Mikrobiologi Dasar 74

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme dapat dilihat dengan mikroskop biasa, tanpa diwarnai.
Pengamatan yang demikian (tanpa pewarnaan) lebih sulit dan tidak dapat dipakai
untuk melihat bagian – bagian sel secara seksama.Mikroorganisme yang tidak
diwarnai tampak transparan bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa.
Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat diperjelas dengan cara mewarnai
sel – sel mikroba tersebut dengan zat – zat warna (Waluyo, 2008).
Macam dan fungsi pewarnaan menurut Pelczar dan Chan (2010),
dibedakan menjadi 3 macam yaitu :
1. Pewarnaan Sederhana
Pemberian warna pada bakteri atau jazad-jazad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau
desain, yang sudah difiksasi dinamakan pewarnaan sederhana.
2. Pewarnaan Diferensial
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel
mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial.Dengan teknik ini biasanya digunakan lebih dari itu larutan zat
pewarna atau reagen pewarna.
3. Pewarnaan Gram
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling baik dan paling
luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram.
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengidentifikasikan bakteri baik
mengenai bentuknya maupun sifat-sifat morfologinya. Dengan kata lain untuk
memperlihatkan bagian-bagian sel mikroba (Dwidjoseputro,1989).
Pewarnaan gram merupakan salah satu metode pewarnaan ganda yang
digunakan sebagai dasar pengamatan dan awal dari identifikasi bakteri.
Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat
warna ke permukaan sel bakteri. Pada zat warna basah bagian yang berperan
menempelkan warna disebut klorofor bermuatan positif. Sedangkan zat warna
asam yang berperan memiliki muatan negatif.

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 75

1.2 Maksud dan Tujuan

Maksud dari pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram yaitu
pratikan dapat mengetahui cara identifikasi bakteri dengan metode pewarnaan
gram.
Tujuan dari pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram yaitu
agar pratikan dapat melakukan pewarnaan gram dengan metode yang benar dan
dapat mengidentifikasi jenis bakteri yang diamati.

1.3 Waktu dan Tempat

Pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram dilaksanakan pada
hari Jumat, 22Maret 2013 pukul 15.00-18.00 WIB, di Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya, Malang.

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 76

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian dan Tujuan Pewarnaan

Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan
zat warna kepermukaan sel bakteri.Zat warna dapat mengabsorbsi dan
membiasakan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya
ditingkatkan.Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat
warna basa, bagian yang berperan memberikan warna disebut Kromotor
bermuatan positif, zat warna asam yang berperan memiliki muatan negatif. Zat
warna basa lebih banyak digunakan karena memiliki muatan positif antara lain
Eosin, Congo Red dll. Contoh warna asam yaitu Crystal violet, methylene Blue,
Safranin, Base Fchsin, Malachite green dll (UNSEOD, 2008).
Pewarnaan adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna dan
membutuhkan empat larutan dalam prosesnya yaitu zat warna penutup, zat
warna larutan dan zat warna pelunturan warna (Sutedjo,1991).

2.2 Macam dan Fungsi Pewarnaan

Pewarnaan sederhana (pewarnaan positif) menggunakan suspense bakteri
encer, sebelumnya difiksasi agar mematikan bakteri dan membuat lekat sel
bakteri pada objek glass tanpa merusak strukturnya.Pewarnaan negatif untuk
bakteri yang sulit diwarnai sehingga sel tampak transparan dengan latar
belakang hitam Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat
berguna, dibedakan menjadi gram positif dan negatif. Pewarnaan Endospora
tujuannya untuk membedakan endospora dengan sel vegetative, sehingga
pembedaannya tampak jelas (UNSEOD,2008).
Menurut Setedjo et.al., (1980), macam-macam pewarnaan adalah
1. Pewarnaan Tunggal
2. Pewarnaan Negatif
3. Pewarnaan Tahan Gram
4. Pewarnaan Struktur Sel

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 77

Menurut Pelczaret.al., (1980), telah dikembangkan prosedur. Prosedur

pewarnaan :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi organisme secara kasar.
2. Mengidentifikasi bagian-bagian sruktur sel mikroorganisme.
3. Membantu mengidentifikasi dan atau membedakan organisme yang
serupa.

2.3 Perbedaan Gram Positif dan Negatif, beserta contohnya

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel tipis.
Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapis
membrane sel. Contohnya bakteri gram positif yaitu Bacillus subtilis dan gram
negative Contohnya :Eschenchia Coli (UNSOED,2008).
Perbedaan gram positif dan negative menurut Hadioetomo (1985), yaitu:
- Gram positif adalah organism yang dapat menahan komplek pewarna
primer ungu Kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel tampak biru
gelap atau ungu ).
- Gram negatif adalah organism yang kehilangan komplek warna ungu
Kristal pada waktu pembilasan dengan alcohol namun kemudian terwarnai
oleh pewarnaan tandingan safranain (sel tampak merah muda).

2.4 Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dan Gram
Negatif
Adanya lugol’s iodine menyebabkan adanya ikatan CV dengan iodineyang
akan meningkatkan afinitas penigkatan zat warna oleh bakteri. Pada gram
positif dapat terbentuk CV iodine ribonukleat pada dinding sel. Penekson etanol
absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki
banyak lapisan lemak (lipid larut dalam etanol), sehingga komplek CV iodine
tetap menempel di diding sel, sel gram negatif menjadi bening. Safranin akan
mewarnai sel gram negatif menjadi merah, sedangkan gram positif tidak
berpengaruh. Counterstrain hanya berfungsi sebagai pengontras saja
(UNSOED, 2008).
Menurut Sutedjo et.all.,(1991), sel-sel bakteri yang bersifat gram positif
adalah bakteri yang mengikat zat warna dasar (utama) dengan kuat sehingga
dapat dilunturkan oleh zat peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat lawan.
Pada pengamatan mikroskopik, sel-sel bakteri gram positif berwarna biru ungu

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 78

(violet).Bakteri gram negatif adalah bakteri yang daya pengikat zat warna
dasarnya tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan dapat diwarnai kembali oleh
zat warna lawan. Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri pada pewarnaan
gram ini tampaknya berwarna merah .

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 79

3. METODOLOGI

3.1 Alat dan Fungsi

Alat-alat yang digunakan pada pratikum Mikrobiologi Dasar materi
Pewarnaan Gram adalah
- Kaca objek : untuk meletakkan sampel yang akan diamati di
bawah mikroskop
- Cawan peri : untuk wadah media perkembangbiakan bateri dan
jamur
- Washing bottle : untuk tempat aquades
- Nampan : untuk tempat alat dan bahan saat pratikum
- Bunsen : untuk sumber panas dan pengkondisian aseptis
- Sprayer : untuk tempat alkohol 70%
- Jarum LOOP : untuk menginokulasi bakteri dan jamur dari
media cairke padat atau Sebaliknya
- Mikroskop : untuk melihat benda mikromotik yang kasat mata
- Objek glass : untuk tempat sampel yang akan di amati di
mikroskop
- Cover glass : untuk menutup mobyek glass
- Pipet tetes : untuk mengambil larutan saat pewarnaan gram

3.2 Bahan dan Fungsi

Bahan –bahan yang digunakan pada pratikum Mikrobiologi Dasar materi
Pewarnaan Gram adalah :
- Alkohol 70% : untuk pengkondisian aseptis
- Media berisi koloni : sebagai media yang akan diwarnai
- Spiritus : untuk bahan bakar bunsen dan
pengkondisian aseptis
- Kristal ungu : untuk pewarna primer
- Aquades : untuk pembilas
- Iodium : untuk mengintensifkan warna ungu
- Etanol : untuk melunturkan lemak
- Safranin : untuk pewarna sekunder
- Air : untuk muncuci alat-alat setelah digunakan
- Tissue : untuk mengeringkan alat-alat

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 80

3.3 Cara Kerja Pewarnaan Gram

Kaca Obyek

Dibersikan dengan alkohol

Koloni Bakteri

Dipijarkan Jarum LOOP

Diambil dari Cawan Petri

Diletakkan pada Kaca Objek

Difiksasi diatas bunsen

Ditetesi dengan Kristal Ungu (1 tetes)

ditunggu 1 menit

Dibilas dengan aquadest

Di tetesi iodium (1 tetes) d itunggu 2 menit

Dibilas dengan aquadest

Dibilas dengan alkohol 70%

Dibilas dengan aquadest

Ditetesi dengan safranin 1 tetes

Ditunggu 1/2 menit

Dibilas dengan aquadest

Diamati di bawah mikroskop

HASIL

Gambar 14. Skema Kerja Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 81

4. PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Pada Pratikum Mikrobiologi Dasar dengan materi pewarnaan gram yang
pertama kali dilakukan adalah dipersiapkan alat dan bahan alat-alat yang
digunakan antara lain mikroskop, cawan petri, objek glass, jarum loop, pipet
tetes dan bunsen. Sedangkan bahan yang digunakan adalah NA, kristal ungu,
iodium, etanol 70% , safranin 83dan aquadest.
Langkah selanjutnya yaitu bakteri diambil dari media isolasi dengan
menggunakan jarum loop karena apabila menggunakan jarum osedapat merusak
media, jarum loop juga terlebih dahulu dipanaskan diatas bunsen agar
kondisinya aseptis. Setelah itu disentuhkan pada medium yang tidak ada
bakterinya karena jika kondisi terlalu panas bakteri bisa mati setelah itu diambil
bakteri dan digoreskan pada kaca objek. Kemudian kaca objek difiksasi di
bunsen untuk mengkondisikan aseptis dan untuk memperjelas struktur internal
dan eksternal sel. Setelah fiksasi tetesi dengan larutan kristal ungu yang
berfungsi sebagai zat warna primer dan didiamkan selama 1 menit, karena pada
waktu 1 menit diasumsikan dinding sel bakteri sudah mengunci kristal ungu.
Setelah itu dibilas dengan aquadest hal ini bertujuan agar kristal ungu yang
dapat luntur dan untuk memperjelas pengamatan. Setelah dibilas dengan
aquadest lalu ditetesi iodium dan dibiarkan selama 2 menit. Iodium berfungsi
sebagai penguat warna kristal ungu dan didiamkan selama 2 menit. Perlakuan
inidilakukan karena selama waktu tersebut diasumsikan telah cukup jelas
memberikan warna ungu pada bakteri.Setelah itu dibilas lagi dengan aquadest
hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa iodium pada bakteri.Kemudian dicuci
dengan menggunakan etanol 70 %, etanol berfungsi untuk melarutkan lemak.
Kemudian dibilas kembali dengan aquadest, hal ini bertujuan untuk memperjelas
pengamatan setelah itu ditetesi dengan menggunukan safranin, safranin disini
berfungsi sebagai pewarna sekunder dan sebagai tanda bahwa bakteri tersebut
merupakan gram negatif (-) lalu dibiarkan setengah menit karena waktu tersebut
diasumsikan bahwa dinding sel telah mengunci safranin. Setelah itu dibilas
dengan aquadest hal ini bertujuan untuk membilas safranin dan untuk
memperjelas pengamatan.Kemudian preparat diamati di bawah mikroskop dan
kemudian didokumentasikan.

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 82

Perbedaan gram positif dan gram negatif adalah gram positif adalah
organismeyang dapat menahan komplek pewarna primer ungu kristal iodium
sampai pada akhir prosedur (sel tampak biru gelap atau ungu). Sedangkan gram
negatif adalah organisme yang kehilangan komplek warna ungu kristal pada
waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarnaan
tandingan safranin (sel tampak merah muda) (Hadioetomo, 1985).

4.2 Analisa Hasil

Dalam pratikum mikrobiologi dasar materi pewarnaan gram diperoleh hasil
pengamatan dari setiap kelompok yang disajikan dalam table berikut ini.

Tabel 9. Hasil Pengamatan Uji Warna Bakteri

Kelompok Jenis bakteri (gram positif/gram ) Hasil uji warna
1 Bakteri gram positif Ungu
2 Bakteri gram positif Ungu
3 Bakteri gram negative Merah
4 Bakteri gram positif Ungu
5 Bakteri gram positif Ungu
6 Bakteri gram positif Ungu
7 Bakteri gram negative Merah
8 Bakteri gram negative Merah
9 Bakteri gram positif Ungu
10 Bakteri gram positif Ungu
11 Bakteri gram positif Ungu
12 Bakteri gram positif Ungu
13 Bakteri gram negative Merah
14 Bakteri gram negative Merah
15 Bakteri gram negative Merah
16 Bakteri gram positif Ungu
17 Bakteri gram negative Merah
18 - -
19 Bakteri gram positif Ungu
20 Bakteri gram positif Ungu
21 Bakteri gram positif Ungu

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 83

22 Bakteri gram positif Ungu

23 Bakteri gram positif Ungu
24 Bakteri gram positif Ungu

Dalam pewarnaan gram ada 2 kemungkinan yang akan terjadi yaitu

menjadi warna ungu yang menunjukkan gram positif dan warna merah yang
menunjukkan gram negatif. Warna ungu yang terdapat digram positif didapat
karena pada saat bakteri ditetesi dengan etanol dinding selnya mengkerut.
Sehingga saat diberi safranin ( pewarnaan sekunder ) bakteri tetap dapat
mempertahankan warna primernya karena pengaruh ketebalan dinding, oleh
karena itu disebut gram positif. Sedangkan gram negatif didapat karena pada
saat bakteri ditetesi dengan etanol dinding selnya tidak dapat mengkerut dengan
kuat karena strukturnya yang tipis., sehingga saat diberi safranin ( pewarnaan
sekunder ) bakteri tidak dapat mempertahankan warna primernya, sehingga
warna ungu pudar menjadi merah muda, oleh karena itu disebut gram negatif.
Perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gam negatif terletak pada
struktur dinding sel dan kandungan asam ribonukleatnya. Hasil yang diperoleh
dari setiap kelompok mengenai pewarnaan gram bakteri berbeda – beda. Ada
yang jenis bakterinya gram (+) dan ada yang jenis bakterinya gram (-). Gram (+)
berwarna ungu karena bakteri tersebut mengikat komplek zat warna kristal ungu,
gram (-) berwarna merah karena mengikat zat warna sekunder.
Jika sedian kemudian di cuci dengan air, lalu dengan alkohol maka dua
kemungkinan dapat terjadi. Pertama zat warna tambahan terhapus, sehingga
yang nampak ialah zat warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sedian (bakteri) kita
sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat
warna asli tidak tampak, dalam hal ini sedian (bakteri) kita katakan gram
negatif(Dwidjosaputro,2005)

Tabel 10. Mekanisme Penyerapan Warna

Reaksi dan Tampang Bakteri
Larutan dan Urutan
penggunaannya
Gram Positif Gram Negatif
1. Ungu Kristal (UK) Sel berwarna ungu. Sel berwarna ungu.

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 84

2. Larutan Yodium (Y) Kompleks UK-Y Kompleks UK-Y terbentuk di

terbentuk di dalam sel, dalam sel; sel tetap
sel tetap berwarna berwarna ungu.
ungu.

3. Alkohol Dinding sel mengalami Lipid terekstraksi dari

dehidrasi, pori-pori dinding sel, pori-pori
menciut, daya rembes mengembang, kompleks
dinding sel dan UK-Y keluar dari sel; sel
membran menurun, UK- menjadi tak berwarna.
Y tak dapat keluar dari
sel; sel tetap ungu.

4. Safranin Sel tak terpengaruhi, Sel menyerap zat pewarna

tetap ungu. ini, menjadi merah.

Bakteri yang diwarnai dalam pewarnaan gram ini dibagi menjadi 2

kelompok , salah satunya gram positif yang mempertahankan zat warna ungu
kristal. Bakteri gram negatif kehilangan warna ungu Kristal ketika dicuci dengan
alkohol dengan waktu diberi pewarnaan kandungan dengan safranin yang
berwarna merah ( Zubaidah, 2006 ).

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 85

5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram
adalah
- Pewarnaan adalah umtuk membuktikan larutan dalam prosesnya yaitu zat
warna penutup, zat warna lawan dan zat warna pelunturan warna.
- Pewarnaan dibedakan menjadi 3 yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan
diferensial, dan pewarnaan gram.
- Pewarnaan bertujuan untuk menjelaskan sel bakteri dengan menempelkan
zat warna ke permukaan sel bakteri
- Macam-macam pewarnaan yaitu pewarnaan tunggal, pewarnaan negatif,
pewarnaan tahan gram dan pewarnaan struktur sel
- Bahan-bahan yang digunakan yaitu Kristal ungu, iodium, etanol 70%, dan
safranin.
- Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel yang
tipis, dan kandungan lemak tipis
- Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berbeda diantara
dua lapis membran sel dan kandungan lemak tebal
- Tujuan difiksasi adalah untuk mematikan bakteri dan membuat lekat sel
bakteri pada objek glass tanpa merusak strukturnya
- Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna,
dibedakan menjadi 2 yaitu gram positif dan gram negatif
- Contoh bakteri gram positif yaitu Bacillus Subtilis dan gram negatif
contohnya E. Coli

5.2 Saran
Sebaiknya para pratikan harus selalu menjaga ketenangan pada saat
pratikum agar praktikum berjalan lancer dan materi yang diberikan dapat
dipahami dengan maksimal.

Pewarnaan Gram
 Mikrobiologi Dasar 86

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjosaputro.2005.Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Dwijoseputro, Ratna S., 1998. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta, P.T
Gramedia Pustaka.

Hadioetomo., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam praktek. Jakarta, P.T

GramediaPustaka.

Michael. J. Pepczar., 1986. Microbiology Washington : MC Grow Hill

Company Book.

Sutedjo, Mul.M, Kartasapoetro, Sastroadmodjo., 1991. Mikrobiologi Tanah.

Jakarta : Rineka Cipta.

Unsoed., 2008. Analisa Biologi Molokuler. Yogyakarta. Universitas Gajah

Mada.

Pelczar.M.L, R.D Rield., 1986.Microbiology. MC. Growhill Company : New York.

Zubaidah Elok., 2006. Mikrobiologi. Universitas Brawijaya. Malang.

Pewarnaan Gram