terdiri dari -,-,- dan -
tokoferol
 Cirinya  sebuah rantai cabang jenuh dari 3
unit isopren dan berikatan dengan tokotrienol
tidak jenuh.
 Tahan panas dan asam, karena bersifat
antioksidan maka Vitamin E akan mudah
teroksidasi terutama bila dalam minyak tengik,
timah dan garam besi
 Mudah rusak oleh sinar UV
Prinsip
 Untuk produk makanan umumnya  sampel
disabunkan dengan reflux, diekstrak dengan
heksan dan diinjeksi ke dalam fase normal
kolom HPLC yang disambungkan pada detektor
fluoresensi
 Untuk Margarin dan Minyak nabati  sampel
dilarutkan dalam heksan, MgSO4 ditambahkan
untuk mengganti air kemudian difilter dan diuji
dengan HPLC
 Untuk minyak  dilarutkan dalam heksan dan
diinjeksi secara langsung ke dalam kolom HPLC
Yang perlu diperhatikan
 Vitamin E adalah subyek oksidasi
 Penyabunan dilakukan dengan reflux yang
sudah ditambah antioksidan pirogallol
dengan reaksi vessel yang terlindung dari
cahaya
Prosedur
 Produk makanan umum
 Tambahkan 10 ml dari 6 % (w/v) pirogallol dalam
etanol ke sampel , campur dan aliri dengan N2.
Panaskan pada suhu 70 C selama 10 menit dengan
sonikasi. Tambahkan 2 ml 60 % KOH, campur dan
aliri dengan N2. Hancurkan selama 30 menit pada
suhu 70 C. Sonikasi selama 5 menit, dinginkan pada
suhu ruang dan tambahkan NaCl dan air. Ekstrak
dengan heksan (0,1% BHT) 3 kali. Tambahkan 0,5 g
MgSO4 dan campur. Filter dan encerkan sampai
volume dengan heksan dan injeksi 20 l.
 Margarin dan minyak nabati
 Tambahkan 40 ml heksan (0,1% BHT) ke
dalam 10 g sampel dan campur. Tambahkan
3 g MgSO4 dan campur, biarkan  2 jam.
Filter dan encerkan sampai volume dengan
heksan. Injeksi 20 l.
Parameter Kromatografi
 Kolom  Hibar RT, Lichrosorb Si60 5m,
25 cmx4.6 mm
 Fase mobil  0,9% isopropanol dalam
heksan
 Flow  1 ml/menit
 Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em =
330 nm
Vitamin C
 Berbentuk asam L-askorbat dan asam L-
dehidroaskorbat
 Mudah teroksidasi terutama oleh tingginya pH
dan adanya katalisator seperti Fe dan ion Cu.
Sehingga perlu prosedur yang didisain rendah
pH dan adanya chelating agent.
 Oksidasi ringan asam askorbat menghasilkan
asam dehidroaskorbat dan bersifat reversibel
dengan adanya perlakuan dengan reducing
agents ( -mercaptoetanol dan ditioreitol)
Vitamin C
 Metode Titrasi 2,6 dicloroindophenol
 Prinsip
 L-asam askorbat dioksidasi menjadi L-asam
dehidroaskorbat. Pada akhir titrasi akan
menunjukkan warna merah muda.
 Perhitungan :
 mg asam askorbat/ml sampel =
Standard (mg/ml) x volume titrasi sampel x
(FP/berat sampel)
Prosedur
 Preparasi sampel
 Timbang dan ekstrak sampel dalam asam
metafosforat-asam asetat (15 g HPO4 dan 40 ml
HOAc dalam 500 ml air), filter dengan sentrifus dan
encerkan sampai konsentrasi 10-100 mg asam
askorbat/100 ml.
 Preparasi standard
 Timbang 50 mg asam askorbat dan encerkan sampai
100 ml dengan asam metafosforat-asam asetat
 Titrasi
 Titrasisampel dan standard (3 ulangan) dengan
dikloroindophenol sampai berwarna merah muda
sedikitnya 10 detik
Metode Mikroflourometrik

 Prinsip
 Metode ini mengukur asam askorbat dan
asam dehidroaskorbat
 Asam askorbat dioksidasi membentuk asam
dehiroaskorbat dan direaksikan dengan o-
phenilenediamin membentuk komponen
fluoresen quinoxalin
Prosedur
 Preparasi Sampel
 Sama dengan metode titrasi, jumlahnya 100
ml untuk standard dan sampel, tambahkan 2
asam Norit, gojog dan saring
 Preparasi blanko
 Transfer 5 ml filtrate ke dalam tabung
volumetrik 100 ml yang mengandung 5 ml
H3BO3- NaOAc, biarkan selama 15 menit,
kocok. Transfer 2 ml larutan ke dalam 3
tabung
 Penentuan Sampel
 Transfer5 ml standard dan sampel ke dalam
tabung volumetrik yang mengandung 5ml dari
50% NaOAc trihidrid dan 27 ml air. Encerkan
sampai volume dengan air kemudian transfer 2 ml
standard dan sampel ke dalam tabung fluoresen
 Pembentukan Quinoxalin
 Tambahkan 2 ml dari 20 % larutan o-
fenilenediamin-aquades ke tiap tabung. Kocok
dengan vortex dan biarkan selama 35 menit pada
suhu ruang
 Pengukuran
 Ukur fluoresen pada Ex = 356 nm dan Em= 440
nm
Tiamin (B1)
 Prinsip
 Ekstraksi dan hidrolisis enzimatis dari ester-
ester tiamin fosfat dan pembersihan
 Metode ini didasarkan pada pengukuran
fluoresensi dari bentuk oksidasi tiamin
(tiokrom)
Yang Perlu diperhatikan
 Tiokrom sensitif pada cahaya  harus
mengurangi cahaya pada semua prosedur
 Tiamin sensitif panas terutama pada
suasana basa  tahap analisa dengan
cara oksidasi tiamin harus dilakukan
dengan cepat dan teliti berdasarkan
prosedur yang ada
Prosedur
 Preparasi Sampel
 Timbang sampel yang mengandung 10-20g tiamin,
tambahkan HCl, campur, autoklaf selama 15 menit
pada 121 C, atur pH sampai 4,5-5,0 dengan HCl,
 Hidrolisis Enzim
 Tambahkan larutan enzim dan inkubasi selama 3 hari
pada suhu 45-50 C, dinginkan sampel atur pH sampai
3,5, encerkan sampai volume dengan air, campur dan
saring. Larutan standard diperlakukan dengan enzim
yang sama.
 Pembersihan Ekstrak sampel
 Masukkan ekstrak sampel ke dalam kolom
ion-exchange, cuci kolom dengan air panas
kemudian larutkan tiamin dengan larutan
asam KCl panas, diinginkan. Encerkan
sampai volume dengan larutan asam-KCl,
lakukan juga pada standard .
 Pembentukan Tiokrom
 Konversitiamin ke tiokrom menggunakan
K2Fe(CN)6, tambahkan isobutil alkohol, kocok,
dan sentrifus.Tuangkan fraksi isobutil alkohol
ke dalam tabung baca fluoresen dan baca
pada 365 nm/435nm. Begitu juga standard
dan buat kurva standard untuk menghitung
tiamin sampel
Ribovlafin (B2)
 Struktur mirip gula ribosa
 Larut air dan memberi warna fluoresens
kuning kehijauan
 Mudah rusak oleh cahaya dan sinar UV
 Tahan panas, oksidator, asam namun
sensitif pada suasana basa
 Prinsip
 Ektraksi,pembersihan dan kompensasi
adanya substansi pengganggu
 Ditentukan dengan fluorometer
 Titik Kritis
 Karena sensitif pada UV maka semua
prosedur dilakukan pada ruang minim
cahaya.
 Adanya proses oksidasi permanganat perlu
diperhatikan  untuk hasil yang reliable
Prosedur
 Preparasi Sampel
 Timbang sampel homogen, tambahkan 0,1N
HCl campur kemudian autoklaf selama 30
menit pada suhu 121 C dan dinginkan.
Endapkan substansi pengganggu dengan
mengatur pH 6 dan segera diikuti pengaturan
pH 4,5, encerkan sampai volume dengan air
dan saring
 Oksidasi Materi pengganggu
 Tempatkan filtrat ke dalam 4 tabung, 2 tabung
tambahkan 1 ml air dan tambahkan 1 ml
larutan standard (0,5g/ml riboflavin) ke
dalam 2 tabung lainnya. Untuk tiap tabung
(satu persatu) Tambahkan 1 ml asam asetat
glasial, diikuti 0,5 ml KMnO4 3 % biarkan
selama 2 menit kemudian tambahkan 0,5 ml
H2O2 3%, kocok.
 Pengukuran Fluoresen
 Panjang gelombang 440 nm/565 nm
 Pertama baca ekstrak sampel yang
mengandung air kemudian tambahkan 20 mg
Na2S2O4 campur dan baca ulang, setelah itu
baca standard
Perbandingan
 Setiap metode mempunyai kelebihan dan
kelemahan.
 Perlu memperhatikan faktor-faktor berikut dalam
memilih metode
 Akurasi dan presisi metode
 Untuk keperluan apa? informasi bioavailabilitas atau
kandungan
 waktu dan alat
 Personel
 Jenis bahan yang akan dianalisa
 Jumlah sampel
 Aturan/prosedur yang diguanakan
Keuntungan dan Kelemahan
Bioassay
 Keuntungan
 Tidak butuh preparasi sampel
 Mengurangi potensi perubahan senyawa
yang tidak diinginkan selama preparasi
 Kelemahan
 Memakan waktu
 Terbatas pada hewan
 Mikrobiologis dan cara kimia 
memerlukan ekstraksi
 Cara kimia  Informasi yang diperoleh
hanya total vitamin dalam makanan tidak
sampai biovailabilitas vitamin
 Mikrobiologis terbatas pada vitamin yang
larut air dan memakan waktu tetapi
memerlukan sedikit sampel
 Cara kimia dengan HPLC lebih disukai
karena sederhana, akurat dan teliti.
 Namun yang terpenting ketika memilih
metode analisa, setidaknya metode
tersebut telah diujikan di laboratorium dan
telah dipublikasikan oleh organisasi
seperti AOAC (American of Official
Analytical Chemist)
Latihan Soal
 Berat sampel 100 g diencerkan menjadi
500 ml
 Jumlah sampel yang dititrasi : 25 ml
 Jumlah titrat yang digunakan: 9,1 ml
 Konsentrasi asam askorbat dalam titrat
0,175 mg/ml