LAPORAN AKHIR

PENELITIAN UNGGULAN

PROFIL TUBULUS SEMINIFERUS DAN SEL SPERMATOGENIK TIKUS

WISTAR (Rattus novergicus) HIPERLIPIDEMIA SETELAH PEMBERIAN
EKSTRAK DAUN SEMBUNG (Blumea balsamifera)

Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun

OLEH:

TIM PENGUSUL

Ketua: I Gede Widhiantara, S.Si. M.Biomed. (NIDN 0826128201)

Anggota 1). A.A Ayu Putri Permatasari, S.Si. M.Biomed. (0805058201)
Anngota 2). Ni Putu Eny Sulistyadewi, S.Gz. M.Si. (0816038801)

Dibiayai oleh :
Lembaga Penelitian dan Pengabdian masyarakat (LP2M)
Universitas Dhyana Pura
Sesuai dengan Kontrak Penugasan Pelaksanaan Penelitian
Nomor: 30/UNDHIRA/LP2M/VIII/2017

i
 HALAMAN PENGESAHAN
PENELITIAN UNGGULAN

Judul Penelitian :Profil Tubulus Seminiferus dan Sel Spermatogenik

Tikus Wistar (Rattus novergicus) Hiperlipidemia
Setelah Pemberian Ekstrak Daun Sembung
(Blumea balsamifera)
Ketua Peneliti:
a. Nama Lengkap : I Gede Widhiantara, S.Si. M.Biomed.
b. NIDN : 0826128201
c. Jabatan Fungsional : Lektor
d. Program Studi : Biologi
e. Nomor HP : 081237695123
f. Alamat surel (e-mail) : widhiantara@undhirabali.ac.id
Anggota Peneliti (1)
a. Nama Lengkap : A.A Ayu Putri Permatasari, S.Si. M.Biomed.
b. NIDN : 0805058201
c. Program Studi : Biologi
Anggota Peneliti (2)
a. Nama Lengkap : .Ni Putu Eny Sulistya Dewi, S.Gz. M.Si.
b. NIDN : 0816038801
c. Program Studi : Ilmu Gizi
Biaya Penelitian : 15.000.000,-
Biaya Luaran Tambahan :-

Tahun Pelaksanaan : Tahun ke 1 dari 1 rencana 1 tahun

Biaya tahun berjalan : Rp. 9.010.000,-
Biaya keseluruhan : Rp. 15.000.000,-

Badung, 25 Oktober 2017

ii
Mengetahui, Ketua Peneliti,

Dekan FIKST Universitas Dhyana Pura

(I Gede Widhiantara, S.Si. M.Biomed.)

Dr. dr. Bambang Hadi Kartiko, MARS. NIDN.0826128201
NIP. 01225511

iii
 RINGKASAN

Kecenderungan mengkonsumsi makanan tinggi lemak dan kolestrol

menimbulkan kondisi yang disebut hiperlipidemia. Kadar lipid yang tinggi dalam
darah mengakibatkan berbagai masalah pada kesehatan hingga pada sistem
reproduksi. Penelitian ini dimaksud untuk mengetahui profil tubulus seminiferus
dan spermatogenesis pada tikus wistar hiperlipidemia setelah diberikan ekstrak
daun sembung (Blumea balsamifera) secara oral.
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan
randomized pretest - posttest control group design. Sampel dalam penelitian ini
adalah tikus wistar jantan dewasa (Rattus novergicus) umur 3-4 bulan dengan
kisaran berat badan 150 - 200 gram, sebanyak 16 ekor secara random dibagi dua
kelompok yaitu 8 ekor kelompok kontrol (hiperlipidemia dan aquadest steril) dan
8 ekor mencit kelompok perlakuan (hiperlipidemia dan ekstrak daun sembung).
Sebelum perlakuan, tikus dibuat hiperlidemia dengan memberi makanan lemak
babi selama 30 hari. Pada prettest dilakukan pemeriksaan kualitas tubulus
seminiferus dan sel-sel spermatogenik secara histopatologi kelompok
hiperlipidemia sebanyak 4 ekor, dan 4 ekor sisanya merupakan posttest setelah
diperikan perlakuan aquadest pada kelompok kontrol dan ekstrak daun sembung
selama 50 hari pada kelompok perlakuan.
Hasil menunjukkan bahwa rata-rata diameter tubulus seminiferous tikus
hiperlipidemia meningkat secara bermakna (p<0,05) setelah pemberian ekstrak
daun sembung. Peningkatan secara bermakna juga diikuti oleh Spermatogonium
A, Spermatosit Pakiten dan Spermatid 16. Jumlah Spermatid 7 meningkat tapi
tidak bermakna (p>0.05).
Kata kunci : Tubulus seminiferus, sel spermatogenik, daun sembung (Blumea
balsamifera), tikus wistar

PRAKATA

iv
 Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Pengasih atas
rahmat dan kasihnya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan akhir
penelitian Hibah Unggulan PT tahun 2017 yang berjudul “Profil Tubulus
Seminiferus dan Sel Spermatogenik Tikus Wistar (Rattus novergicus)
Hiperlipidemia Setelah Pemberian Ekstrak Daun Sembung (Blumea balsamifera)”
Penyusunan laporan akhir ini merupakan salah satu syarat yang harus dipenuhi
penulis dalam rangka memenuhi tugas melaksanakan tri darma perguruan tinggi.
Selain itu laporan akhir ini dapat digunakan sebagai tolak ukur hasil penelitian
yang dilaksanakan.
Akhir kata penulis mengucapkan banyak terimakasih kepada semua pihak
yang telah membantu dalam pelaksanaan kegiatan dan penyelesaian laporan akhir
ini.

Badung, 27 Nopember 2017

Penulis

DAFTAR ISI

v
 Halaman
HALAMAN PENGESAHAN .........................................................................ii
RINGKASAN .................................................................................................iii
PRAKATA.......................................................................................................iv
DAFTAR ISI.....................................................................................................v
DAFTAR TABEL............................................................................................vi
DAFTAR GAMBAR......................................................................................vii
BAB 1. PENDAHULUAN...............................................................................1
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................4
2.1 Hiperlipidemia dan Infertilitas....................................................................4
2.2 Spermatogenesis dan Tubulus Seminiferus.................................................5
2.3 Efektifitas Antioksidan Daun Sembung (Blumea balsamifera)..................6
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN........................................8
3.1 Tujuan Penelitian.........................................................................................8
3.2 Manfaat Penelitian......................................................................................8
BAB 4. METODE PENELITIAN.....................................................................9
4.1 Rancangan Penelitian dan Penentuan Jumlah Sampel ...............................9
4.2 Alat Dan Bahan Penelitian .........................................................................9
4.3 Prosedur Penelitian .....................................................................................9
4.3.1 Persiapan Hewan Coba ...........................................................................9
4.3.2 Pemberian Perlakuan .............................................................................10
4.3.3 Pembuatan Ekstrak Daun Sembung ......................................................11
4.3.4 Pembuatan dan Pengamatan Histopatologi Testis..................................11
4.5 Analisis Data.............................................................................................12
BAB 5. HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI........................................13
5.1 Persiapan Sampel Penelitian.....................................................................13
5.2 Pembuatan Ekstrak Daun Sembung..........................................................13
5.3 Perlakuan Hiperlipidemia pada Sampel....................................................16
5.4 Histopatologi dan Penghitungan sel-sel Spermatogenik
tikus hiperlipidemia...................................................................................16
5.5 Pemberian Ekstrak daun sembung pada tikus hiperlipidemia...................18
5.6 Rerata diameter tubulus seminiferus dan jumlah sel-sel spermatogenik. .18
5.7 Pembahasan Hasil Penelitian....................................................................19
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN.........................................................21
6.1 Kesimpulan...............................................................................................21
6.2 Saran..........................................................................................................21
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................22

vi
 DAFTAR TABEL

Tabel 1.1 Rencana Target Luaran Penelitian Unggulan .......................................3

Tabel 5.1 Ketebalan Tubulus seminiferous tikus pada pretest (normal)
dan hyperlipidemia............................................................................18
Tabel 5.2 Rerata sel spermatogenik kelompok pretest (normal) dan
hiperlipidemia ..................................................................................18
Tabel 5.3 Hasil Uji beda rerata diameter tubulus seminiferus dan sel-sel
spermatogenik kolompok kontrol dan perlakuan..............................19

vii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur dan letak sel-sel spermatogenik pada tubulus seminiferus
testis ...................................................................................................5
Gambar 2.2 Daun dan bunga sembung (Blumea balsamifera) .............................7
Gambar 3.1 Bagan alur penelitian.........................................................................9
Gambar 5.1 Kandang tikus percobaan ................................................................13
Gambar 5.2 Tumbuhan Sembung (Blumea balsamifera) yang diambil
Daunnya ..........................................................................................14
Gambar 5.3 Proses ekstraksi daun sembung........................................................14
Gambar 5.4 Hasil maserasi .................................................................................14
Gambar 5.5 Proses evaporasi...............................................................................15
Gambar 5.6 Hasil ekstrak yang diperoleh ...........................................................15
Gambar 5.7 Pemberian lemak .............................................................................16
Gambar 5.8 Organ testis yang siap dibuat preparat ............................................16
Gambar 5.9 Pemberian ekstrak sembung ...........................................................17

viii
 1

BAB 1. PENDAHULUAN

1. 1 Latar Belakang
Ketidaksuburan atau infertilitas pada pasangan suami istri merupakan
suatu hal yang sangat mengganggu bahkan bisa mengancam keutuhan suatu
rumah tangga. Masalah kesuburan terjadi akibat terganggunya sistem reproduksi
pada wanita dan terjadinya penurunan kualitas dan kuantitas sperma pada pria.
Menurut data demografis dunia, 12,5 % pasangan usia subur mengalami kesulitan
mendapatkan anak. Faktor infertilitas pria memegang peranan 50% dari
keseluruhan kasus. Infertilitas terutama lebih banyak terjadi di kota-kota besar
karena gaya hidup yang penuh stres, emosional dan kerja keras serta pola makan
yang kurang seimbang (Agarwal dan Said, 2005).
Pola makan dengan lebih cenderung mengkonsumsi makanan berlemak
dan berkolesterol tinggi berisiko menyebabkan peningkatan kadar lipid dalam
darah yang dikenal dengan istilah hiperlipidemia. Gambaran klinis yang paling
sering didapatkan berupa peningkatan kadar kolesterol total, trigliserida dan LDL
serta penurunan kadar HDL (Almatsier, 2004). Keadaan hiperlipidemia
berkorelasi positif dengan timbulnya berbagai penyakit degenaratif seperti PJK
(penyakit jantung koroner), diabetes melitus, kanker, obesitas, dislipidemia,
stroke, hingga menurunkan fungsi reproduksi pria (infertilitas). Beberapa dampak
hiperlipidemia pada sistem reproduksi pria antara lain; atrofi tubulus, penurunan
motilitas spermatozoa, abnormalitas morfologi spermatozoa, hambatan sekresi
hormone testosterone serta LH (Luteinizing Hormone), degenerasi sel leydig dan
gangguan spermatogenesis (Bashandy, 2006).
Kondisi hiperlipdemia berperan signifikan dalam peningkatan produksi
radikal bebas dan ketidaksesuaian perkembangan lipid peroksida pada tingkat
jaringan. Sehingga keadaan tersebut memicu yang disebut dengan stress oksidatif
yang merupakan suatu patofisiologi infertilitas pada pria (Agarwal dan Said,
2005). Pada tikus hiperlipidemia, terjadi penurunan yang signifikan dari kadar
testosteron plasma. Penurunan ini terjadi akibat dari terganggunya poros
hipotalamus-hipofise-testis, degenerasi sel Leydig, reduksi diameter nukleus sel

1
 2

Leydig, atau karena penurunan kadar LH dan aktivitas testikular dari 17β-
hidroksisteroid dehidrogenase (Bashandy 2006).
Substansi yang dapat menangkal radikal bebas disebut antioksidan.
Antioksidan dapat berupa enzimatis atau antioksidan primer dan non-enzimatis
atau antioksidan sekunder (Winarsi, 2007). Antioksidan sekunder dapat diperoleh
secara melimpah di alam, misalnya vitamin A, C, E, β-karoten dan senyawa
flavonoid. Salah satu tumbuhan dengan kandungan antioksidan yang tinggi adalah
Sembung (Blumea balsamifera). Sembung dikenal sebagai tumbuhan yang dapat
digunakan sebagai obat (Aminul et al., 2013; Suweta, 2013). Tumbuhan ini
termasuk jenis tanaman liar dan mudah dibudidayakan. Masyarakat Bali
umumnya menggunakan daun dari tumbuhan sembung untuk digunakan sebagai
loloh.
Daun sembung telah lama dipercaya dapat mengobati penyakit panas
dalam, diare, memperlancar peredaran darah (vasodilatasi), menurunkan kadar
gula dan lemak dalam darah. Tanaman sembung memiliki kandungan zat aktif
yaitu minyak atsiri 0,5% (sineol, borneol, landerol, dan kamper), flavanol, tanin,
damar dan ksantoksilin (Mursito, 2002). Kandungan senyawa golongan flavonoid
pada daun sembung dapat bersifat sebagai imunomodulator dan antioksidan
sehingga membantu regenerasi sel yang rusak akibat serangan radikal bebas.
Berdasarkan latar belakang tersebut, perlu dilakukan penelitian mengenai
profil tubulus seminiferus dan sel spermatogenik pada kondisi hiperlipidemia
yang diberikan ekstrak daun sembung. Hasil penelitian ini dapat dijadikan
referensi baru dalam mencari solusi yang mudah dan murah terhadap masalah
infertilitas pada pria yang memiliki pola makan tinggi kolesterol dan lemak.
Target luaran penelitian ini disajikan pada Tabel 1.1 di bawah ini.
 3

Tabel 1.1 Rencana Target Capaian Tahunan Penelitian Unggulan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

Luaran Wajib
1 Publikasi ilmiah pada Jurnal terindeks DOAJ/IPI Submitted
2 Publikasi pada media masa cetak/online 6) Draft
3 Peningkatan daya saing (peningkatan kualitas, Tidak ada
kuantitas, serta nilai tambah barang, jasa, diversifikasi
produk, atau sumber daya lainnya ) 4)
4 Peningkatan penerapan iptek di masyarakat Tidak ada
(mekanisasi, IT, dan manajemen) 4)
5 Perbaikan tata nilai masyarakat (seni budaya, sosial, Sudah dilaksanakan
politik, keamanan, ketentraman, pendidikan,
kesehatan) 2)
Luaran Tambahan
1 Publikasi di jurnal internasional1) Tidak ada
2 Jasa; rekayasa sosial, metode atau sistem, Tidak ada
produk/barang5)
3 Inovasi baru TTG5) Tidak ada
4 Hak kekayaan intelektual (Paten, Paten sederhana, Tidak ada
Hak Cipta, Merek dagang, Rahasia dagang, Desain
Produk Industri, Perlindungan Varietas Tanaman,
Perlindungan Desain Topografi Sirkuit Terpadu)3)
5 Buku ber ISBN6) Tidak ada

Keterangan :
1) Isi dengan belum/tidak ada, draf, submitted, reviewed, atau accepted/published
2) Isi dengan belum/tidak ada, draf, terdaftar, atau sudah dilaksanakan
3) Isi dengan belum/tidak ada, draf, atau terdaftar/granted
4) Isi dengan belum/tidak ada, produk, penerapan, besar peningkatan
5) Isi dengan belum/tidak ada, draf, produk, atau penerapan
6) Isi dengan belum/tidak ada, draf, proses editing/sudah terbit
 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Hiperlipidemia dan Infertilitas

Hiperlipidemia adalah suatu kondisi kadar lipid darah yang melebihi kadar
normalnya, dengan kadar LDL (Low Density Lipoprotein) yang tinggi dan kadar
HDL (High Density Lipoprotein) yang rendah. Hiperlipidemia disebut juga
peningkatan lemak dalam darah yang disertai dengan peningkatan beberapa fraksi
lipoprotein, disebut juga hiperlipoproteinemia. Hiperlipidemik dapat berupa
hiperkolesterolemia dan hipertrigliseridemia (Almatsier, 2004; Kumalasari, 2005).
Lemak disebut juga lipid adalah zat yang kaya energi, yang berfungsi
sebagai sumber energi utama untuk proses metabolism tubuh. Lemak diperoleh
dari makanan atau dibentuk oleh tubuh terutama di hati dan disimpan di dalam sel
sel lemak. Dua jenis lemak utama dalam darah adalah kolesterol dan trigliserida.
Lemak berikatan dengan protein yang masuk kedalam aliran darah yang disebut
lipoprotein (Anderson, 2007).
Setiap lipoprotein berbeda dalam ukuran, densitas, komposisi lemak, dan
komposisi apoprotein. Dengan menggunakan ultrasentrifusi, pada manusia dapat
dibedakan 6 jenis lipoprotein yaitu l-high density lipoprotein (HDL), low-density
lipoprotein (LDL), intermediet-density lipoprotein (IDL), very low density
lipoprotein(VLDL), kilomikron dan lipoprotein a kecil (Lp(a)). Komposisi diet
merupakan factor penting dalam penentuan konsentrasi lipoprotein serum pada
manusia. Peningkatan kolesterol tersebut dapat menyebabkan peningkatan
produksi radikal oksigen (ROS) dan lipid peroksidasi pada jaringan.
Peningkatan ROS berbanding searah dengan peningkatan konsentrasri
LDL pada pasien hiperlipidemia dan berbanding terbalik dengan konsentrasi
HDL. Hal inilah memacu timbulnya stress oksidatif. Stress oksidatif timbul
sebagai konsekuensi peningkatan yang berlebihan dari produksi ROS dan
terganggunya mekanisme pertahanan oleh antioksidan. ROS berpotensi toksik
terhadap kualitas spermatozoa dan fungsi sperma. Spermatozoa mudah terserang
oleh induksi stress oksidatif karena dalam membrane plasmanya banyak
terkandung asam lemak. Stress oksidatif berperan sebagai mediator kerusakan
pada membrane plasma, sehingga mengurang kualitas sperma. ROS menginduksi
4
 5

lipid peroksidasi yang merupakan agen penyebab perubahan morfologi sperma.

Stres oksidatif menginduksi kerusakan DNA yang mempercepat apoptosis sel
epitel germinal sehingga menurunkan jumlah sperma (Soehadi, 2006).

2.2. Spermatogenesis dan Tubulus seminiferus

Spermatogenesis adalah perkembangan spermatogonium menjadi
spermatozoa. Perkembangan ini diawali dari spermatogonia berubah menjadi
spermatosit, kemudian menjadi spermatid dan akhirnya menjadi spermatozoa.
Pada manusia spermatogenesis berlangsung dalam waktu rata-rata 74 jam, bisa
lebih atau kurang 4 hari. Pada tikus berlangsung selama 48-52 hari, sedangkan
pada mencit kurang lebih 35,5 hari (Ganong, 2002).
Pada mamalia spermatogenesis berlangsung melalui 3 tahap yaitu
spermatositogenesis, meiosis dan spermiogenesis. Pada tahap
spermatositogenesis, spermatogonia mengalami pembelahan beberapa kali
sehingga menghasilkan spermatogonia tipe A2, A3 dan A4. Spermatogonia tipe
A4 mengalami pembelahan dan menhgasilkan spermatogonia intermediet yang
selanjutnya akan membelah menhgasilkan spermatogonia tipe B, spermatogonia
ini akan mengalami mitosis membentuk spermatosit primer yang pada tahap
praleptoten memasuki fase istirahat (Tendean, 2001).

Gambar 2.1 Struktur dan letak sel-sel spermatogenik pada tubulus

seminiferus testis (Sumber: Colon, 2007)
 6

Tahap meiosis terdiri atas 2 fase yaitu meiosis I dan meiosis II. Masing
masing tahap tersebut akan mengalami tahap profase, metaphase, anaphase, dan
telofase. Tahap profase pada meiosis I meliputi subtahap leptoten, zigoten,
pakiten, leptoten, diploten, dan diakinesis. Hasil akhir dari meiosis I adalah
spermatosit sekunder. Spermatosit sekunder memasuki tahap meiosis II dan
mengalami pembelahan sampai terbentuk spermatid yang haploid (Sherwood,
2001). Spermiogenesis adalah tahap tranformasi dimana spermatid mengalami
perubahan bentuk dari bentuk bundar menjadi spermatozoa yang terdiri dari
kepala, leher dan ekor.
Tubulus seminiferus adalah suatu organ berbentuk saluran panjang dan
berkelok- kelok yang terdapat dalam lobulus testis. Di dalam tubulus seminiferus
inilah terdapat proses perkembangan sel-sel spermatogenik yang membelah
beberapa kali dan akhirnya berdiferensiasi untuk menghasilkan spermatozoa.
Proses ini disebut dengan spermatogenesis. Sel-sel spermatogenik tersebut
tersebar dalam empat sampai delapan lapisan yang menempati ruangan antara
lamina basalis dan lumen tubulus seminierus. Semakin banyak lapisan sel-sel
spermatogenik maka gambaran diameter tubulus seminiferus semakin besar. Sel-
sel spermatogenik terdiri atas spermatogonium, spermatosit primer, spermatosit
sekunder dan spermatid (Junqueira et al., 1995).

2.3 Efektifitas Antioksidan Daun Sembung (Blumea balsamifera)

Blumea balsamifera atau sembung telah digunakan oleh masyarakat
Indonesia untuk mengatasi influenza, rematik, nyeri haid, haid tidak teratur,
demam, asma, batuk, bronkitis, perut kembung, diare, perut mulas, sariawan, dan
diabetes (Dalimartha, 1999). Sembung berasa pedas, sedikit pahit, hangat dan
baunya seperti rempah. Metabolit yang terkandung di dalam daun sembung secara
umum berupa minyak atsiri dengan komponen bor-neol, kamfora, floroasetofenon
dimetil eter, seskuiterpenlakton, diterpen, triterpen, sterol, paraffin, saponin,
golongan fenolik turunan asam sinamat. Peneliti lain menemukan seskuiterpen
dalam bentuk ester, flavonoid, icthyo-thereol acetate, cryptomerediol, lutein dan
betakaroten (Osaki et al., 2005; Nessa et al., 2005). Selain itu ditemukan
blumeatin (5,3',5'-trihydroxy-7methoxy-dihydro-flavone), suatu golongan
flavonoid yang berefek sebagai hepatoprotektor (Xu et al., 1993).
 7

Gambar 2.2 Daun dan bunga sembung (Blumea balsamifera)

(Sumber: Munawaroh et al., 2015)

Hasil penelitian pada golongan flavonoid, telah ditemukan bahwa dihidro

flavonol dapat bermanfaat terhadap penyakit kanker (Hiroo et al., 2006).
Flavonoid dapat berfungsi sebagai imunomodulator, selain alkaloid, tanin, dan
saponin (Akrom, 2004). Imunitas juga dapat ditingkatkan oleh beberapa senyawa
yang berefek sebagai antioksidan seperti senyawa fenolik atau polifenol.
flavonoid mempunyai mempunyai kandungan 20% lebih besar dari vitamin E dan
50 % lebih besar dari vitamin C sebagai antioksidan. Walaupun beberapa
dilaporkan bahwa flavonoid memiliki efek menghambat spermatogenesis dalam
dosis yang kronis (Solihati et al., 2013).
 8

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengetahui profil tubulus seminiferous Tikus Wistar (Rattus novergicus)
hyperlipidemia sebelum dan setelah pemberian ekstrak daun sembung
(Blumea balsamifera) yang meliputi morfologi dan ketebalan tubulus.
2. Mengetahui jumlah sel-sel spermatogenik Tikus Wistar (Rattus
novergicus) hyperlipidemia sebelum dan setelah pemberian ekstrak daun
sembung (Blumea balsamifera).

3.2 Manfaat Penelitian

Adapun manfaat yang dapat diperoleh dari hasil penelitian ini antara lain:
1. Menambah referensi tentang akibat hiperlipidemia pada sistem reproduksi
dan bahan alam yang mampu mencegahnya.
2. Memberi informasi terhadap masyarakat umum tentang bahaya
hiperlipidemia terhadap sistem reproduksi sehingga masyarakat dapat
mengatur pola hidup terutama pola makan.
 9

BAB 4. METODE PENELITIAN

4.1. Rancangan Penelitian dan Penentuan Jumlah Sampel

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan
randomized pretest - posttest control group design. Sampel dalam penelitian ini
adalah tikus wistar jantan dewasa (Rattus novergicus) umur 3-4 bulan dengan
kisaran berat badan 150 - 200 gram.
Oleh karena sampel bersifat homogen yaitu tikus wistar jantan yang
memenuhi syarat sebagai sampel penelitian, maka sampel diambil secara acak
sederhana untuk mendapatkan jumlah sampel. Sampel yang dipilih dibagi menjadi
2 kelompok yaitu kelompok kontrol hiperlipidemia yang diberikan aqudest steril
dan kelompok yang diberi perlakuanekstrak daun sembung per oral. Jumlah
sampel yang dipakai berjumlah 12 ekor pada masing-masing kelompok dengan
menambahkan 1 ekor cadangan pada kedua kelompok (Widhiantara, 2010).

4.2. Alat dan Bahan Penelitian

Alat dalam penelitian ini adalah: kandang hewan, mikroskop elektrik,
peralatan untuk histopatologi testis yaitu mikrotom, pisau mikrotom, oven, lampu
spiritus, scalpel, holder, spatula, kuas, hotplate, stainingjar, bunsen, gelas objek
dan kaca penutup, dissecting set, autotechnicion, sonde, timbangan gram,
counting chamber, gunting, pinset seperti alat untuk ekstraksi daun sembung
seperti alat maserasi, saringan, timbangan dan alat destilasi.
Bahan dalam penelitian ini adalah: lemak (minyak) babi, tikus wistar
jantan (Rattus novergicus) umur 3-4 bulan, berat badan 150-200 gram, ekstrak
daun sembung, makanan ternak, sekam, aquadest, ekstrak daun sembung. Bahan
pembuatan histopatologi testis yaitu etanol 96%, paraffin cair, histosac,
hematoxylin-eosin (HE), xylol, Canada balsam, larutan buffer, formalin, ether dan
alcohol bertingkat (30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 95%, 96%).

4.3. Prosedur Penelitian

4.3.1. Persiapan Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan tikus wistar jantan (Rattus novergicus) umur
3-4 bulan, berat badan 150-200 gram. Kandang yang digunakan untuk memelihara

9
 10

tikus berupa bak plastik dengan ukuran panjang 50 cm, dan tinggi 20 cm yang
ditutup dengan penutup kawat serta pada dasar bak diberi sekam untuk menyerap
kotoran.

4.3.2. Pemberian Perlakuan

Sampel tikus dibagi menjadi 2 kelompok, masing-masing kelompok terdiri
dari 12 ekor. Pemberian diet lemak babi dilakukan pada kelompok kontrol (pre
test) selama 30 hari setelah tikus diaklimatisasi selama 7 hari. Kemudian pada
kelompok control (post test) diberikan aquadest steril. Pada kelompok perlakuan
(pre test) diberikan diet lemak babi sebanyak 2 ml/hari dan pada kelompok
perlakuan (post test) diberikan ekstrak daun sembung secara oral sebanyak selama
50 hari.
Setelah 50 hari mencit kelompok kontrol dan perlakuan dieutinasi dengan
menggunakan eter kemudian dibedah dan dibuat sediaan histopatologi testis
kemudian dilakukan pengamatan terhadap profil tubulus serta jumlah
spermatogonium A, spermatosit pakhiten, spermatid 7, dan spermatid 16.

Pre Hiperlipidemia
(6 ekor)
Kelompok
Kontrol
(12 ekor)
Post Hiperlipidemia
(6 ekor) + Aquadest
steril
Tikus Wistar
Jantan Pemeriksaan
(16 ekor) Histopatologi
Testis
Pre
Hiperlipidemia
(6 ekor)
Kelompok
Perlakuan
(12 ekor)
Post Hiperlipidemia
+ ekstrak daun
(6 ekor)
sembung

Gambar 3.1. Bagan Alur Penelitian

 11

4.3.3 Pembuatan ekstrak daun sembung

Daun sembung segar berukuran sedang dan berwarna hijau dibersihkan
dari bahan organik asing dan kotoran dengan mencucinya dengan air beberapa
kali. Ditiriskan dan diangin-anginkan di udara terbuka hingga bebas dari air
cucian. Kemudian ditimbang sejumlah tertentu, masukkan kedalam juicer dan
dihancurkan, tambahkan etanol sebagai senyawa pengekstrak. Lalu dimaserasi
selama 24 jam. Selanjutnya disaring beberapa kali untuk kemudian diambil
residunya. Residu dijadikan satu untuk selanjutnya didestilasi untuk memisahkan
alkohol dengan ekstrak daun sembung. Setelah terpisah ekstrak diuapkan hingga
terbentuk serbuk kering yang selanjutnya disimpan. Kadar daun sembung dihitung
dengan cara membandingkan bobot daun dengan volume akhir yang diperoleh,
hingga diperoleh kadar dengan satuan mg/ml. Kadar yang diperoleh dijadikan
patokan dalam pemberian dosis. Pembuatan ekstrak daun sembung dilakukan di
Laboratorium Sains Universitas Dhyana Pura dan evaporasi dilakukan di
Laboratoium FTP Universitas Udayana.

4.3.4. Pembuatan dan Pengamatan Histopatologi Testis

Organ testis difiksasi dalam larutan formalin buffer 10% selama 24 jam,
kemudian dilanjutkan dengan fiksasi pada larutan Bouin selama 3 jam.
Selanjutnya dilakukan washing, dehidrasi, clearing, yaitu organ testis dicuci
dengan alcohol 70% sebanyak 5 kali. Dehidrasi dilakukan dengan alcohol
konsentrasi bertingkat masing-masing selama 30 menit. Untuk menjernihkan
organ direndam dalam toluol selama 24 jam. Kemudian dilakukan infiltrasi dan
embedding yaitu infiltrasi dalam parafin ke dalam jaringan dilakukan dengan cara
merendam organ dalam campuran toluol dan parafin (30 menit), kemudian
dilanjutkan dengan parafin I, II dan III masing-masing selama 50 menit.
Selanjutnya dilakukan embedding yaitu penanaman organ dalam parafin padat.
Pengirisan dan penempelan dilakukan dengan blok parafin yang berisi
organ testis dengan menggunakan mikrotom Leitz 1512) sehingga deretan irisan
membentuk pita, kemudian dipilih irisan yang bagus ditempel pada objek glass
yang telah diolesi Mayer;s albumin. Biarkan selama 24 jam agar penempelan
cukup kuat. Staining dan maounting yaitu sediaan dipulas dengan Hematoxylin
 12

Ehrlich-Eosin dengan urutan sebagai berikut: xylol I (10 menit), alcohol 95%,
90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, dan 30% (3-5 celup). Aquades 5 celup, alcohol
30%, 40%,50%, 60%, 70% (3-5 celup). Eosin Y 1% (2-3 menit), alcohol 70%,
80%, 95% (beberapa celup). Xylol II (10 menit). Sediaan yang telah dipulas
ditutup dengan Canada balsam.
Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop elektrik (Olympus CX-21)
yang telah dipasang micrometer untuk melihat profil tubulus seminiferus dalam
hal ini diameter dan tebal epitel. Penghitungan jumlah sel-sel spermatogenik
adalah pada tahap VII-VIII yang terpotong melintang tegak lurus sehingga
penampang tubulus tampak bulat. Preparat diambil dari testis kanan dan kiri
masing-masing 3 sayatan. Setiap preparat diamati profil tubulus dan jumlah sel
spermatogenik dengan 5 lapangan pandang dibawah mikroskop elektrik dengan
pembesaran 400x. Hasil penghitungan yang diperoleh adalah hasil jumlah sel-sel
spermatogenik dari semua pengamatan.
Perwatan dan perlakuan pada tikus dilakukan di Laboratorium
Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Udayana sedangkan pemeriksaan
histopatologi dilakukan di Balai Besar Penyakit Veteriner (BPVET) Denpasar.

4.5. Analisis Data

Hasil penelitian terhadap profil tubulus dan sel-sel spermatogenik analisis
secara statistik (Priyanto, 2000). Dengan urutan analisis deskriptif yaitu uji
normalitas uji homogenitas dan dilanjutkan dengan uji komparabilitas. Untuk
mengetahui efek pemberian ekstrak daun sembung maka dibandingkan rerata sel
spermatogenik posttest pada kelompok kontrol dengan kelompok dengan
perlakuan maka digunakan Independent t-Test serta untuk membandingkan
pengamatan pretest dan posttest digunakan Paired t-Test.
 13

BAB 5. HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

5.1 Persiapan sampel penelitian

Sampel dalam penelitian ini adalah tikus strain wistar (Rattus novergicus)
berjumlah 16 ekor yang dibagi ke dalam 2 kelompok (masing-masing kelompok
terdiri dari 8 ekor tikus) yaitu kelompok kontrol dan perlakuan. Kelompok kontrol
merupakan tikus yang dibuat hiperlipidemia kemudian diterapi selama 30 hari
dengan aquadest steril, sedangkan kelompok perlakuan merupakan tikus yang
dibuat hiperlipidemia kemudian diberikan perlakuan ekstrak daun sembung secara
oral selama 30 hari. Kandang tikus yang digunaan adalah bak plastik berukuran
40 X 30 X 20 cm dengan memberi sekam sebagai alas dan penutup jaring kawat
dengan ukuran jarring 1,6 cm².

Gambar 5.1 Kandang tikus percobaan

5.2 Pembuatan ekstrak Daun sembung (Blumea balsamifera)

Ekstrak daun sembung segar diperoleh dari tanaman sembung yang tumbuh
liar diperkebunan. Beberapa helai daun sembung segar diambil dan ditimbang
kurang lebih 500 g. Daun kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian
diblender, setelah itu menambahkan etanol 1 liter sehingga mendapatkan larutan
ekstrak. Ekstrak kemudian dimaserasi selama 24 jam. Setelah 24 jam ekstrak
kemudian disaring beberapa kali untuk mendapatkan residu. Residu dikumpulkan
untuk diuapkan (evaorasi) untuk mendapatkan ekstrak murni dari daun sembung.

13
 14

Gambar 5.2 Tumbuhan Sembung (Blumea balsamifera) yang

diambil daunnya

Gambar 5.3 Proses ekstraksi daun sembung

Gambar 5.4 Hasil maserasi

 15

Gambar 5.5 Proses evaporasi

Gambar 5.6 Ekstrak yang diperoleh

 16

5.3 Perlakuan hiperlipidemia pada sampel

Tikus percobaan dibuat hiperlipid dengan memberikan asupan lemak

sebanyak 2 ml/hari selama 30 hari. Lemak yang diberikan dalam penelitian ini
adalah lemak babi yang diperoleh dari warung yang menjual makanan berdaging
babi. Pada semua sampel baik itu kelompok kontrol maupun perlakuan diberikan
diet lemak.

Gambar 5.7 Pemberian lemak

5.4 Histopatologi dan penghitungan sel-sel spermatogenik tikus

hiperlipidemia

Histopatologi jaringan testis dilakukan di laboratoium Balai Besar

Penyakit Veteriner Denpasar (BBPVet). Organ testis difiksasi dalam larutan
formalin buffer 10% selama 24 jam, kemudian dilanjutkan dengan fiksasi pada
larutan Bouin selama 3 jam. Selanjutnya dilakukan washing, dehidrasi, clearing,
yaitu organ testis dicuci dengan alcohol 70% sebanyak 5 kali. Dehidrasi dilakukan
dengan alcohol konsentrasi bertingkat masing-masing selama 30 menit. Untuk
menjernihkan organ direndam dalam toluol selama 24 jam. Kemudian dilakukan
infiltrasi dan embedding yaitu infiltrasi dalam parafin ke dalam jaringan dilakukan
dengan cara merendam organ dalam campuran toluol dan parafin (30 menit),
kemudian dilanjutkan dengan parafin I, II dan III masing-masing selama 50 menit.
Selanjutnya dilakukan embedding yaitu penanaman organ dalam parafin padat.
Pengirisan dan penempelan dilakukan dengan blok parafin yang berisi
organ testis dengan menggunakan mikrotom Leitz 1512) sehingga deretan irisan
membentuk pita, kemudian dipilih irisan yang bagus ditempel pada objek glass
yang telah diolesi Mayer;s albumin. Biarkan selama 24 jam agar penempelan
 17

cukup kuat. Staining dan maounting yaitu sediaan dipulas dengan Hematoxylin
Ehrlich-Eosin dengan urutan sebagai berikut: xylol I (10 menit), alcohol 95%,
90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, dan 30% (3-5 celup). Aquades 5 celup, alcohol
30%, 40%,50%, 60%, 70% (3-5 celup). Eosin Y 1% (2-3 menit), alcohol 70%,
80%, 95% (beberapa celup). Xylol II (10 menit). Sediaan yang telah dipulas
ditutup dengan Canada balsam.

Gambar 5.8 Organ testis tikus yang siap untuk dibuat preparat
Evaluasi tubulus seminiferous pada tikus hiperlipidemia didapatkan hasil
seperti gambar berikut.

Ruang intertisial

Sel Spermatogenik

Gambar 5.9 Tubulus seminiferus testis tikus hiperlipidemia

(nampak atrofi tubulus, ruang intertisial kehilangan sel Leydig serta berkurangnya
sel-sel spermatogenik), tanda panah tebal menunjukkan kekosongan sel
spermatogenik

5.5 Pemberian ekstrak daun sembung pada tikus hiperlipidemia

Tikus sampel yang mengalami hiperlipidemia kemudian diberi ekstrak daun
sembung pada kelompok perlakuan dan aquadest (placebo) pada kelompok
 18

kontrol. Dosis ekstrak daun sembung yang diberikan adalah 2 mg/ml/ ekor/hari
selama 30 hari.

Gambar 5.10 Pemberian ekstrak sembung

5.6 Rerata diameter tubulus seminiferus dan jumlah sel-sel spermatogenik

Setelah pemberian ekstrak daun sembung selama 50 hari maka dilakukan

histopatologi yang ke-2 untuk mengetahui gambaran tubulus seminiferous
serta jumlah sel-sel spermatogenik tikus wistar hiperlipidemia. Hasil
pengamatan disajikan pada tabel di bawah ini.
Tabel 5.1 Rerata Tubulus Seminiferus dan sel-sel spermatogenik tikus
wistar hiperlipidemia kelompok kontrol

Diameter Spermatogonium Spermatosit Spermatid 7 Spermatid

tubulus (µm) A ± SD Pakiten ± SD ± SD 16 ± SD
± SD
Pretest 265,63±19,25 35,25±2,77 39,05±2,55 43,35±2,23 48,9±3,57

Posttest 253,43±41,43 37,48±2,45 40,03±1,84 41,03±2,53 49,03±2,28

Tabel 5.2 Rerata Tubulus Seminiferus dan sel-sel spermatogenik tikus wistar
hiperlipidemia kelompok perlakuan
Diameter Spermatogonium Spermatosit Spermatid 7 Spermatid
tubulus (µm) A ± SD Pakiten ± ± SD 16 ± SD
± SD SD
Pretest 265,63±7,25 35,85±1,94 35,53±2,79 38,28±1,98 47,3±3,57

Posttest 339,97±9,35 55,1±3,52 48,3±1,96 44,15±2,53 61,43±2,32

 19

Beda Rerata
Diameter Spermatogonium Spermatosit Spermatid 7 Spermatid
Kelompok tubulus A Pakiten 16
(µm)

Pretest-Posttest Kontrol 12,2d 2,23b 1,02b 2,32d 1,87b

Pretest-Posttest Perlakuan 74,34a 19,25a 12,77a 5,87a 14,13a
Posttest Kontrol-Perlakuan 86,54a 17,62a 8,27a 3,12b 12,4a
Tabel 5.3 Hasil Uji beda rerata diameter tubulus seminiferus dan sel-sel
spermatogenik kolompok kontrol dan perlakuan

Keterangan: a = meningkat signifikan, b = meningkat tidak signifikan, c =

menurun signifikan dan d = menurun tidak signifikan (perbedaan signifikan
p<0,05)

5.7 Pembahasan Hasil Penelitian

Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa hiperlipidemia menyebabkan

gangguan pada sistem reproduksi, dalam penelitian ini adalah berupa kerusakan
tubulus seminiferous dan hambatan spermatogenesis. Pada pengamatan profil
tubulus seminiferous tampak terjadi atrofi tubulus sehingga diameter tubulus
ukurannya mengecil dan memperlebar jarak ruang antar sel tempat sel Leydig.
Pemebrian ekstrak daun sembung mampu meningkatkan ukuran diameter tubulus
seminiferous testis tikus wistar hiperlipidemia sebesar 74,34 µm (Tabel 5.3). Rata-
rata diameter tubulus seminiferous tikus wistar hiperlipidemia sebesar
265,63±7,25 µm, dan meningkat secara bermakna (p<0,05) menjadi 339,97±9,35
µm (Tabel 5.2). Berbeda pada kelompok kontrol yang hanya diberikan placebo
mengalmi penurunan ukuran diameter secara tidak bermakna (Tabel 5.3). Setelah
dilakukan uji statistik pada kedua kelompok (kontrol dan perlakuan) didapatkan
hasil yang berbeda bermakna dengan selisih rerata diameter tubulus seminiferous
sebesar 86,54 µm (Tabel 5.3).

Pemberian ekstrak daun sembung juga memberikan efek yang signifikan terhadap
peningkatan jumlah sel-sel spermatogenik seperti Spermatogonium A, Spermatosit
Pakiten, Spermatid 7 dan Spermatid 16, namun khusus Spermatid 7 pada kelompok
perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol didapatkan hasil meningkat tapi tidak
bermakna (p<0.05) (Tabel 5.3). Ekstrak daun sembung efektif untuk memperbaiki fungsi
spermatogenis yang terhambat akibat hiperlipidemia. Kandungan antioksidan yang
berperan dalam menangkal radikal bebas dan senyawa stimulan vasodilatasi pada
 20

pembuluh darah yang terganggu akibat hiperlipidemia mampu memperbaiki sel-sel

spermatogenik pada testis tikus hiperlipidemia.

Beberapa kandungan metabolit dalam daun sembung antara lain minyak atsiri
dengan komponen bor-neol, kamfora, floroasetofenon dimetil eter,
seskuiterpenlakton, diterpen, triterpen, sterol, paraffin, saponin, golongan fenolik
turunan asam sinamat, seskuiterpen dalam bentuk ester, flavonoid, icthyo-thereol
acetate, cryptomerediol, lutein dan beta karoten (Osaki et al., 2005; Nessa et al.,
2005). Selain itu ditemukan blumeatin (5,3',5'-trihydroxy-7methoxy-dihydro-
flavone), suatu golongan flavonoid yang berefek sebagai hepatoprotektor (Xu et
al., 1993). Kombinasi senyawa yang bersifat antioksidan tersebut terbukti efektif
untuk memperbaiki keadaan tubulus seminiferus tikus hiperlipidemia.

Gambar 5.10 Tubulus seminiferous testis tikus hiperlipidemia setelah pemberian

ekstrak daun sembung (diameter tubulus lebih besar dan sel-sel spermatogenik
lebih banyak jumlahnya)

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan
 21

Dari hasil penelitian di atas dapat diambil beberapa kesimpulan antara lain:

1. Pemberian ekstrak daun sembung meningkatkan diameter tubulus

seminiferous tikus wistar hiperlipidemia secara bermakna.

2. Pemberian ekstrak daun sembung meningkatkan jumlah sel-sel

spermatogenik tikus wistar hiperlipidemia.

6.2 Saran

Saran yang dapat diberikan dalam penelitian ini adalah penelitian lanjutan
dengan menambah derajat hiperlipidemia baik itu waktu dan dosis pemberian
lemak sehngga diketahui lebih lanjut efektifitas pemberian ekstrak daun sembung
terhadap profil tubulus seminiferous tikus hiperlipidemia.

DAFTAR PUSTAKA

Agarwal A, and Said T.M. 2005. Oxidative stress, DNA damage and apoptosis in
21 BJUI; 95: 503-7
male infertility: a clinical approach.
 22

Akrom, 2004. Efek Ekstrak Etanol Herba Meniran (Phyllanthus niruri L.)
terhadap Respon Imun Seluler Mencit Galur Swiss Jantan yang Diinfeksi
Plasmodium Berghei: Studi Imunmodulator Fitokimia, Tesis, Program
Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Almatsier S. 2004. Penuntutan Diet. Edisi baru. Jakarta: Gramedia Pustaka
Utama:
Aminul, Shawkat Md. Islam., Kh Tanvir Ahmed., Mohammad Kawsar Manik.,
Md. Arif Wahid., and Chowdhury Shafayat Ibne Kamal. 2013. A
comparative study of the antioxidant, antimicrobi al, cytotoxic and
thrombolytic potential of the fruits and leaves of Spondi as dulcis. Asian
Pac J Trop Biomed 3(9): 682-691.
Anderson,D.M. 2007. Dorlands Illustrated Medical Dictionary, 31st Ed.
Philadelphia. Saundeus
Bashandy A.E.S. 2006. Effect of fixed oil Nigella sativa on male fertility in
normal and hyperlipidemic rats. Intl. J. Pharmacol. 2(1): 104-109
Colon, E. 2007. Autocrine and Paracrine Regulation of Leydig Cells Survival in
The Postnatal Testis. Karolinka Institutet. Stockholm.
Dalimartha, S.,1999, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 1, Trubus Agriwidya,
Jakarta
Ganong, W.F. 2002. Fisiologi Kedokteran. Edisi Bahasa Indonesia. Jakarta.
Hiroo H., Yasuaki Y, Kanki K, Masahiko H, Masami I, Tatsushi Y, Toshiyuki S,
Takashi K, Toh-Seok Kam, Ken M, Kazuyu-ki S, Kazuto T, Norihi-ko A,
Kunihiro T, Masato M, Nobuyuki T, and Shimeru K, 2006, Dihy-
droflavonol BB1, an extract of natural plant Blumea balsamifera,
abrogates TRAIL resistance in leukemia cells, Blood. 15 January 2006,
Vol. 107, No. 2, pp. 679688
Junqueira, L.C., J. Carneiro and R.O. Kelley. 1995. Basic Histology. Appleton and
Lange Stanford.
Kumalasari, N. D. 2005. Pengaruh Berbagai Dosis Filtrat Daun Putri Malu
(Mimosa pudica) terhadap Kadar Glukosa Darah pada Tikus (Rattus
norvegicus). Skripsi tidak Diterbitkan. Malang: Program Studi Pendidikan
Biologi Jurusan MIPA FKIP UMM.
Munawaroh, F., Sudarsono, A.Yuswanto, 2015. Pengaruh pemberian ekstrak
etanolik daun sembung (blumeae folium) terhadap fagositosis makrofag
pada mencit jantan yang diinfeksi dengan Listeria monocytogenes.
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
Mursito, B. 2002. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Jantung. Penerbi t
Swadaya. Jakarta.

Nessa, F., Ismail, Z., Kurupiah, S., & Mohamed, N., 2005, RP-HPLC Method for
the Quantitative Analysis of Naturally Occurring Flavonoids in Leaves of
Blumea balsamifera DC, J Chromatogr Sci., 43 (8), 416-20
Osaki, N., Koyano, T., Kowithaya-korn, T.,Hayashi, M., Komiyama, K., &
Ishibashi,M., 2005, Sesquiterpenoids and Plasmin Inhibitory Flavonoids
from Blumea balsamifera, J Nat Prod, 68 (3), 447-9
Priyanto, D. 2000. Mandiri Belajar SPSS (Statistical Product and Service
Solution).Untuk Analisis Data & Uji Statistik. MediaKom. Jakarta.
Sherwood, L. 2001. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem. Ed.2. Jakarta.
 23

Soehadi, K. 2006. Diabetes Melitus Pria Profil Spermiogram, Hormon

Reproduksi dan Potensi Seks. Surabaya. Airlangga University Press.
Suweta, I Made. 2013. Ecolinguistics Approach in Preservation Rare Plants
Growing in Bali. International Journal of Linguistics, Vol. 5 No. 1 : 283-
295.
Tendean, O.S.2001. Reproduksi, Biologi Aspek Genetika. Analisa Semen dan
Imunopatologi Pria. Bagian Biologi FK Universitas Samratulangi.
Manado.
Widhiantara, 2010. Terapi Testosteron dan LH (Luteinizing Hormone)
meningkatkan Jumlah Sel Leydig Mencit yang Menurun Akibat Paparan
Asap Rokok. Tesis. Program Pasca Sarjana. Program Studi Ilmu Biomedik.
Universitas udayana. Denpasar.
Xu SB, Chen WF, Liang HQ, Lin YC, Deng YJ, Long KH., 1993, Protective
action of blumeatin against experimental liver injuries, Zhongguo Yao Li
Xue Bao Jul; 14(4):376-8. Available at: http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/Entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&
listuids=8249641&dopt= Abstrac. Opened: 3 June 2017
Solihati, N. Purwantara, B. Supriatna, I.Winarto, A. 2013. Perkembangan Sel-Sel
Spermatogenik dan Kualitas Sperma Pascapemberian Ekstrak Pegagan
(Centella asiatica). JITV 18(3): 192-201. DOI: 10.14334/jitv.v18i3.321.