Mikrobiologi

1
Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri (2019)
LAPORAN RESMI
ISOLASI MIKROORGANISME DARI SUATU CAMPURAN DAN UJI

BIOKIMIA
1. TUJUAN PERCOBAAN
1.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
Mempelajari isolasi mikroorganisme dari suatu campuran dengan teknik cawan gores
dan cawan tuang.
1.2 Uji Biokimia
1.2.1 Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F Test)
Mempelajari kemampuan mikroorganisme dalam mengkatabolisme, apakah berlangsung
secara oksidatif atau fermentatif.
1.2.2 Uji Katalase
Mempelajari dimiliki atau tidaknya enzim katalase pada suatu mikroorganisme.
1.2.3 Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test)
Mempelajari dihasilkan atau tidaknya asam organik oleh suatu mikroorganisme.
2. HASIL PENGAMATAN
2.1.1 Metode Cawan Gores
Tabel 1. Hasil Pengamatan Isolasi Menggunakan Metode Cawan Gores
Hasil Pengamatan
24 Jam Sektor 0 Sektor 1 Sektor 2 Sektor 3
Blanko
Bentuk
koloni jika
dilihat dari :
- Atas
keseluruhan
Laboratorium Mikrobiologi
Departemen Teknik Kimia FTI-ITS
2
- Atas tepi
- Permukaan
(samping)
Keterangan :
- Warna Putih Putih - Putih
- Diameter 0.8 cm 0.3 cm Belum tumbuh 0.05 cm
- Kepekatan Pekat Pekat - Pekat
Hasil Pengamatan
48 Jam Sektor 0 Sektor 1 Sektor 2 Sektor 3
Blanko
Bentuk
koloni jika
dilihat dari :
- Atas
keseluruhan
- Atas tepi
3
- Permukaan
(samping)
Keterangan :
- Warna Putih Putih Putih Putih
- Diameter 1 cm 0.8 cm 0.7 cm 0.6 cm
- Kepekatan Pekat Pekat Pekat Pekat
2.1.2 Metode Cawan Tuang

Tabel 2. Hasil Pengamatan Isolasi Menggunakan Metode Cawan Tuang
Hasil Pengamatan
24 Jam Petridish 1 Petridish 2 Petridish 3
Blanko
Bentuk koloni
jika dilihat
dari :
- Atas
keseluruhan
Keterangan :
- Warna Putih Putih Putih
- Diameter 0.9 cm 0.7 cm 0.2 cm
- Kepekatan Pekat Pekat Pekat
Hasil Pengamatan
4
48 Jam Petridish 1 Petridish 2 Petridish 3
Blanko
Bentuk koloni
jika dilihat
dari :
- Atas
keseluruhan
Keterangan :
- Warna Putih Putih Putih
- Diameter 1.5 cm 1 cm 0.4 cm
- Kepekatan Pekat Pekat Pekat
2.2 Uji Biokimia

2.2.1 Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F Test)
Tabel 3. Hasil Pengamatan Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F Test)
Waktu Hasil Pengamatan
Keterangan
Pengamatan Tanpa Parafin Dengan Parafin
24 Jam Blanko
5
Zymomonas sp.
Terjadi perubahan warna Terjadi perubahan warna

(hijau ke kuning) (hijau ke kuning)
24 Jam
Acetobacter sp.
Terjadi perubahan warna Terjadi perubahan warna

(hijau ke kuning) (hijau ke kuning)
48 Jam Blanko
6
Zymomonas sp.
Berubah (memekat) Berubah (memekat)
48 Jam
Azotobacter sp.
Berubah (memekat) Berubah (memekat)
2.2.2 Uji Katalase

Tabel 4. Hasil Pengamatan Uji Biokimia Katalase
Mikroorganisme Uji Katalase
Zymomonas sp. Terdapat gelembung (+)
Acetobacter sp. Terdapat banyak gelembung (++)

Tabel 5. Hasil Pengamatan Uji Biokimia MR-VP Test
Waktu
Mikroorganisme Uji MR Uji VP
Pengamatan
7
Zymomonas sp.
Berubah warna menjadi Berubah warna menjadi

merah keruh
(+) (+)
24 jam
Acetobacter sp.

merah keruh
(+) (+)
8
Zymomonas sp.

merah kuning
48 jam (+) (-)
Acetobacter sp.

merah kuning
(+) (-)
3. PEMBAHASAN
Percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran bertujuan untuk mempelajari

isolasi mikroorganisme dari suatu campuran dengan teknik cawan gores dan cawan tuang.
Kedua teknik ini merupakan teknik mengisolasi satu jenis bakteri dari suatu larutan atau biakan
campuran yang tersusun dari beberapa jenis mikroorganisme.
Secara alami, mikroba di alam ditemukan dalam populasi campuran. Untuk memperoleh
biakan murni dapat dilakukan isolasi. Proses isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba satu
dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba untuk dapat mempelajari
sifat biakan, morfologi, dan sifat mikroba lainnya. Terdapat banyak metode untuk mengisolasi
mikroorganisme, dua yang umum digubakan adalah metode cawan gores dan cawan tuang.
9
(Benson, 2001 : 82)

Inokulasi merupakan suatu kegiatan pemindahan suatu mikroorganisme dari tempat atau
sumber asalnya menuju medium baru. Mikroorganisme yang dipindahkan spesifik terhadap
media baru tersebut karena diharapkan dengan pemindahan ini didapatkan sebuah kultur alami
yang hanya terdapat satu jenis mikroorganisme yang dapat hidup. Terdapat beberapa metode
inokulasi antara lain metode gores, tebar, tusuk, dan metode tuang.
(Jennings, 2012 : 1)
Teknik aseptik menjaga proses inokulasi mikroorganisme dari kontaminasi oleh
mikroorganisme lain maupun kontaminasi biakan kepada manusia. Teknik ini meliputi sebelum
proses pengambilan biakan induk, jarum ose dibakar sampai memijar dari ujung hingga
pangkalnya sebelum didinginkan hingga membara dengan tujuan kawat ose yang digunakan
dalam keadaan steril sehingga biakan induk yang diambil tidak terkontaminasi dengan zat
asing. Jarum ose yang panas tidak boleh langsung dimasukkan dalam mikroorganisme indukan
karena jika masih panas ujung jarum dapat mematikan mikroorganisme. Setelah mendinginkan
jarum ose, kemudian mengambil mikroorganisme indukan yang terdapat di dalam tabung
reaksi. Kemudian memindahkannya ke media yang baru. Sebelum dan sesudah mengambil
bakteri, mulut tabung reaksi dipanaskan di sekitar bunsen. Hal ini bertujuan untuk mensterilkan
zat-zat asing yang kemungkinan terdapat di daerah sekitar tabung reaksi.
(Benson, 2001 : 69-71)
Laminar flow adalah alat yang digunakaan untuk menciptakan lingkungan yang terkontrol
kelas udaranya. Kelas udara yang bersih diperoleh dengan menyaring udara yang masuk dalam
ruang laminar menggunakan pre filter dan HEPA filter yang mempunyai efisiensi penyaringan
yang tinggi. Laminar air flow adalah meja kerja steril untuk melakukan kegiatan inokulasi atau
penanaman. Disebut dengan laminar air flow karena dapat meniupkan udara steril secara
kontinu melewati tempat kerja sehingga bebas dari mikroorganisme yang mungkin jatuh. Aliran
udara berasal dari udara ruangan yang ditarik melalui filter pertama (pre filter) yang kemudian
dikeluarkan melalui filter yang sangat halus (HEPA / High Efficiency Particular Air Filter).
(Favero, 1968 : 1)
Salah satu metode sterilisasi adalah uap bertekanan tinggi menggunakan autoclave.
Sterilisasi pada autoclave paling efektif ketika organisme berkontak langsung dengan uap air.
Dalam kondisi tertentu, uap air pada tekanan 15 psi (121oC) akan membunuh semua
mikroorganisme dan endosporanya dalam waku sekitar 15 menit. Sterilisasi dimaksudkan agar
segala macam mikroorganisme yang tidak diinginkan dalam peralatan mati, sehingga tidak
mengganggu biakan mikroorganisme yang diinokulasikan.
(Tortora, 2010 : 188)
10
a. Metode Cawan Gores

Metode cawan gores dipakai untuk memisahkan suatu koloni (satu spesies) dari suatu
campuran bakteri menjadi biakan murni. Dengan menginokulasikan medium agar nutrient
dengan metode cawan gores, sel-sel itu akan terpisah sendiri–sendiri. Setelah inkubasi. Sel-sel
mikroba individu memperbanyak diri kemudian terbentuknya massa sel yang dapat dilihat dan
dinamakan koloni.
(Pelczar, 1986 : 137)
Metode cawan gores memiliki keunggulan menghemat waktu dan material. Namun, untuk
memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan menggores yang baik.
(Benson, 2001 : 82)
Ada beberapa pola dalam metode gores antara lain:
Gambar 1. Macam-macam goresan
(Benson, 2001 : 85)

Langkah pertama percobaan ini adalah menyiapkan satu buah petridish. Petridish dibagi
menjadi 4 sektor yaitu sektor 0, I, II, dan sektor III. Ilustrasi pembagian sektor pada petridish
adalah sebagai berikut:
11
Gambar 2. Pembagian sektor pada petridish

Langkah kedua adalah mengambil dan menuangkan media PDA ke dalam petridish kurang
lebih sampai memenuhi setengah volume. PDA (Potato Dextrose Agar) merupakan media
tumbuh yang dianjurkan untuk isolasi jamur dan ragi. Media PDA ini berwarna krem hingga
kuning dengan komposisi 200.000 gr kentang, 20.000 gr Dextrose, dan 15.000 gr agar.
(http://himedialabs.com /TD/M096.pdf )
Pemilihan media agar adalah karena agar tidak dapat diuraikan oleh hampir semua jenis
mikroorganisme, agar tetap berbentuk padat pada kisaran suhu inkubasi yang luas (0 – 80C)
dan agar mencair pada titik didih air, tetapi tidak segera memadat pada suhu pendinginan 42C.
(Levine, 1954 : 77)
Langkah ketiga adalah membungkus petridish berisi media dengan kertas coklat, bagian
kertas yang licin berada di bagian luar. Hal ini bertujuan agar bagian dalam petridish tidak
terbasahi oleh uap air ketika di dalam autoclave. Kemudian, mensterilkan petridish berisi media
PDA dahulu menggunakan autoclave.
Setelah proses sterilisasi, petridish didiamkan hingga media PDA di dalamnya memadat.
Lalu, membuka kertas coklat yang membungkus petridish dan melakukan inokulasi secara
aseptik dengan metode gores. Pola goresan yang diterapkan adalah kuadran seperti pada metode
B gambar III.1. Pada percobaan ini, penggoresan dimulai dari sektor 0 lalu ke sector I, II dan
terakhir sektor III. Setiap akan berpindah sektor dalam menginokulasi jarum ose terlebih dahulu
dipanaskan menggunakan Bunsen.
Mikroorganisme yang akan diisolasi pada percobaan adalah suspensi yang terdiri dari
Rhizopus sp dan Aspergillus niger dengan perbandingan 3:1.
Rhizopus sp mempunyai ciri-ciri koloni abu-abu kecoklatan dengan tinggi 1 mm atau
lebih. Sporangiofor tunggal atau dalam kelompok dengan dinding halus atau agak sedikit kasar,
dengan panjang lebih dari 1000 μm dan diameter 10-18 μm. Sporangia globosa yang pada saat
masak berwarna hitam kecoklatan, dengan diameter 100-180 μm. Klamidospora banyak,
tunggal atau rantaian pendek, tidak berwarna, dengan berisi granula, terbentuk pada hifa,
sporangiofor dan sporangia. Bentuk klamidospora globosa, elip atau silindris dengan ukuran 7-
12
30 μm atau 12-45 μm x 7-35 μm. Rhizopus sp dapat tumbuh optimum pada suhu 30-35 °C,
dengan suhu minimum 12 °C, dan suhu maksimum 42 °C.
(Wipradnyadewi, 2004 : 2)
Karakteristik morfologi jamur Aspergillus niger secara makroskopis koloni jamur
Aspergillus niger berbentuk bulat, berwarna coklat kehitaman dengan tepi rata dan agak kasar.
Secara mikroskopis hifanya tak bersepta, setiap konidiofor menyongkong satu konidia. Konidia
memiliki ciri yaitu berbentuk bulat dengan konidiofor panjang berbentuk silinder, serta tidak
berwarna (hialin).
(Wahdania, 2016 : 7)
Selanjutnya petridish yang berisi biakan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30°C.
Pada proses inkubasi, petridish diletakkan dalam posisi terbalik yaitu tutup petridish diletakkan
di bawah. Media PDA memiliki kandungan aquadest yang ikut menguap saat proses sterilisasi.
Setelah sterilisasi, uap yang terperangkap dalam petridish berubah menjadi embun di bagian
tutup. Oleh karena itu, petridish perlu dibalik agar ketika disimpan dalam inkubator, uap air
yang terkondensasi tidak jatuh ke atas permukaan media. Suhu pada proses inkubasi
disesuaikan dengan suhu optimum untuk pertumbuhan mikroorganisme.
Setelah proses inkubasi selama 24 jam dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan
mikroorganisme. Pada sektor 0 terlihat pertumbuhan mikroorganisme berwarna putih yang
sangat pekat. Pada sektor I terlihat adanya mikroorganisme dari berwarna putih lanjutan dari
sektor 0. Pada sektor II tidak terlihat pertumbuhan mikroorganisme. Pada sektor III tedapat
sedikit pertumbuhan mikroorganisme yang merupakan lanjutan dari sektor 0.
Setelah proses inkubasi selama 48 jam dilakukan pengamatan yang kedua. Tidak tampak
perubahan koloni pada sektor 0. Pada sektor I dan III koloni tampak lebih lebar sehingga
menutupi seluruh bagian sektor. Pada sektor II mulai terlihat pertumbuhuan mikroorganisme
berwarna putih. Pada kedua pengamatan hanya ada satu jenis mikroorganisme yang tumbuh.
Dari pengamatan ciri morfologinya, diketahui bentuk mikroorganisme sesuai ciri-ciri morfologi
Rhizopus sp dengan diameter 2 cm. Aspergillus niger tidak tumbuh sama sekali karena
perbandingannya lebih sedikit. Selain itu, Aspergillus niger lebih cocok pada media NBA. Hasil
pengamatan dapat dilihat pada tabel 1.
b. Metode Cawan Tuang
Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroba ialah dengan
mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah disterilkan dan dicairkan kemudian
didinginkan 50°C yang kemudian dituang ke cawan. Karena kadar sel-sel mikroba di dalam
spesimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan
beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan-cawan tersebut mengandung
13
koloni-koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan
bahan dan waktu, namun tidak memerlukan ketrampilan yang terlalu tinggi.
(Salmah, 2004 : 3)
Untuk memulai proses isolasi mikroorganisme menggunakan teknik cawan tuang,
langkah pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan alat yang digunakan. Peralatan tersebut
antara lain tiga buah tabung reaksi dan tiga buah petridish, kertas coklat, kapas lemak, dan
media PDA. Dalam percobaan ini, mikroorganisme yang akan diisolasi sama dengan pada
metode cawan gores, suslensi yang terdiri dari Rhizopus sp dan Aspergillus niger dengan
perbandingan 3:1.
Langkah kedua adalah memberi label pada tabung reaksi dan petridish masing-masing
angka 1, 2, dan 3. Ketiga tabung reaksi diisi dengan media PDA sebanyak ½ hingga 2/3 dari
tinggi tabung, lalu ditutup dengan sumbat kapas. Tabung reaksi disumbat dengan kapas
berlemak agar uap air tidak masuk saat dilakukan sterilisasi di dalam autoclave karena jika
masuk maka akan terjadi kontaminasi pada media dan mengganggu pertumbuhan
mikroorganisme. Selain itu, penyumbatan juga untuk mencegah pengotor dari udara masuk
sehingga media bisa lebih steril. Penyumbatan menggunakan kapas karena jika digunakan
bahan lain yang kedap udara, mikroorganisme yang akan diinokulasi tidak bisa melakukan
respirasi. Ketiga petridish dibungkus dengan kertas coklat dengan bagian licin di luar. Langkah
berikutnya adalah mensterilkan petridish dan tabung reaksi berisi media PDA menggunakan
autoclave. Setelah proses sterilisasi, tabung reaksi yang berisi media didiamkan hingga suhunya
menurun, tidak terlalu panas namun media PDA dijaga agar tidak membeku. Kemudian
dilakukan inokulasi suspensi mikroorganisme secara aseptik dengan metode cawan tuang.
Gambar 3. Skema Metode Cawan Tuang

(Benson, 2001 : 86)
14
Metode cawan tuang dimulai dengan mengambil satu lup suspensi biakan campuran lalu
memindahkan ke tabung reaksi 1. Inokulum dicampurkan sampai merata dengan memutarkan
tabung reaksi diantara kedua telapak tangan. Kemudian mengambil satu lup biakan dari tabung
reaksi 1 ke tabung reaksi 2 dan kembali dicampurkan hingga merata. Langkah ini diulang dari
tabung reaksi 2 ke tabung reaksi 3. Jika sudah selesai, media yang telah diinokulasi dituang ke
petridish sesuai penomorannya : dari tabung reaksi 1 ke petridish 1, begitu pula seterusnya.
Setelah proses inokukasi, ketiga petridish ditutup dengan kertas coklat dan dimasukkan ke
dalam inkubator.
Setelah proses inkubasi selama 24 jam dilakukan pengamatan pertama. Pada petridish I
tampak koloni bulat berwarna putih, pekat, menyebar di permukaan media. Pada petridish II
menampakkan satu koloni dengan ciri-ciri seperti pada petridish I, tetapi tidak terlalu menyebar,
sedangkan petridish III belum ada koloni.
Setelah 48 jam dilakukan pengamatan yang kedua. Pada petridish I terlihat koloni
berwarna keseluruhan putih keruh bulat, antar sel jaraknya saling berdekatan, pekat, dan
diameter koloni adalah 1.5 cm dengan penampakan koloni yang menyebar di seluruh
permukaan media. Pada petridish II, warna koloni adalah putih, diameter koloni 1 cm, dan
dengan kepekatan yang sedikit berkurang. Pada petridish III hanya ada sedikit bulatan,
berwarna putih, dengan diameter 0,4 cm. Sama dengan pada cawan gores, mikroorganisme
yang terisolasi disini lebih mengarah pada Rhizopus sp mengingat warna koloni yang
keseluruhan putih karena masih muda dan koloni berbentuk bulat (globulus). Hasil pengamatan
dapat dilihat pada tabel 2.
(Wipradnyadewi, 2004 : 2)
3.2 Uji Biokimia
3.2.1 Uji Oksidasi Fermentasi (O-F Test)
O-F Test bertujuan untuk mempelajari kemampuan mikroorganisme dalam
mengkatabolisme, apakah berlangsung secara oksidatif atau fermentatif. Mikroorganisme yang
diuji adalah Acetobacter sp dan Zymomonas sp.
O-F Test didesain untuk membedakan metabolisme karbohidrat pada mikroorganisme.
Secara oksidatif, karbohidrat langsung dioksidasi menjadi pirufat dan selanjutnya dikonversi
menjadi karbon dioksida dan energi melalui siklus Krebs dan transpor elektron. Secara
fermentatif, karbohidrat juga dikonversi menjadi pirufat namun digunakan untuk memproduksi
satu atau lebih asam.
(Leboffe, 2010 : 155)
15
Media pada O-F Test, Hugh and Leifson’s, terbuat dari 2.0 g pepton, 5.0 g natrium klorida,
0.3 g kalium fosfat, 2.5 g agar, 0.08 g Bromthymol blue, 10.0 g glukosa, dan 1.0 liter aquadest.
pH dari media adalah 6.6 – 7.0 pada 25°C.
(Leboffe, 2010 : 156)
Prinsip O-F Test adalah mikroorganisme diinokulasikan pada dua tabung reaksi berisi
media Hugh and Leifson’s. Salah satu media kemudian ditutup menggunakan minyak steril
untuk menciptakan kondisi anaerob. Sementara itu, media kedua dibiarkan terbuka sebagai
kondisi aerob. Organisme yang dapat memfermentasi atau memfermentasi dan mengoksidasi
karbohidrat akan mengubah warna media terbuka dan tertutup yang semula hijau menjadi
kuning. Organisme yang mampu mengoksidasi saja akan mengubah warna media terbuka
menjadi kuning. Organisme fermentatif yang lemah akan mengubah warna kedua media di
bagian atas. Organisme yang tidak dapat memetabolisme karbohidrat tidak menunjukkan
perubahan warna pada media.
(Leboffe, 2010 : 155)
Media Hugh Leifson mengandung Bromtimol biru (BTB) yang merupakan indikator pH.
Trayek pH BTB adalah 6.0 – 7.1 dengan perubahan warna kuning ke hijau. Perubahan warna
media dari hijau menjadi kuning menunjukkan terbentuknya asam dari proses metabolisme
organisme.
(Leboffe, 2010 : 155)
Mikroorganisme diklasifikasikan menjadi lima kelompok utama berdasarkan kebutuhan
oksigen.
1. Aerob obligat – hanya tumbuh dengan keberadaan oksigen sebagai penerima elektron dalam
proses respirasi aerobik.
2. Anaerob fakultatif – dapat tumbuh dengan atau tanpa oksigen, namun tumbuh lebih baik
dengan keberadaan oksigen.
3. Mikroaerofil – membutuhkan oksigen dengan konsentrasi kecil yaitu 2-10% (v/v) untuk
biosintesis senyawa tertentu. Tidak dapat hidup pada konsentrasi oksigen atmosfir 21%
(v/v).
4. Anaerob aerotoleran – cenderung menghindari oksigen dan tumbuh baik dengan atau tanpa
oksigen.
5. Anaerob obligat – mati karena keberadaan oksigen.
(Waites, 2001 : 34-35)
16
Gambar 4. Pertumbuhan bakteri pada tabung reaksi pada medium padat

(a) Aerob obligat, (b) Anaerob fakultatif, (c) Anaerob obligat, (d) Aerotoleran,
(e) Mikroaerofil
(Tortora, 2010 : 161-162)
Langkah pertama percobaan adalah mensterilisasi 6 buah tabung reaksi yang telah
disumbat dengan kapas lemak menggunakan autoclave. Setelah proses sterilisasi, memasukkan
media Hugh Leifson ke dalam 6 buah tabung reaksi tersebut hingga 1/3 tinggi tabung.
Sebelumnya, media Hugh Leifson dipanaskan pada penangas sebagai bentuk sterilisasi. Media
disterilisasi terpisah untuk menghemat waktu dalam menurunkan suhu sehingga inokulasi dapat
dilakukan lebih cepat.
Langkah selanjutnya adalah menginokulasi Acetobacter sp dan Zymomonas sp, masing-
masing ke dalam dua media, secara aseptik. Metode inokulasi yang digunakan adalah metode
tusuk, yaitu dengan menusukkan jarum ose beserta biakan hingga dasar tabung berisi media
yang masih cair. Tabung reaksi yang diinokulasikan mikroorganisme hanya empat buah, dua
tabung lainnya digunakan sebagai pembanding (blanko). Setelah inokulasi, menambahkan + 1
cm paraffin cair ke dalam satu tabung setiap variabel, termasuk salah satu blanko.
Berikutnya memasukkan inokulum ke dalam inkubator pada 30°C. Setelah 24 jam
dilakukan pengamatan. Hasil pengamatan menunjukkan media terbuka berisi biakan
Acetobacter sp berubah warna hijau menjadi kuning, pada media tertutup juga terjadi perubahan
warna. Tabung reaksi terbuka berisi Zymomonas sp berubah warna hijau menjadi kuning, begitu
pula dengan tabung tertutup. Sementara itu, blanko tertutup maupun tetutup berubah warna
juga.
Setelah 48 jam dilakukan pengamatan kembali. Hasil pengamatan menunjukkan media
terbuka dan media tertutup berisi biakan Acetobacter sp warna kuningnya semakin memekat.
Tabung reaksi terbuka dan tertutup berisi Zymomonas sp warna kuningnya juga semakin
memekat. Sementara itu, blanko terbuka maupun tertutup berubah warna juga.
Dari hasil pengamatan, dapat dilihat pada Tabel 3, dapat diketahui bahwa kedua
mikroorganisme memiliki sifat yang sama bila ditinjau dari kemampuanya untuk melakukan
metabolisme karbohidrat secara aerob maupun anaerob. Pada blanko tidak terdapat
mikroorganisme sehingga tidak terjadi proses metabolisme dan perubahan warna media.
17
Selain itu hasil pengamatan menunjukan bahwa Acetobacter sp dapat melaukan proses
metabolisme pada media tertutup atau anareob dan terbuka atau aerob. Sedangkan menurut
literature Acetobacter sp merupakan bakteri aerob obligat sehingga hanya dapat memproses
metabolisme pada keadaan aerob. Hal ini berbeda dengan hasil percobaan yang telah dilakukan.
(Ambarsari, 2015 : 2)
Selain itu hasil pengamatan menunjukkan Zymomonas sp dapat melakukan proses
metabolisme, ditinjau dari terjadinya perubahan warna pada kedua tabung baik tabung aerob
maupun tabung anaerob. Sesuai dengan literatur, Zymomonas sp adalah bakteri anaerob
fakultatif yang dapat melakukan proses metabolisme baik pada keadaan aerob maupun anaerob.
(Akhmad, 2009 : 22)
Perbedaan hasil percobaan dan literatur ini dapat disebabkan karena media yang
kondisinya tidak cukup baik untuk digunakan pada percobaan, sehingga dapat menyebabkan
mikroba tidak berkembang pada media tersebut dan tabung reaksi tidak tertutup dengan baik
oleh parafin
(Belaîch, 1965 : 1195)
3.2.2 Uji Katalase
Uji katalase bertujuan untuk mempelajari dimiliki atau tidaknya enzim katalase pada
suatu mikroorganisme.
Rantai transpor elektron pada mikroorganisme yang bersifat aerobik dan fakultatif
tersusun dari molekul-molekul yang mampu menerima dan mendonorkan elektron. Molekul-
molekul tersebut berganti dari bentuk teroksidasi ke tereduksi, meneruskan elektron hingga
penerima elektron terakhir. Energi yang hilang dalam proses perpindahan ini digunakan untuk
proses fosforilasi oksidatif (memproduksi ATP dari ADP).
Suatu molekul dalam transpor elektron, disebut flavoprotein, dapat meneruskan elektron
langsung menuju oksigen. Jalur transportasi ini memiliki kelemahan yaitu menghasilkan dua
senyawa yang bersifat racun bagi sel— hidrogen peroksida (H2O2) dan superoksida radikal (O2-
). Namun, selama ini mikroorganisme dapat bertahan meski kedua racun tersebut terus
diproduksi. Hal ini terjadi karena mikroorganisme tersebut menghasilkan enzim superoksida
dismutase dan enzim katalase. Superoksida dismutase mengkatalis reaksi superoksida radikal
menjadi hidrogen peroksida. Sementara itu, katalase berperan dalam mengubah H2O2 menjadi
air dan oksigen.
Jadi, hidrogen peroksida dapat terbentuk selama transpor elektron dari oksidasi
flavoprotein dan konversi superoksida radikal oleh superoksida dismutase. Reaksinya sebagai
berikut:
18
Gambar 5. Pembentukan H2O2 dari oksidasi flavoprotein

dan konversi superoksida radikal
Sementara itu, reaksi perubahan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen oleh enzim
katalase adalah:
Gambar 6. Reaksi hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen

Ada tidaknya enzim katalase pada mikroorganisme dapat dengan mudah dideteksi dengan
menambahkan H2O2 pada suatu biakan. Mikroorganisme yang memiliki katalase akan segera
membentuk gelembung oksigen. Jika tidak terbentuk gelembung, maka mikroorganisme tidak
memiliki katalase.
(Leboffe, 2010 : 166)
Langkah pertama pada percobaan ini adalah mensterilkan object glass dengan alkohol,
kemudian menetesi sedikit H2O2 pada object glass mengambil sedikit biakan dari kultur agar
miring menggunakan pengaduk kaca. Mikroorganisme yang diuji pada percobaan ini ada dua
yaitu Acetobacter sp dan Zymomonas sp.
(Leboffe, 2010 : 165)
Pengambilan biakan tidak menggunakan jarum ose karena jarum ose terbuat dari logam
yang mudah tererosi dan menempel di mikroorganisme. Adanya logam menyebabkan hidrogen
peroksida bersifat oksidator kuat atau mengalami reduksi. Reduksi hidrogen peroksida hanya
menghasilkan H2O, sedangkan indikator uji katalase adalah gelembung oksigen.
(http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu)
Berdasarkan pengamatan, beberapa watu setelah penambahan H2O2 pada Acetobacter sp
maupun Zymomonas sp timbul gelembung-gelembung gas berwarna putih dan sangat kecil.
Gelembung pada Acetobacter sp jumlahnya lebih banyak. Hasil percobaan ini mengindikasikan
bahwa Zymomonas sp dan Acetobacter sp positif memiliki enzim katalase. Berdasarkan
literatur, enzim katalase terdapat pada mikroorganisme aerobik, mikroaerofil, dan anaerob
fakultatif. Hal ini sesuai dengan literature karena Acetobacter sp merupakan bakteri aerob
obligat sedangkan Zymomonas sp merupakan mikroorganisme anaerob fakultatif seperti yang
telah dibuktikan pada percobaan dan literatur O-F Test sebelumnya.
(Leboffe, 2010 : 165)
19

Percobaan Methyl-Red-Voges-Proskauer bertujuan untuk mempelajari dihasilkan atau
tidaknya asam organik oleh suatu mikroorganisme.
Methyl-Red Test merupakan tes kualitatif untuk mendeteksi produksi asam oleh
mikroorganisme yang tumbuh pada media menggunakan indikator pH methyl red. Indikator
tersebut memiliki trayek pH 4,4-6,2 dengan perubahan warna dari merah ke kuning. Setelah
penambahan beberapa tetes larutan methyl red, jika warna berubah menjadi merah, maka
diperoleh hasil tes yang positif. Sebaliknya, jika warna berubah menjadi kuning, maka hasil tes
adalah negatif.
(Leboffe, 2010 : 161)
Reaksi fermentasi asam suatu mikroorganisme adalah sebagai berikut:
Gambar 7. Proses Fermentasi Asam Mikroorganisme

(Leboffe, 2010 : 161)
Voges-Proskauer Test adalah tes kualitatif untuk mikroorganisme yang
memfermentasikan glukosa namun asam yang dihasilkan segera dikonversi menjadi acetoin
dan 2,3-Butanadiol. Penambahan reagen VP (reagen Barrit) akan mengoksidasi acetoin menjadi
diasetil, yang kemudian bereaksi dengan guanidin pada pepton (dari media MRVP)
menghasilkan warna merah. Uji VP positif ditunjukkan dengan warna merah yang
mengindikasikan fermentasi 2,3-Butanadiol (terbentuk acetoin). Tidak ada perubahan warna
(atau muncul warna kuning tembaga) menunjukkan hasil negatif.
(Leboffe, 2010 : 161)
Reagen Barrit terbuat dari (A) -naphtol sebanyak 5.0 g yang diencerkan dengan alkohol
murni hingga 100 mL dan (B) KOH 40.0 g yang diencerkan dengan aquadest hingga 100 mL.
(Leboffe, 2010 : 164)
20
Gambar 8. Reaksi Fermentasi 2,3-Butanadiol
Gambar 9. Reaksi Indikator pada VP Test

(Leboffe, 2010 : 162)
Untuk memulai MRVP Test ini, pertama menyiapkan peralatan antara lain empat tabung
reaksi, sumbat kapas, dan media MRVP. Media MRVP terbuat dari pepton, kalium fosfat,
glukosa (dextrose), dan aquadest.
(Leboffe, 2010 : 164)
Tabung reaksi yang telah disiapkan diisi media MRVP 5 mL atau 1/3 tinggi tabung.
Setelah itu, tabung reaksi tersebut ditutup menggunakan sumbat kapas lalu disterilisasi
menggunakan autoclave. Setelah proses sterilisasi selesai, tabung reaksi dikeluarkan dari
autoclave dan ditunggu beberapa saat sampai mendingin. Langkah berikutnya adalah
melakukan inokulasi mikroorganisme Acetobacter sp dan Zymomonas sp secara aseptik.
Metode inokulasi yang digunakan adalah metode tusuk karena media bersifat cair. Satu media
yang tidak diinokulasi menjadi media pembanding (blanko). Tabung reaksi lalu diinkubasi pada
30°C.
Setelah 24 jam, isi dari salah satu tabung masing-masing mikroorganisme dibagi menjadi
dua bagian. Tabung yang pertama ditetesi dengan methyl red sebanyak 4 tetes sedangkan tabung
yang kedua ditetesi dengan reagen alpha naphthol (Barrrit A) dan KOH (Barrit B) masing
masing sebanyak 4 tetes.
Hasil Pengamatan dapat dilihat pada tabel 4. MR pada kedua mikroorganisme
menunjukkan hasil positif yaitu muncul warna merah. Sedangkan uji VP pada kedua
mikroorganisme menunjukkan hasil positif yaitu muncul warna keruh.
Setelah 48 jam, MR pada kedua mikroorganisme menunjukkan hasil positif yaitu muncul
warna merah. Sedangkan uji VP pada kedua mikroorganisme menunjukkan hasil negtif yaitu
muncul warna kuning. Perbedaan bisa terjadi pada pengamatan 48 karena mikroorganisme yang
mati ketika dibiarkan atau media yang digunakan sudah tidak steril kembali.
4. KESIMPULAN
21
Isolasi mikroorganisme dengan teknik cawan gores dan cawan tuang dari suspensi
Rhizopus sp dan Aspergillus niger dengan perbandingan 3:1 menunjukan hasil mikroba
terisolasi berupa Rhizopus sp dengan ciri-ciri koloni berbentuk bulat, berwarna putih, dan
menyerupai hifa-hifa halus, sesuai dengan literature yang ada
4.2 Uji Biokimia
4.2.1 Uji Oksidasi Fermentasi (O-F Test)
Acetobacter sp dapat melakukan proses metabolisme pada media tertutup atau anareob
dan sebaliknya pada media terbuka atau aerob. Sedangkan menurut literature Acetobacter sp
merupakan bakteri aerob obligat sehingga hanya dapat memproses metabolisme pada keadaan
aerob. Zymomonas sp dapat melakukan proses metabolisme, ditinjau dari terjadinya perubahan
warna pada kedua tabung baik tabung aerob maupun tabung anaerob.
4.2.2 Uji Katalase
Acetobacter sp dan Zymomonas sp memiliki enzim katalase dibuktikan dengan
munculnya gelembung gas setelah penetesan hidrogen peroksida di atas mikroorganisme, hal
ini sesuai dengan literature yang ada.
Acetobacter sp dan Zymomonas sp menghasilkan asam organik, dibuktikan dengan
perubahan warna menjadi merah pada uji MR. Terbentuk acetoin dari fermentasi 2,3-
Butanadiol karena uji VP menunjukan hasil yang positif, hal ini sesuai dengan literature yang
ada.
22
5. DAFTAR PUSTAKA
Akhmad. 2009. Studi aktivitas Zymomonas mobilis Pada Produksi Ethanol Pada Buah Jambe.
Surakarta : UNS
Belaîch, Jean-Pierre dan Jacques C. Senez. 1965. Influence of Aeration and of Pantothenate on
Growth Yields of Zymomonas mobilis. American Society for Microbiology.
Benson. 2001. Microbiological Applications : Laboratory Manual in General Microbioloby
eight edition. California: The McGraw−Hill Companies.
Favero, Martin. 1968. Use of Laminar Air-Flow Equipment in Microbiology. USA : American
Jennings, John. 2012. Forage Legume Inoculation. USA : University of Arkansas
Leboffe, Michael J. and Burton E. Pierce. 2010. Microbiology Laboratory Theory and
Application third edition. Colorado : Morton Publishing
Levine, Max. 1954. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. New York: The
Macmillan Company.
Pelczar, Michael J dan E.C.S Chan. 1986. Mikrobiology. New Delhi : Tata McGraw-Hill
Publishing Ltd.
Salmah. 2004. Analisa Pertumbuhan Mikroba Pada Fermentasi. Medan: Universitas Sumatra
Utara.
Tortora, Gerard J. , Berdel R. Funke and Christine L. Case. 2010. Microbiolgy: an Introduction-
10th edition. San Francisco: Pearson Education, Inc.
Wahdania,Indah. 2016. Aspergillus niger Inhibition Test on a Variety of Carrier Materials
Againts Phytophthora palmivora Cause Rottennes of Cacao (Theobroma cacao L.). Palu:
Universitas Tadulako
Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S., dan Higton, G., 2001, Industrial Microbiology : An
Introduction, 23-25, Blackwell Science Ltd, Oxford.
Wipradnyadewi, P. A. S., dkk. 2004. Isolasi dan Identifikasi Rhizopus sp pada Beberap
Inokulum Tempe.
http://himedialabs.com /TD/M096.pdf . (diakses pada Selasa, 26 Maret 2018 pukul 00.41
WIB)
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu. Standard Electrode Potentials in Aqueous Solution at
25°C. (diakses pada Selasa, 26 Maret 2018 pukul 00.46 WIB)

Mikrobiologi

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Mikrobiologi

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

1

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri (2019)

ISOLASI MIKROORGANISME DARI SUATU CAMPURAN DAN UJI

2.1.2 Metode Cawan Tuang

48 Jam Petridish 1 Petridish 2 Petridish 3

2.2 Uji Biokimia

Terjadi perubahan warna Terjadi perubahan warna

Terjadi perubahan warna Terjadi perubahan warna

Berubah (memekat) Berubah (memekat)

Berubah (memekat) Berubah (memekat)

2.2.2 Uji Katalase

Acetobacter sp. Terdapat banyak gelembung (++)

2.2.3 Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test)

Berubah warna menjadi Berubah warna menjadi

Berubah warna menjadi Berubah warna menjadi

Berubah warna menjadi Berubah warna menjadi

Berubah warna menjadi Berubah warna menjadi

Percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran bertujuan untuk mempelajari

(Benson, 2001 : 82)

a. Metode Cawan Gores

Ada beberapa pola dalam metode gores antara lain:

Gambar 1. Macam-macam goresan

(Benson, 2001 : 85)

Gambar 2. Pembagian sektor pada petridish

Gambar 3. Skema Metode Cawan Tuang

Gambar 4. Pertumbuhan bakteri pada tabung reaksi pada medium padat

Gambar 5. Pembentukan H2O2 dari oksidasi flavoprotein

Gambar 6. Reaksi hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen

3.2.3 Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test)

Gambar 7. Proses Fermentasi Asam Mikroorganisme

Gambar 8. Reaksi Fermentasi 2,3-Butanadiol

Gambar 9. Reaksi Indikator pada VP Test

Anda mungkin juga menyukai