FISIKA FARMASI

BAB 12
SPEKTROFOTOMETRI

PENDAHULUAN
Spektrofotometri serap adalah pengukuran serapan radiasi elektromagnetik panjang gelombang
tertentu yang sempit, mendekati monokromatis yang diserap zat (FI ed III). Analisa secara
spektrofotometri, dapat dipakai untuk analisa kualitatif dan kuantitatif terutama sangat cocok
untuk penetapan kuantitatif dan untuk beberapa zat berguna untuk membantu identifikasi.
Pengukuran serapan dapat dilakukan pada daerah :
 Ultraviolet (UV) pada panjang gelombang () 190 - 380 nm
 Cahaya tampak (Visible) pada panjang gelombang () 380 - 780 nm.
Keuntungan metoda ini :
dapat digunakan untuk analisa zat dalam jumlah kecil, pengerjaannya cepat, sederhana dan non
destruktif.

TEORI
1. Radiasi dan Cahaya
Cahaya adalah suatu bentuk gelombang elektromagnetik yang menjalar dalam hampa
(vakum) pada kecepatan 3 x 1010 cm/detik yang dapat diklasifikasikan dalam :
 Sinar Infra merah (IR)
 Cahaya tampak (Visible light)
 Ultra ungu (ultra violet)
 Sinar X, tergantung pada panjang gelombangnya
~ (infinite) ----------------------------------
Spektrofotometer UV-Vis menggunakan radiasi yang mencakup daerah panjang gelombang
(λ) 200 - 900 nm. 20.000 m---------------------------------------------
long wave
2.000 m ----------------------------------
| medium wave
2. Panjang gelombang () 200 m ----------------------------------
Panjang gelombang dari cahaya didefinisikan sebagai jarak | antara dua puncak dari suatu
50 m ---------------------------------- Radio wave
gelombang, biasanya dinyatakan dengan simbol (). | short wave
Satuan yang dipakai dalam daerah
10 m UV-Vis adalah nanometer (nm) = 10-9 m
----------------------------------
| ultra short wave
1  1m mμ = 10–9m = 10-7 cm
----------------------------------
| 1μ wave
micro = 10–6 m = 10-4 cm
5 mm -----------------------------------------
-10 -8
1 | far ÅIR = 10 m = 10 cm
1 40  mμ = 1 nm = 10 Å
-------------------------
Heat ray Infrared
panjang gelombang 3 ----------------------------
| nearPembagian
IR -------- gelombang
0,7  ------------------------------- 
elektromagnetik ( (= 700 m = 700 nm) | red
visible
Cahaya adalah merupakan campuran dari radiasi-radiasi| yang violet
mempunyai panjang
400 nm -----------------------------------------
gelombang yang berbeda, yang dapat didispersikan oleh suatu | monokromator
near uv menjadi
sinar
200 nmyang monokromatis
--------------------------------------- ------- UV ray
| far uv
500 A ------------------------------------------ Keterangan :
|  rays
0,05 A ------------------------------ 1 mm = 1.000 
440703250.doc |  rays 1  = 1.000 m 57
1 ------------------------------ 1 m = 1 nm = 10-9 m = 10 A
| cosmic rays 1 A = 10-8 m = 10-6 cm
 FISIKA FARMASI

Range of UV-Vis
Spectro

3. Frekuensi dan Energi

Frekuensi (v) adalah jumlah dari gelombang yang melewati satu titik tertentu dalam
1 detik dan dihubungkan dengan panjang gelombang () oleh :
c
(1) vc →v dimana, c adalah kecepatan cahaya, 3 x 108 m/detik.

Bilangan gelombang (ΰ) menunjukkan jumlah panjang gelombang dalam radiasi 1 cm dalam
ruang hampa udara, dapat dinyatakan sebagai :
1 v
(2) v  (dalam cm-1)
 c
E sebagai energi foton dari radiasi elektromagnetik, dinyatakan sebagai :
(3) E = h v = h c/ dimana, h adalah konstanta Planck, 6,626 x 10 –27 erg detik.
Persamaan (3) menunjukkan semakin pendek panjang gelombang semakin besar energi
dari sinarnya. Sinar UV mempunyai energi yang lebih besar dari sinar tampak (visible)
sedangkan sinar tampak lebih besar dari sinar infra-merah.

440703250.doc 58
 FISIKA FARMASI

Tabel 8.1 : Spektrum Elektromagnetik

Daerah Panjang Bilangan Frekuensi Sumber

Spektrum Gelombang gelombang Cycle/detik
(m) v (cm-1) (f = Hz)
Sinar gamma 10-13 1011 3 x 1021 Transformasi
3 x 10-13 3,3 X 107 1 x 1018 inti
Sinar – X 3 x 10-8(30nm) 3,3 X 105 1 x 1016 Transisi elektron kulit-
5 X 104 1,5 x 1015 terdalam
Ultra ungu (vacum) 2 x 10-7(=200nm) 2,5 X 104 7,5 x 1014 Ionisasi dan transisi
1,3 X 104 4 x 1014 elektron valensi
Ultra ungu (dekat) 4 x 10-7(=400nm) 4 X 103 1,2 x 1013 --
Cahaya tampak 7,5 x 10-7(=750nm) 4 X 102 1,2 x 1012 Transisi elektron valensi
Infra merah (dekat) 2,5 x 10-6 101 3 x 1011 --
IR (daerah fundamental) 2,5 x 10-5 10-1 3 x 109 Vibrasi molekul
Infra merah (IR) 10-3 10-5 3 x 105 Rotasi atau vibrasi
10-1 molekul
Microwaves 103 Transisi spin elektron
Gelombang Radio Transisi spin inti

4. Warna
Warna yang dapat dilihat oleh mata manusia disebut sinar tampak (visible) yang merupakan
campuran dari sinar-sinar yang mempunyai bermacam-macam panjang gelombang dari 400 -
700 nm, seperti yang kita lihat pada pelangi. Warna dan warna komplimenter adalah suatu
pasangan dari setiap dua warna dari spektrum yang menghasilkan warna putih.
Tabel 8.2 Warna dan warna komplimenter.

Panjang gelombang Warna Warna Komplimenter

400 – 435 nm Ungu Kuning kehijauan

435 – 480 nm Biru Kuning
480 – 490 nm Hijau kebiruan Jingga
490 – 500 nm Biru kehijauan Merah
500 – 560 nm Hijau Merah ungu
560 – 580 nm Kuning kehijauan Ungu
580 – 595 nm Kuning Biru
595 – 610 nm Jingga Biru kehijauan
610 – 680 nm Merah Hijau kebiruan
680 – 700 nm Merah ungu Hijau

5. Spektrum Ultraungu dan Cahaya Tampak

440703250.doc 59
 FISIKA FARMASI
Apabila molekul-molekul organik di dalam larutan atau sebagai cairan yang
dikenakan cahaya didalam daerah-daerah UV-
V4
Vis molekul dapat menyerap radiasi, oleh
V3 Tingkat elektronik
tereksitasi S1
karena mereka mengandung elektron baik yang
V2
(Eksited State) dipakai bersama maupun tidak yang dapat
V1
dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi.
V0
Panjang gelombang pada waktu absorpsi terjadi
tergantung pada bagaimana erat elektron
Energi

  

terikat di dalam molekul. Elektron dalam satu
V4 ikatan kovalen tunggal erat terikat, dan radiasi
V3 Tingkat elektronik
dasar S0 (ground
dengan energi tinggi atau pjg.gelombang
V2
state) pendek diperlukan untuk eksitasinya. Misalnya
V1
r
r
r
r3
4
2 alkana, yang hanya mengandung ikatan tunggal
1
V0
Tingkat-tingkat
a b c
Tingkat-tingkat CH dan CC tidak memperlihatkan absorpsi
rotasi vibrasi diatas 160 nm. Metana menunjukan puncak
Gambar … Tingkat-tingkat energi molekul dan transisi- pada 122 nm yang dinyatakan sebagai transisi
transisi (a) elektronik, (b) vibrasi, dan (c) rotasi. σσ* (satu elektron dalam orbital-sigma
dieksitasi ke orbital antibonding-sigma).
Elektron dalam ikatan rangkap dua atau tiga cukup mudah tereksitasi ke orbital-pi lebih tinggi
(transisi ditandai dengan *). Absorpsi energi dalam transisi demikian biasanya lebih kuat
daripada transisi σσ*. Dalam molekul terkonyugasi (yi. mengandung sederetan ikatan
rangkap berselang-seling) absorpsi tergeser ke pjg gelombang yang lebih panjang, contoh
senyawa CH3CH=CH-CHO pada 217 nm dan CH2=CH-CH=CH-CHO pada 263 nm.
(Underwood)
Apabila suatu gugus karbonil (CH3)2C=O ada di dalam suatu molekul,
bagaimanapun juga, atom oksigen dari gugus fungsi ini memiliki sepasang elektron tidak
berikatan (n) yang dapat mengalami transisi orbital elektronik η(eta)→  (pi)* atau η→.
Transisi ini membutuhkan energi yang lebih rendah dari pada transisi →* oleh karena itu
terjadi dari absorpsi radiasi dengan pjg. gelombang yang lebih panjang. Untuk aseton (CH 3-O-
CH3), transisi η→* atau η→* terjadi berturut-turut pada 180 nm dan 190 nm. Untuk
aldehida dan keton, daerah spektrum ultraungu antara 270 dan 290 nm, menunjukkan adanya
transisi elektronik η→* dari karbonilnya dimana hal ini dapat digunakan untuk identifikasi.
Jadi macam-macam orbital elektronik yang ada pada tingkat dasar (ground state) dari suatu
molekul nenentukan suatu daerah spektrum dimana absorpsi dapat terjadi. Bagian dari suatu
molekul itu yang dapat langsung berhubungan dengan absorpsi sinar uv-vis, seperti gugus
karbonil, disebut sebagai chromophores. [Farmasi fisik]

Spektrum Absorbsi UV-Vis

Abs Suatu spektrum absorpsi diperoleh bila kita
membiarkan sinar-sinar monokromatis mengenai
0,6

0,5
larutan zat tersebut, kemudian menghubungkan
361 antara serapan (sebagai ordinat) dan panjang
0,4
gelombang (sebagai absis) kedalam suatu grafik.
0,3
Pembuatan spektrum lebih mudah dikerjakan
0,2 278 dengan menggunakan Spektrofotometer double
0,1
550
beam (sinar ganda) dimana alat secara langsung
220 270 320 370 420 470 520 570 nm
merekam pada kertas rekorder. Sekarang ini alat
Gbr. Spektrum Abs UV-Vis
spektrofotometer single beam juga dapat, tapi
harus dilengkapi dengan Program pack dimana

440703250.doc 60
 FISIKA FARMASI
resapan pelarut direkam dulu, baru kemudian di scan larutan baku/contoh. Serapan baku/contoh
dikoreksi terhadap pelarut dan spektrum dapat diamati langsung pada layar.

440703250.doc 61
 FISIKA FARMASI
6. Transmittance dan Absorbans
c Bila suatu sinar dengan intensitas Io melalui suatu larutan
dengan konsentrasi (c) dan lebar sel (b dalam cm) dan sinar
yang diteruskan mempunyai intensitas It, maka akan sesuai
I0 I dengan persamaan :
I = I0 10 –abc

b I I
T  10 abc %T   100
I0  I0

Hubungan Absorpsi dan Transmittance :

1 I Io
A  log   log T   log 10  abc Abs ( A)   log  log
T Io I
A = log 10abc  A = a.b c

Hukum Beer Lambert :

Besarnya absorpsi sinar pada panjang gelombang tertentu dapat dihitung dengan menggunakan
Hukum Beer-Lambert. Persamaan ini menyatakan hubungan antara jumlah sinar yang di
absorpsi (A) dengan konsentrasi zat yang mengabsorpsi (c dalam gram/liter) dan panjang jalan
dari sinar yang melewati suatu zat (b dalam cm).
Persamaan tersebut adalah sebagai berikut :

dimana : a = daya serap (absorptivity)

A = abc b = tebal kuvet (cell)
c = konsentrasi (dalam g/liter)

a adalah tetapan yang dikenal sebagai daya serap (absorpptivity) untuk suatu zat
pengabsorpsi tertentu (dalam satuan liter.g-1.cm-1). Apabila satuan dari c adalah mol/liter, maka
tetapannya dinyatakan sebagi ε, daya serap molar (dalam satuan liter.mol-1.cm-1). Daya serap
ini tidak hanya bergantung pada molekul yang absorbansinya sedang ditentukan, tetapi juga
pada macam pelarut yang digunakan, begitu pula pada temperatur dan panjang-gelombang yang
digunakan untuk suatu analisa.
1%
Dalam literatur seperti farmakope dinyatakan sebagai E1cm . Absobansi ini adalah
absorbans dari larutan yang mengandung 1 g zat terlarut per 100 ml larutan, melalui jalan (tebal
kuvet) sepanjang 1 cm.

Contoh Soal
1. Kloramfenikol sebanyak 2,5 mg dilarutkan ke dalam aquadest sehingga terbentuk larutan
yang volumenya 50 ml. Larutan ini ditempatkan di dalam cuvet (sel spektro) yang tebalnya 0,5
cm, kemudian disinari dengan sinar UV (pjg gelombang 278 nm).
a. Berapakah serapannya jika diketahui daya serapnya (a = 29,8)
b. Jika sinar yang memasuki larutan intensitasnya 100 cd, berapakah intensitas sinar yang
meninggalkan larutan ?

Jawab :
2,5 mg
a) Konsentasi : c  50 ml  0,050 mg / ml  0,050 g / liter

440703250.doc 62
 FISIKA FARMASI
Tebal kuvet (b) = 0,5 cm Serapan A = a.b.c = 29,8 x 0,5 x 0,050 = 0,745
I
b) Serapan : A  log 0  log I 0  log I  log100  log I  2  log I
I
2  log I  0,745  log I  2  0,745  1,255  I = 17,9887
Intensitas sinar yang keluar dari larutan 17,98 cd. %T = 17,98/100 x100% = 17,98 %.

2. Suatu larutan yang mengandung 2 x 10-5 mol/liter klordiazepoksid yang dilarutkan di dalam
0,1N NaOH ditempatkan dalam sel dari silika setebal 1-cm. Absorbansi A diketahui 0,648 pada
λ 260 nm. (a) Berapakah daya serap molar/absorptivitas molar? (b) Apabila suatu larutan dari
klordiazepoksid mempunyai absorbansi 0,298 dalam sel 1-cm pada 260 nm, berapakah
konsentrasinya ?
Catatan :
Hukum Beer Lambert merupakan gabungan dari 2 hukum, yaitu :
a. Hukum Lambert, menyatakan hubungan antara tenaga radiasi dari cahaya masuk (I o) dan
tenaga dari cahaya yang ditransmisikan (I) sebagai fungsi dari jarak yang dilalui cahaya pada
konsentrasi yang tetap.
log I/Io = - a.b log 1/T = a.b dimana :
log T = - a.b A = a.b a = suatu konstanta
b = jarak yang dilalui cahaya

b. Hukum Berr
Menyatakan hubungan antara tenaga radiasi dari cahaya masuk (Io) dan tenaga dari cahaya
yang ditransmisikan (I) sebagai fungsi dari konsentrasi pada jarak yang dilalui cahaya tetap.
log I/Io = - k.c dimana :
log T = - k.c k = suatu konstanta
log 1/T = k.c c = konsentrasi
A = k.c
c. Hukum Lambert Beer
Kombinasi kedua hukum diatas, menyatakan hubungan antara tenaga radiasi dari cahaya
masuk (Io) dan tenaga dari cahaya yang ditransmisikan (I) sebagai fungsi dari jarak yang
dilalui cahaya dan konsentrasi. .
log I/Io = - a.b.c A = a.b.c
log 1/T = a.b.c
Persamaan ini menunjukkan, bahwa pada pengukuran serapan suatu sample oleh karena a (daya
serap) adalah tetap dan b dapat dibuat sama, maka A (absorbans) sebanding dengan c
(konsentrasi). Dalam analisa kuantitatif yang digunakan untuk menghitung konsentrasi adalah
Absorbans bukan transmittance.
Ciri khas harga ε untuk obat-obat tertentu bersama-sama dengan panjang gelombang dari
absorpsi maksimumnya, serta pelarut yang digunakan dapat dilihat pada tabel berikut ini.

440703250.doc 63
 FISIKA FARMASI
Tabel 8.2 Daya Serap Molar Dari Beberapa Obat Diukur Dalam Sel 1-cm
Panjang
Obat (liter mol-1 cm-1) Pelarut
gelombang (nm)
Codein fosfat 1.570 284 Air
Reserpin 14.500 267 Kloroform
Riboflavin 35.500 222 Air
Tetrasiklin HCl 16.200 380 Air
Tolazolin 24 257 Etanol
Prednisolon 17.500 263 Etanol

Tabel 8.3 Bahan Farmasi yang penetapan kadar nya dengan Spektro (menurut FI
ed.III)

Pnj.gelomb 1%
E1cm
No Nama zat Pelarut
(nm).
.
1. Acetaminophenum tab NaOH 0,01 N 257 nm 715
2. Alprenoli HCl tab/Inj. etanol 95% 271 nm 65
3. Amitriptylin tab Hcl 0,1 N 239 nm 445
4. Ampisilina baku/caps Dapar CuSO4 pH 5,2 320 nm BP
5. Bisacodyl tab Kloroform 264 nm 148
6. Carbamazepin / ~ tab. Etanol 95% 285 nm 490
7. Chloramphenicol cap Air 278 nm 298
8. Chloramph.palmitat/susp Etanol 271 nm 178
9. Chlordiazepoxid tab H2SO4-Etanol 311 nm BP
10. Chlordiazepoxid HCl cap HCl 0,1 N 308 nm 292
11. Chlorpheniramin tab/inj. H2SO4 0,5N (sarian) 265 nm 212
12. Cyanocobalamin /~ Inj.. Air 361 nm 207
13. Cyproheptadine HCl tab Etanol 95% 286 nm 355
14. Dextromethorphan sir HCl 0,1 N 278 nm BP
15. Diazepam /~ tab H2SO4(0,5%)Metanol 284 nm 446

Analisa Spektrofotometri

Spektrofotometer, tergantung dari type/modelnya dapat dipakai untuk

a. Analisa Kualitatif
b. Analisa Kuantitatif

Analisa Kualitatif adalah untuk mengidentifikasi suatu zat. Disini dapat digunakan spektrum
absorbsi yang khas tergantung dari komposisi kimianya. Spektrum absorbsi dibuat dengan
mengukur serapan pada daerah panjang gelombang tertentu, kemudian digambar pada
kertas grafik secara manual. Hal ini dapat lebih mudah bila menggunakan Spektrofotometer
doble beam.

Analisa Kuantitatif didasarkan pada perbandingan densitas warna larutan contoh dengan
larutan baku yang diketahui kadarnya. Berdasarkan cara-cara yang digunakan dalam
pengukuran densitas warna tersebut dapat dibagi kedalam :
1. Analisa Kolorimetri

440703250.doc 64
 FISIKA FARMASI
2. Analisa Spektrofotometri.

Instrumen dan Perkembangannya

Kolorimetri :
Nama kolorimetri berasal dari pengukuran yang berdasarkan pada perbandingan densitas
warna atau pengukuran secara spektrofotometri yang dilakukan pada daerah visible ( cahaya
tampak), alat yang digunakan dalam kolorimetri disebut Kolorimeter. Suatu sample yang
berwarna mempunyai sifat-sifat absorpsi yang istimewa agar supaya warna komplimenter
dalam daerah sinar tampak (visible) dapat diserap. Bila suatu sample tidak berwarna, maka
terlebih dahulu ditambahkan pereaksi yang dapat membentuk warna melalui reaksi kimia,
sehingga dapat ditentukan secara kolorimetri.

Alat Kolorimeter ini ada beberapa macam antara lain, yaitu :

a. Kolorimetri Visual, pengukuran dilakukan secara visual dengan mata atau dengan
bantuan peralatan secara sederhana sebagai berikut:

100 100 1.dibuat seri larutan standar dalam

90 90 tabung Nessler.
80 80

70 70 LR 2. dengan menggunakan alat Hehner

60 60
cylinder (Balancing Methods).
50 50

40 40
3. dengan alat Colorimeter Duboscq.
30 30
l1 x C1 = l2 x C2
20 20
l1 l2 l
10 10 C1  1  C2
l2
Gbr. Alat Hehner cylinder Gbr. Duboscq colorimeter
(Balancing Methods).

b. Kolorimetri Fotoelektrik, sudah lebih maju menggunakan detektor sel sebagai pengganti
mata dan pengukur absorpsi. Disini dipakai cahaya dalam daerah sinar tampak (visible)
dengan panjang gelombang yang sempit, yang diperoleh dengan melewatkan cahaya putih
melalui filter. Instrumennya disebut Fotometerfilter atau Kolorimeter.-

Spektrofotometri
Pada perkembangan selanjutnya instrumen yang digunakan untuk pengukuran pada daerah
ultraviolet dan cahaya tampak (visible) disebut Spektrofotometer. Alat ini dilengkapi dengan
suatu prisma atau kisi sebagai monokromotor sehingga dihasilkan range panjang gelombang
yang lebih sempit lagi, sehingga hasil analisa lebih baik dari pada mempergunakan
kolorimeter Visual ataupun Fotometer Filter.
Metoda spektrofometri umumnya adalah dengan membandingkan absorbance yang
dihasilkan oleh larutan zat yang diuji yang dibuat sesuai prosedur (Farmakope) dengan
absorbance dari larutan standard yang diketahui konsentrasinya. Pengukuran biasanya
dilakukan pada panjang gelombang absorbsi maksimum.

Alat Spektrofotometer
Alat untuk mengukur absorpsi radiasi oleh suatu larutan adalah kolorimeter,
Absorpsimeter atau Spektrofotometer. Istilah kolorimeter umumnya terbatas pada alat visual

440703250.doc 65
 FISIKA FARMASI
maupun fotoelektrik sederhana pada daerah sinar tampak (visible ), sedang Spektrofotometer
mencakup berbagai jenis Kolorimeter yang juga dapat digunakan untuk alat-alat pada daerah
Ultraviolet dan Inframerah.
Spektrofotometer pada dasarnya terdiri atas : (1) sumber sinar, (2) monokromator, (3) tempat
sel (cuvet) untuk zat yang diperiksa, (4) detektor, (5) penguat arus ( amplifier) dan (6) alat
ukur/monitor atau pencatat (recorder).
0
0 0

0 0
0,500

1 2 3 4 5 6

Gbr. Konstruksi dasar dari Spektrofotometer.

Seperti pada gambar, sinar putih yang berasal dari sumber sinar melewati monokromator dan
didispersikan menjadi sinar yang monokromatis yang ditransmisikan, melalui cuvet berisi
sampel hingga jatuh ditabung foto detector, kemudian diubah menjadi signal listrik yang akan
diperkluat oleh amplifier sehingga dapat dibaca pada ter/rekorder.

1. Sumber cahaya, pada spektrofotometer UV-Vis lampu D2(deuterium) sering digunakan

untuk daerah ultraviolet ( p.g.180-380 nm) sedang untuk daerah
cahaya tampak digunakan lampu tungsten.
f(x 1...xn )
x1f(x 1...xn)

2. Monokromator,
x1 u1

x2
u1

x2

Tungsten/
wolfram
merupakan suatu
Diuterium
alat yang dapat
memisahkan radiasi sinar putih yang
polikromatismenjadi sinar yang Prisma Kisi-kisi monokromatis. Ada
yang berupa prisma atau grating. (grating)

3. Kuvet/Cell, merupakan tempat larutan sample terbuat dari glass atau Quartz (untuk daerah
uv 180 – 400 nm). tersedia dalam bentuk tabung atau persegi (square) dan ukuran,
yang sering digunakan bentuk empat segi panjang O 1-cm, tinggi 4,5 cm
4. Detector, alat yang merubah signal optik menjadi signal listrik. Ada
beberapa type seperti cell fotosilikon dan photomultiplier.
5.Amplifier, sebagai penguat arus
6. Indikator : signal listrik dari detector dibaca pada indicator, ada
bermacam-macam type tergantung spsifikasi alat yaitu berupa meter (jarum-skala), detector

digital maupun berupa layar monitor dan recorder (printer).

Dengan digital/monitor lebih baik karena dapat
mengurangi kesalahan pembacaan. ABS 0,485
Skala jarum
Spektrofotometer dapat bekerja secara otomatik
Moniyor/digital
ataupun tidak, dapat mempunyai sistim sinar tunggal (single
beam) atau sistim sinar ganda
Tungsten
(double-beam).
Lamp
Diuterium
Cermin
Sel Pembanding
Lamp Filter celah Spektrofotometer single beam,
Lensa A
Kisi-
kisi
masuk
radiasi dari sumber cahaya diter
Detector Pemotong
Pembelah
Celah masuk
difraksi tempat sampel (cuvet) menuju
Penyatu
detektor terus ke Indikator
Lensa B
Detektor cahaya Kisi-kisi
kembali
Phototube
Sampel (grating)
Celah
keluar melalui satu jalan. Resapan atau
Pengendali Lengan
%T diatur menggunakan blanko
filter

Sel Sampel
Celah
keluar
cahaya
Cermin
Cakram kemudian pengukuran A dari
penuntun

440703250.doc 66
Bagan jalan cahaya pada Spektrofotometer Single beam
(Spectronic-20 Bausch and Lomb)
Bagan jalan sinar pada Spektrofotometer Double beam
 FISIKA FARMASI
baku dan contoh secara bergantian.Spektro double-beam, radisi dari sumber cahaya dibagi
menjadi dua jalan. Satu melalui tempat blanko dan yang lain melalui tempat sampel/baku.
Kedua sinar setelah melewati masing-masing kuvet dideteksi secara simultan sebagai signal
pembanding (Io) dan signal sampel (I). Jadi %T atau A diperoleh sebagai perbandingan dari
kedua signal atau logaritma dari rasio tersebut.

Keunggulan Spektro double beam dibanding single beam

 Spektro-double beam : dapat merekam spektrum absorbsi langsung pada rekorder , dan tiap
penggantian panjang gelombang tidak perlu mengatur A nol atau T100%.
 Spektro-single beam : Spektrum absorpsi untuk beberapa panjang gelombang diukur
secara manual dan digambar pada kertas grafik dan setiap penggantian panjang
gelombang harus diatur A nol atau %T100 sehingga untuk analisa kualitatif agak sulit.

Cara menjalankan Spektrofotometer

Petunjuk operasional secara terperinci dapat diikuti sesuai dengan buku petunjuk (manual)
dari instrumen. Prosedur secara umum (sederhana) dalam menjalankan Spektro adalah
sebagai berikut :
1. Periksa bahwa tidak terdapat kuvet sampel dalam tempat kuvet.
2. Nyalakan alat switch power "ON"
3. Pilih lampu yang sesuai nyalakan sesuai derah pengukuran : lampu Deuterium (D 2) untuk
daerah UV atau lampu Tungsten untuk daerah visible (sinar tampak).
4. Atur panjang gelombang yang dikehendaki dengan memutar tombol pengatur panjang
gelombang (seperti memilih gelombang radio).
5. Periksa 0 %T dengan memasukkan shutter block pada tempat kuvet, meter atau digital
harus nunjuk %T = nol.
6. Letakkan kuvet berisi pelarut (blanko) pada tempat kuvet (khusus untuk spektro double
beam letakkan pada tempat blank), atur zerro adjust hingga A = 0 atau %T = 100
7. ganti kuvet blanko dengan kuvet baku atau sampel yang akan diukur baca hasil Absorban
atau %T pada skala meter/digital.

Serapan/Transmitan yang ideal dalam pengukuran

Seperti pengukuran yang lain, nilai akhir Transmitan atau serapan (absorbans)
dalam penentuan fotometrik adalah terbatas dalam ketelitian dan ketepatan, kepercayaan
terhadap hasil yang diperoleh tergantung pada mutu instrumen, kondisi penetapan serta
pemakai alat. Dari perhitungan didapat, bahwa harga Absorban optimum adalah A = 0,4343
sesuai dengan T = 36,8% jadi didalam pengukuran suatu larutan sampel Transmitan sebaiknya
berada pada nilai antara 20% - 60% atau Absorbans antara 0,2 - 0,8.

Penetapan kuantitatif
Penetapan kadar (analisa kuantitatif) dilakukan dengan mengukur serapan (A) larutanzat dalam
pelarut serta pada panjang gelombang tertentu. Pengukuran serapan biasanya dilakukan pada
panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) dan yang umumnya telah dicantumkan dalam
monografi farmakope atau pustaka lainnya. Oleh karena letak serapan maksimum dapat berbeda
jika digunakan alat yang berbeda, mk sebaiknya pengukuran dilakukan pada λ maks yang
diperoleh dengan alat yang digunakan asalkan panjang gelombang (λ) yang diperoleh tidak
berbeda lebih dari ± 0,5 nm pada daerah 240 nm – 280 nm, tidak lebih dari ± 1 nm pada daerah
280 nm – 320 nm serta tidak lebih dari ± 2 nm pada daerah diatas 320 nm, dari panjang
gelombang yang ditentukan. Jika perbedaannya melebihi batas tersebut alat harus dikalibrasi.

440703250.doc 67
 FISIKA FARMASI
Pada pengukuran serapan suatu larutan hampir selalu digunakan larutan blanko yang
digunakan untuk mengatur spektrofotometer hingga pada panjang gelombang pengukuran
mempunyai serapan nol. Maksud dari blanko tersebut adalah untuk koreksi serapan yang
disebabkan oleh pelarut, pereaksi, sel ataupun pengaturan alat.

Cara Perhitungan Konsentrasi.

Jika dengan cara seperti tersebut diatas harga serapan (Abs) larutan zat telah diukur,
kadar larutan dapat ditetapkan dengan cara berikut. :
1%
a. Berdasarkan harga a (daya serap) atau E1cm
Daya serap (a) adalah serapan (A) dibagi dengan hasil kali kadar (c) dinyatakan dalam gram
per liter dan tebal lapisan (b) dinyatakan dalam cm.
A A
a  c ( g / liter )
b.c a.b

1% 1%
Serapan Jenis ( E1cm ) atau dibuku lain ditulis A1cm adalah serapan (A) dibagi hasil perkalian
kadar (c dinyatakan dalam g/100 ml) dan tebal lapisan (b = 1 cm).

A A A
E11cm
%
  10.a Konsentasi (c )  1%
( g / 100ml )  x 10 (mg / ml )
b.c E 1cm .b E11cm
%

1%
perlu dicatat, bahwa harga a atau E dalam literature diperoleh dengan cara dan alat yang
1cm

mungkin berbeda dengan instrumen yang kita gunakan, demikian pula panjang gelombang
maksimum. Seperti diketahui spektrofotometer yang berbeda akan memberikan sedikit variasi,
karena itu metode ini agak kurang ketelitiannya.

b. Membandingkan absorban lar.standar dan larutan uji.

Penetapan kadar dapat pula dilakukan dengan cara membandingkan serapan larutan zat
terhadap larutan zat pembanding yang disiapkan dengan cara yang sama. Jadi pertama diiukur
dulu Absorbsi larutan standard, kemudian larutan uji (sampel), pengukuran kedua haruslah
secepat mungkin setelah pengukuran pertama menggunakan kondisi yang sama.
Persamaan Lambert Beer : A = a.b.c
A sample = (a.b.c) sample
A baku = (a.b.c) baku karena harga a sama dan b juga sama
Asample Csample Asample
maka :   Csample   Cbaku
Abaku Cbaku Abaku

c. Menggunakan Kurva baku

Bila metode spektrofotometri digunakan secara
rutin untuk menentukan kadar larutan yang belum
0,500
dapat diperkirakan atau sangat bervariasi,

sebaiknya dibuat kurva baku, yaitu gravik
Serapan (Abs)

0,415 320nm
0,400
565nm Absorban vs Konsentrasi larutan baku berbagai
macam konsentrasi, maka akan diperoleh suatu
0,300
garis linier melalui titik pangkal. Setelah A
(sampel) diukur, maka konsentrasi sampel (c)
20,75

dapat diinterpolasi dari gravik tersebut..Yang

0 15 20 25 ppm

Konsentrasi
440703250.doc 68
 FISIKA FARMASI
perlu dicatat adalah bahwa linieritas suatu kurva kalibrasi tidak selalu dapat diperoleh pada
seluruh range konsentrasi, karena bila konsentrasi terlalu tinggi kurva akan menyimpang. Kurva
baku tersebut harus sering dicek kembali terutama bila digunakan alat spektrofotometer lain
ataupun reagen dari lot yang baru.

Contoh Perhitungan kadar

1. Penetapan kadar Vit. B12 (Sianokobalamin) Injeksi dengan A1% 1cm
Pipet sejumlah larutan injeksi setara dengan 2500 mcg B 12, masukkan labu ukur-100 ml
encerkan dengan air hingga 100 ml. Ukur serapan-1cm pada maksimum 361 nm. A(1%,1cm)
pada 361nm adalah 207. Hitung kadar Vit.B12. dalam injeksi (mcg/ml) dan % terhadap etiket
jika kadar yang tertera pada etiket 500 mcg/ml.
Perhitungan :
Lar injeksi B12 dipipet 5 ml diencerkan dengan air suling hingga 100 ml. Serapan terukur 0,525

Kadar Vit. B12 :

0,525 100 507,2
c  10 mg / ml   0,5072 mg / ml → % =  100%  101,4%
207 5 500
Jadi kadar injeksi = 507,2 mcg/ml atau 101,4% dari jumlah yang tertera pada etiket .

2 Penetapan dengan baku pembanding

Lar baku pembanding : Timbang saksama 50 mg zat x (baku) larutkan dalam air hingga 100 ml,
pipet sebanyak 10 ml encerkan hingga 50 ml.
Larutan contoh : Timbang 200 mg contoh yang mengandung zat x larutkan dalam air hingga
100 ml, pipet 10 ml encerkan hingga 50 ml.
Ukur Abs larutan baku dan larutan contoh pada panjang gelombang maks. 275 nm, absorbans
yang didapat : Ab (lar.baku) = 0,537 As (Sampel) = 0,525 Hitung kadar zat x dalam contoh.

Jawab : Cb (baku) = 50 mg/100 ml x 10 ml/50 ml = 0,1 mg/ml (= 100 ppm)

0,525
Cs (spl) =  0,1 mg / ml  0,0977 mg/ml
0,537
Jadi zat x dalam contoh = 0,0977 x 50 ml/10 ml x 100 ml = 48,88 mg
Kadar zat x = 48,88/200 x 100% = 24,44%.
Cara lain dihitung :
 faktor pengenceran baku (fpB) = 100 x 50/10 = 500
 faktor pengenceran sample (fpS) = 100 x 50/10 = 500
Kadar sampel dihitung dengan Rumus :

Aspl mgbaku fpSp

Kadar spl (Cs )    100% 
Abk fpBk mgSpl

0,525 50 500
Cs     100%  24,44%
0,537 500 200
Pemeliharaan Spektrofotometer
Spektrofotometer adalah alat yang cukup peka dan mahal, maka harus ditempatkan dalam
ruangan yang ideal dengan kondisi sebagai berikut :
1. Ruangan harus bebas dari medan magnit & listrik, alat-alat listrik yang menghasilkan
frekuensi tinggi, cahaya matahari langsung, debu, gas-korosiv serta kelembaban yang
tinggi.

440703250.doc 69
 FISIKA FARMASI
2. Untuk itu ruangan hendaknya dilengkapi dengan Air Conditioner (AC) dan dehumidifier.
3. Dianjurkan menggunakan stabilizer untuk menghindari variasi tegangan yang tinggi.
4. Kuvet harus dijaga kebersihannya, setelah selesai dipakai harus dicuci atau direndam
dalam campuran HCl pekat dan alkohol sama banyak, atau asam kromat. Jangan
menggosok kuvet dengan kain tapi gunakan tissue yang halus dan jangan memegang pada
bagian yang dilalui cahaya. peganglah bagian yang buram.
5. Secara berkala spektro harus dikalibrasi. Pemeriksaan meliputi skala panjang gelombang
dan skala fotometri. Lampu mempunyai batas usia, bila sudah lemah harus diganti yang
baru.

440703250.doc 70
 FISIKA FARMASI
Spektrofotometi Infra merah (IR)
Daerah infra merah spektrum elektromagnetik yang digunakan untuk analisa obat meliputi
4.000 cm-1 hingga 250 cm-1 (2,5 μm-40 μm).
Spektrum serapan infra merah suatu zat mempunyai gambaran yang khas untuk zat yang
bersangkutan, sehingga dapat digunakan sebagai identifikasi, (dpl merupakan sidik jari dari zat
yang bersangkutan). Untuk keperluan identifikasi spektrum zat yang diuji dibandingkan dengan
spektrum zat pembanding yang ditetapkan dengan cara yang sama atau dibandingkan dengan
spektrum pembanding.
Istilah dan definisi, Sesuai dengan yang tertera diatas, Spektofotometri UV-Vis.
Alat, Spektrofotometri IR pada dasarnya sama dengan spektrofotometer ultraviolet dan cahaya
tampak, dan hanya berbeda pada sumber energi, bahan optik dan detektor. Spektrofotometer
yang digunakan untuk identifikasi meliputi pj- gelombang 4000 cm-1 hingga 670 cm-1 (2,5 μm -
15 μm). Spektrofotometer IR harus sering dikalibrasi terhadap skala panjang gelombang
misalnya menggunakan film polistiren.
Menyiapkan zat untuk pengujian, Zat cair dapat diuji langsung atau dilarutkan dalam pelarut
tertentu. Zat padat biasanya disiapkan dengan cara dispersi dalam parafin cair atau cakram
kalium bromida.
Cara penyiapan zat untuk pengujian, ada beberapa cara antara lain dilakukan dengan cara
sebagai berikut :
Cara i. Sedikit zat cair tetes diatara 2 lempeng natrium klorida hingga terbentuk lapisan tipis,
atau masukkan zat cair ke dalam sel serap dengan tebal yang cocok.
Cara ii. Gerus zat dengan serbuk halus KBr yang kering dengan perbandingan 1 : 200
masukkan campuran dalam cetakan, cetak dengan tekanan tinggi dalam hampa udara.

Identifikasi menggunakan zat pembanding, siapkan zat yang diperiksa dan zat pembanding
dengan cara yang sama dan gambarkan spektrum serapan pada panjang gelombang antara 4000
cm-1 hingga 670 cm-1 (2,5 μm - 15 μm).

Panjang gelombangm
5 6 7 8 9 10 12 15

100
90
80
% Transmittance

70
60
50
40
30
20
10 a
0
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Panjang gelombang (cm-1)

Gbr. Spektrum Inframerah dari teofilin (inv dari EGC Clarke)

Kadar zat harus sedemikian rupa hingga puncak spektrum yang terkuat terletak antara 5% dan
25% transmittan.

440703250.doc 71
 FISIKA FARMASI
Soal-soal

1. Fenoksimetilpenisilin sebanyak 40 mg dilarutkan ke dalam lar sodium bikarbonat 0,04% hingga 100
ml. 10 ml larutan ini diencerkan dengan air hingga 50 ml lalu diukur serapannya dengan kuvet 1 cm
pada panjang gelombang 268 nm. Jika serapan (A) terukur 0,558 berapakah serapan jenisnya ?
j = 69,75
2. Ditimbang zat baku klorfeniramin maleat sebanyak 170 mg dilarutkan dalam air 100 ml. Pipet 2 ml
larutan lalu encerkan dengan air hingga 100 ml. Ukur serapan 1 cm pada panjang gelombang
maks.262 nm. Jika serapan jenis (E1%,1cm) klofeniramin maleat pada maks.262 nm adalah 147,
Berapa serapan (Abs) yang terukur, dan berapa %T larutan tersebut.
J : A = 0,500 , %T = 31,62 %
3. Tablet Orfenadrin sitrat dilarutkan ke dalam labu ukur-100 ml dengan NaOH 0,1N kemudian
larutan ditempatkan dalam kuvet tebal 2 cm dan disinari dengan sinar UV panjang gelombang 264
nm. Jika serapan terukur 0,546 sedangkan daya serapnya (a) adalah 13,65 Berapa mg orfenadrin
dilarutkan dalam labu ukur tersebut dan berapa ppm kadar larutan tsb.
J : 2 x 10-3 g, 20 ppm
4. Bobot 20 tablet Parasetamol 12,0300 g, gerus homogen, timbang 95,5 mg larutkan dalam NaOH
0,1N 20 ml + air ad. 200 ml. Larutan yang diperoleh dipipet sebanyak 2 ml + NaOH 0,1 N 10 ml
encerkan dengan air hingga 100 ml. Ukur serapan pada  257 nm dengan kuvet 1-cm, Serapan (A)
didapat = 0,555 . Jika serapan jenis (E1%,1cm) parasetamol pd  257 nm adalah 715. Hitunglah :
a) berapa mg parasetamol dalam 1 tablet. b). Jika kadar yang tertera pada etiket 500 mg/tab,
hitung % kadar tablet tsb. dibandingkan etiket.
5. Ditimbang baku Kloramfenikol 100,5 mg, larutkan dengan air ad 500,0 ml, encerkan 10,0 ml
dengan air hingga 100,0 ml. Sejumlah suspensi ditimbang 4,605 g larutkan dengan air ad. 500 ml.
Encerkan 10,0 ml larutan dengan air secukupnya hingga hingga 100,0 ml. Ukur serapan pada
panjang gelombang 278 nm dengan kuvet 1-cm, Serapan Baku (Ab) didapat = 0,595 Serapan
sampel (As) didapat = 0,598. Hitunglah a) berapa mg kloramfenikol terkandung dalam 5 ml
suspensi (BJ. 1,15) b) Hitung % kadar terhadap etiket, jika tertera tiap 5 ml suspensi mgd 125 mg

6. Kloramfenikol maksimum 278 nm.

440703250.doc 72
 FISIKA FARMASI
CATATAN :

440703250.doc 73