1.

Judul : Kromatografi Kolom Cabe

2. Tujuan : Memahami Cara Analisa Komponen Kimia Tanaman dengan Kromatografi
Kolom
3. Prinsip : Memisahkan Zat-zat aktif
4. Teori :
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani RusiaMichael
Tsweet pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara
perkolasi esktrak petroleum eter dalam kolom gelas yangberisi kalsium karbonat (CaCo3).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering
digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis,
baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan,
industri, dan sebagainya. Kromatografi suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase
diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase)(Rohman, 2007).
Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada
adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile
phase).
Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik.Tujuan kromatografi
preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya
digunakan untuk pemurnian).Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui
perbandingan senyawa dalam campuran.
Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:
1. Analit adalah zat yang dipisahkan.
2. Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya
puncak karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
3. Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
4. Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
5. Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.
6. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
7. Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen
analit.
Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada
pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya
maupun hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan tarhadap kromatografi lapis
tipis sebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik
sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna (Kasiman, 2006).
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita
pada bagian atas kolom, penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau
bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak, dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran
yang disebabkan oleh gaya berat atau di dorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut
bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa
fraksi ketika keluar dari atas kolom (Sudjadi, 1986).
 Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan absorben, komponen
cairan lainya akan mengalir kebawah . Jadi semakin lemah kemungkinan cairan itu
teradsopsi semakin cepat komponen itu mengalir ke bawah. Bila kecepatan gerak cairan
itu lebih besar dari pada kecepatran absorbsi oleh absorben.
Kromatografi kolom dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh
kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah
dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi dan siap di pakai. Cuplikan
dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau
pada lapisan prapenjerap dan dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan
memvakumkannya. Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, kolom dihisap
sampai kering pada setiap pengumpulam fraksi (Sudjadi, 1986).
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak
digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam
jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering
digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion (Hargono, 1986).
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari
masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu
di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa
yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non
polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara
sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut /
dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan
khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom (Seno, 1997).
Cara pembuatannya ada dua macam (Hargono, 1986):
1 Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapaskemudian ditambahkan cairan pengelusi.
2 Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi
yangakan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding
kolom secarakontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran
kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat
eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel
dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh
kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam
kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran
dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang
keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat:
 Daya serap adsorben.
 Sifat pelarut.
 Suhu sistem kromotografi.
Kecepatan turunan sampel dipengaruhi oleh :
  Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat.
 Panjang absorben, makin panjan makin cepat turunnya senyawa.
 Ukuran artikel absorben.
 Rongga udara dalam absorben.
 Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan terganggu.
Faktor yang mempengaruhi proses pemisahan:
 Daya serap adsoben.
 Jenis / sifat eluen.
 Suhu kromatografi.
 Pelarut yang digunakan.
Klasifikasi Cabe :

 Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

 Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
 Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)
 Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
 Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)
 Sub Kelas : Asteridae
 Ordo : Solanales
 Famili : Solanaceae (suku terung-terungan)
 Genus : Capsicum
 Spesies : Capsicum annum L.

Cabai adalah tanaman yang termasuk ke dalam keluarga tanaman Solanaceae.

Tanaman yang berbuah pedas ini digunakan secara luas sebagai bumbu masakan diseluruh
dunia. Spesies tanaman ini yang paling sering digunakan meliputi Capsicum annum,
Capsicum frutescens, Capsicum chinense, Capsicum pubescens, dan Capsicum baccatum
(Tarigan dan Wiryanta 2003).

Ciri Morfologi Tanaman Cabe

Ciri morfologi dari jenis tanaman cabe ini, antara lain adalah sebagai berikut;

1. Daun
 Cabai memiliki bentuk daun yang bervariasi sesuai dengan spesies serta jenis
varietasnya. Bentuk daun dari cabai ada yang lonjong, bulat, dan lanset. Pada
permukaan bagian atas daun, terdapat warna hijau muda, hijau kebiru-biruan, hijau tua,
bahkan sampai hijau hampir kehitaman.Sedangkan pada bagian permukaan bawah daun
terdapat warna hijau, hijau pucat, bahkan sampai hijau muda. Permukaan daun cabai
ada yang berbentuk halus dan ada juga yang sedikit berkerut- kerut. Daun cabai
memiliki panjang dengan ukuran antara 3 sampai 11 cm serta lebar sekitar 1 sampai 5
cm.
2. Batang
Batang merupakan bagian terpenting pada tumbuhan yang ada diatas
permukaan tanah karena dapat mendukung bagian lain dari tanaman yaitu bagian daun,
bunga serta buah. Fungsi dari batang yaitu sebagai lintasan air dan mineral dari akar
menuju kedaun serta lintasan hasil dari fotosintesis daun ke seluruh bagian tubuh
tumbuhan.Selain itu pada pengertian batang ini juga merupakan bagian pembentuk dan
penyangga daun. Cabai merupakan tumbuhan perdu dengan batang tidak berkayu.
Batang cabai akan berkembang samapai dengan ketinggian tertentu kemudian akan
menghasilkan banyak cabang.
3. Akar
Tumbuhan cabai memiliki sistem perakaraan serabut dengan cabang akar yang
cukup banyak serta serabut pada bagian permukaan. Biasanya pada akar tanaman ini
terdapat bintil akar yang merupakan hasil simbiosis unsur N dengan sebagian
mikroorganisme. Akar tumbuhan cabai hanya dapat menembus tanah secara dangkal
dengan kedalaman 20 sampai 40 cm. Meski tumbuhan cabai tidak memiliki akar
tunggang akan tetapi ada sebagian akar yang berkembang ke arah bawah dan berfungsi
sebagai akar tunggang semu.
4. Bunga
Pengertian bunga pada tumbuhan cabai cukup beragam dan memiliki bentuk
yang hamper sama, yakni berbentuk bintang. Bunga cabai umumnya tumbuh pada
ketiak daun dengan keadaan tunggal dan juga bergerombol dalam satu tandan. Dalam
satu tandan umumnya hanya terdapat 2 atau 3 bunga. Panjang bunga kurang lebih 1
sampai 15 cm dan lebarnya 0,5 cm, serta panjang tangkainya kurang lebih 0,5 cm.
Bunga cabai adalah bunga sempurna yang mampu menyerbuk sendiri. Biasanya bunga
cabai terdiri dari 5 sampai 6 helai daun mahkota atau petal dengan warna putih atau
unggu. Untuk satu bunga terdapat satu kepala putik atau stigma yang berbentuk bulat.
Selain itu juga terdapat benang sari atau filamen yang masing-masing pada bagian
ujungnya terdapat satu antera berisi serbuk sari.
5. Buah
Buah cabai memiliki bentuk yang beragam yakni ada yang bulat serta bulat
memanjang dengan ujung runcing. Selain itu pada bagian bentuk dalamnya terdapat
polong dengan rongga diantara plasenta dan dinding buah. Untuk buah yang masih
muda memiliki warna putih agak kekuningan. Sedangkan untuk buah yang sudah tua
memiliki warna yang cukup mencolok yakni kuning dan merah licin serta mengkilap.
Warna buah tanaman cabai tergantung dari jenis varietasnya. Untuk buah yang masih
muda tidak terlalu berasa pedas namun ketika buah sudah tua memiliki rasa yang sangat
pedas dan menyengat. Panjang buah cabai kurang lebih 9 sampai 15cm dengan diameter
1 sampai 1,75 cm, dengan berat 7,5 sampai 15 gram per buah. Buah cabai menggantung
pada tangkai buah yang memiliki warna hijau dan panjang tangkai kurang lebih 3,5
sampai 4,5 cm yang keluar dari ketiak daun.
6. Biji
 Biji cabai memiliki ukuran yang cukup kecil dengan bentuk bulat dan pipih serta
memiliki warna putih atau krem. Biji ini memiliki jumlah yang cukup banyak dan
melekat pada plasenta yang berwarna putih. Biji cabai memiliki rasa yang sangat pedas
dan umumnya rasa cabai yang lebih pedas terdapat pada biji cabai tipe liar atau yang
tidak dibudidayakan.
5. Bahan dan Alat :
Alat
1. Kolom kromatografi
2. Statip dan klem
3. Tabung reaksi
4. Beaker glas
5. Batang pengaduk
6. Cawan penguap
7. Botol selai
8. Corong kaca
9. Saringan
10. Pipa kapiler
11. Plat KLT
12. Pipet saring
13. Kapas
14. Kertas alumunium foil
15. Oven
16. Waterbath

Bahan

1. Cabe
2. N-heksana
3. Etil asetat
4. Silika gel
5. Aquadest

6. Prosedur :
Pembuatan Ekstrak:
 Cabe dikeringkan dengan oven, setelah kering lalu di haluskan dengan blender.
 Serbuk ekstrak cabe 50 gram + pelarut (n.heksan) 1:6 lalu rendam selama 5 hari
 Setelah 5 hari lalu saring dengan kertas saring (3x)
 Tuang kedalam cawan penguap dan uapkan sampai kental

Orientasi dengan KLT

 Dalam botol selai

 Eluen : campuran n-heksan : etil asetat (9:1, 8:2, 7:3) sebanyak 10 ml
 Jenuhkan selama 15 menit.
 Lalu ekstrak kental di totolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke Plat KLT lalu
masukkan kedalam botol selai yang berisi eluen
  Setelah itu lihat hasil KLT dengan mata telanjang, lalu dengan UV dan tentukan eluen
terbaik, setelah mendapatkan eluen terbaik buatlah lebih banyak yaitu 100 ml

Pemisahan Kromatografi Kolom

 Siapkan kolom kromatografi

 Bilas dengan n-heksana
 Masukkan kapas kedalam kolom
 Pembuatan silika gel (15 g):
Dalam bekerglass masukkan silika gel + n-Heksan, aduk sampai menjadi bubur, lalu
masukkan kedalam kolom sedikit demi sedikit kedalam kolom kromatografi
 Pembuatan bahan :
Ekstrak + beberapa tetes n-Heksana + silika gel, lalu aduk sampai kering seperti
serbuk lalu masukkan kedalam kolom kromatografi.
 Masukkan eluen terbaik kedalam kolom kromatografi, lalu amati jika terjadi
pemisahan dalam kolom kromatografi, dicatat karena warnanya berbeda-beda, lalu
tampung (4 fraksi)
 Setiap fraksi diuapkan sampai kental
 Lalu lakukan kembali penotolan dengan eluen terbaik
 Bandingkan bercaknya.

7. Pengamatan dan Hasi

Prosedur Hasil
Pembuatan Ekstrak
 Cabe dikeringkan dengan
oven, setelah kering lalu di
haluskan dengan blender.
 Serbuk ekstrak cabe 50
gram + pelarut (n.heksan)
1:6 lalu rendam selama 5
hari
 Setelah 5 hari lalu saring
dengan kertas saring (3x)
 Tuang kedalam cawan
penguap dan uapkan
sampai kental

Orientasi dengan KLT Didapat eluen terbaiknya yaitu 8:2 (n-Heksana :

 Dalam botol selai Etil asetat)
 Eluen : campuran n-heksan
: etil asetat (9:1, 8:2, 7:3)
sebanyak 10 ml
 Jenuhkan selama 15 menit.
 Lalu ekstrak kental di
totolkan dengan
menggunakan pipa kapiler
ke Plat KLT lalu masukkan
kedalam botol selai yang
berisi eluen
  Setelah itu lihat hasil KLT
dengan mata telanjang, lalu
dengan UV dan tentukan
eluen terbaik, setelah
mendapatkan eluen terbaik
buatlah lebih banyak yaitu
100 ml

Pemisahan Kromatografi Kolom

 Siapkan kolom
kromatografi
 Bilas dengan n-heksana
 Masukkan kapas kedalam
kolom
 Pembuatan silika gel (15
g):
Dalam bekerglass
masukkan silika gel + n-
Heksan, aduk sampai
menjadi bubur, lalu
masukkan kedalam kolom
sedikit demi sedikit
kedalam kolom
kromatografi
 Pembuatan bahan :
Ekstrak + beberapa tetes n-
Heksana + silika gel, lalu
aduk sampai kering seperti
serbuk lalu masukkan
kedalam kolom
kromatografi.
 Masukkan eluen terbaik
kedalam kolom
kromatografi, lalu amati
jika terjadi pemisahan
dalam kolom kromatografi,
dicatat karena warnanya
berbeda-beda, lalu
tampung (4 fraksi)
 Setiap fraksi diuapkan
sampai kental
 Lalu lakukan kembali
penotolan dengan eluen
terbaik
 Bandingkan bercaknya.
 Perhitungan Eluen Terbaik:

𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝑵𝒐𝒅𝒂
𝑹𝒇 = 𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒆𝒎𝒑𝒖𝒉 𝒑𝒆𝒍𝒂𝒓𝒖𝒕

a. Eluen 9:1
𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝑵𝒐𝒅𝒂
𝑹𝒇 =
𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒆𝒎𝒑𝒖𝒉 𝒑𝒆𝒍𝒂𝒓𝒖𝒕

b. Eluen 8:2

𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝑵𝒐𝒅𝒂
𝑹𝒇 =
𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒆𝒎𝒑𝒖𝒉 𝒑𝒆𝒍𝒂𝒓𝒖𝒕

c. Eluen 7:3
𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝑵𝒐𝒅𝒂
𝑹𝒇 =
𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒆𝒎𝒑𝒖𝒉 𝒑𝒆𝒍𝒂𝒓𝒖𝒕

Perhitungan hasil pemisahan kromatografi kolom

a. Fraksi 1
3,5
Rfa1 = = 1 𝑐𝑚
3,5
2,85
Rfa2 = = 0,81 𝑐𝑚
3,5
4,8
Rfa3 = = 1,37 𝑐𝑚
3,5

2
Rfb1 = = 0,57 𝑐𝑚
3,5
3,4
Rfb2 = = 0,97 𝑐𝑚
3,5
4,8
Rfb3 = = 1,37 𝑐𝑚
3,5

b. Fraksi 2
c. Fraksi 3
d. Fraksi 4
8. Pembahasan