LOGBOOK PENELITIAN
TERAPI BIOSIMILAR LUPUS
No Tanggal Kegiatan
1 10 Maret 2015 Rapat kegiatan:
Diskusi konsep, teknis dan
rancangan penelitian serta
penyusunan proposal.
Pelaksana:
Tim Anggota Peneliti
2 14 Maret 2015 Pengurusan ethical clearance
Penanggung jawab:
Tim Anggota Peneliti
3 19 Mei 2015 Pengurusan ethical clearance
Hasil yang Diperoleh
Penelitian hewan coba ini dilaksanakan oleh anggota peneliti sebagai berikut :
- Prof. Dr. dr. Kusworini Handono, M.Kes, SpPK
- dr. Mirza Zaka Pratama, S.Ked., M. Biomed.
- Ns. Elvira Sari Dewi, S. Kep., M. Biomed.
Dengan mahasiswa bimbingan S2 sebanyak 1 orang sebagai berikut:
Mahasiswa S2 Program Magister Ilmu Biomedik :
- dr. Tri Wahyudi Iman Dantara, S.Ked.
Memahami konsep, teknis dan rancangan penelitian yang akan dilakukan serta
mendiskusikan rencana penyusunan proposal.
Perizinan ethical clearance harus dilakukan terlebih dahulu sebelum mengajukan
izin ke laboratorium, dikarenakan perizinan lab membutuhkan formulir etik untuk
administrasinya
Pengurusan ethical clearance dilakukan dengan syarat pengumpulan sebagai
berikut :
- Proposal asli penelitian
- Surat permohonan etik
- Protokol penelitian
- Perlakuan terhadap hewan coba
Hasil diterima atau seminarnya etik akan diumumkan satu bulan setelah
pengumpulan
Formulir etik telah disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya pada tanggal 19 Mei 2015
 Penanggung jawab :
Tim Anggota Peneliti
4 26 Mei 2015 Persiapan penelitian: melakukan Koordinasi rencana penelitian dengan laboratorium-laboratorium yang terlibat dalam
perijinan dan koordinasi pada
laboratorium-laboratorium yang
terlibat dalam penelitian
Pelaksana :
Tim Anggota Peneliti
5 1 Juli 2015 Rapat kegiatan :
Pembelian bahan penelitian
Penanggung jawab:
Tim Anggota Peneliti
Pengeluaran formulir etik akan ditindaklanjuti dengan pendaftaran ke Laboratorium
terkait dengan penelitian di FKUB
penelitian. Laboratorium-laboratorium yang terlibat antara lain:
- Laboratorium Farmakologi FKUB
- Laboratorium Biomedik FKUB
Didapatkan beberapa list reagen yang akan dipesan, reagen dan bahan yang akan
dipesan meliputi bahan dan reagen flowsitometri, imunositometri dan pristan.
Berikut ini list bahan dan reagen yang akan dipesan:
- Simplisia daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum) (Balai Materia Medica,
Batu)
- Pristan (Santa Cruz, California, USA, nomor katalog: sc-281684)
- Recombinant Mouse BAFF (Carrier-free) (Biolegend, nomor katalog: 591202)
- Purified anti-mouse CD40 antibody (Biolegend, nomor katalog: (102802)
- Recombinant mouse IL-4 (Carrier-free) (Biolegend, nomor katalog: 574302)
- FITC-anti mouse CD19 (Biolegend, nomor katalog: 101506)
- PE anti-mouse CD38 (Biolegend, nomor katalog: 102708)
- PE Mouse Anti Brdu-set (Bioscience, nomor katalog: 556029)
- FITC Annexin V Detection Kit with PI (Biolegend, nomor katalog: 640914)
- NFkB p65 Antibody (F-6) (Santa Cruz, nomor katalog: sc-8008)
- RPMI 1640 Medium, powder (Gibsco, ThermoFisher Scientific, nomor katalog:
31800022)
- Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4 (Sigma-Aldrich, nomor
katalog: L2630)
- Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X) (Biolegend, 421002)
- Cell staining buffer (Biolegend, nomor katalog: 420201)
Pemesanan reagen diprediksi berlangsung paling lama 1 bulan semenjak dipesan
6 X Januari 2016 Pemesanan Hewan Coba
Pemesanan Pelaksana :
Bahan Tim Anggota Peneliti
Penelitian
7 19 Januari 2016 Pengurusan perizinan
laboratorium
Penanggung jawab :
Tim Anggota Peneliti
8 6 Juni 2016 Pembelian hewan coba mencit
Penanggung jawab :
Hasil eksplorasi selama satu minggu ke laboratorium pemeliharaan mencit oleh
penanggung jawab dr. Tri Wahyudi Iman Dantara, S. Ked, diperoleh hasil sebagai
berikut :
- Pemeliharaan mencit sebanyak XX ekor telah disetujui dilakukan di
Laboratorium Farmakologi FKUB yang dibagi menjadi X kandang
- Pemberian pakan mencit, penggantian sekam, dan pemberian minum harian
mengikuti prosedur yang telah disediakan oleh Laboratorium tersebut
- Pakan dan minum diberikan setiap hari sebanyak ± 20 gram/mencit dan
penggantian sekam dilakukan setiap 3 hari sekali
Mencit dipesan dari LPPT UGM, Yogyakarta karena telah memiliki sertifikat
keaslian strain Balb/c
Tim telah melakukan pendaftaran ke laboratorium yang terkait untuk melakukan
penelitian, berikut ini adalah laboratorium yang akan digunakan beserta agenda
penggunaannya :
- Laboratorium Farmakologi FKUB
 Pemeliharaan hewan coba mencit
 Pembedahan hewan coba
 Pengambilan sampel jaringan
- Laboratorium Biomedik FKUB
 Pengukuran flowsitometri
 Pengukuran Imunositometri
- Laboratorium Patologi Anatomi FKUB
 Pengamatan dan foto menggunakan mikroskop untuk melihat hasil
imunositometri
Ketiga laboratorium telah menyetujui mengenai pemakaian lab oleh tim peneliti
Mencit sejumlah 150 ekor telah didatangkan dari LPPT UGM, Yogyakarta
Mencit dipelihara di Laboratorium Farmakologi FKUB yang dibagi menjadi 10
 Tim Anggota Peneliti kandang (setiap kandang terdiri dari 15 ekor mencit)

Mencit selanjutnya akan dilakukan aklimatisasi atau pengadaptasian terhadap

lingkungan laboratorium selama kurang lebih 1 minggu
9 6-12 Juni 2016 Aklimatisasi hawan coba mencit Aklimatisasi hewan coba dilakukan sejak tanggal 6 hingga 12 Juni 2014 di
Laboratorium Farmakologi FKUB. Kegiatan ini bertujuan untuk mengadaptasikan
Pelaksana : hewan coba pada kondisi Laboratorium sehingga tidak stress saat dilakukan
Tim Peneliti perlakuan

Mencit sebanyak 150 ekor dibagi menjadi 10 kandang, dengan jumlah tiap kandang
adalah 15 ekor. Selama proses aklimatisasi mencit diberikan pakan, minum dan
penggantian sekam secara rutin

Prosedur pemberian pakan mencit :

- Pakan mencit yang digunakan adalah pakan mencit standar (PAR-S) yang
digunakan oleh Laboratorium Farmakologi
- Pemberian PAR-S diukur sebanyak ± 20 gram/mencit
- PAR-S dan tepung dicampur menggunakan air secukupnya
- Pakan yang sudah agak menggumpal kemudian dibentuk menjadi bulatan yang
akan diberikan pada setiap kandang mencit
- Pakan diberikan setiap hari dan sisa tiap harinya ditimbang dan dibuang

Pemberian minum mencit juga dilakukan setiap hari dengan menggunakan air
matang yang ditempatkan pada botol minum hewan. Setiap kandang diberikan
minimal dua botol minum
Air minum dilakukan penggantian setiap hari.

Sekam yang terdapat di dalam kandang mencit dilakukan penggantian setiap tiga
hari sekali. Sekam yang digunakan merupakan sekam dari Laboratorium
Farmakologi FKUB.
Selama proses penggantian sekam mencit dipindahkan ke satu kandang dengan
hati-hati terlebih dahulu untuk mencegah timbulnya stress selama perlakuan.
10 13 Juni 2016 Pelaksanaan injeksi pristane Injeksi pristane dilakukan kepada kelompok mencit kontrol positif sebanyak 75 ekor

Pelaksana : Prosedur injeksi yang dilakukan adalah sebagai berikut :

 Tim anggota penelitian - Mencit kelompok kontrol positif (75 ekor) dipersiapkan terlebih dahulu dan
dipisahkan dari kelompok kontrol negatif
- Pristane dipersiapkan dan diambil menggunakan spuit 1 cc sebanyak 0,5 ml
- Mencit diambil dan diposisikan terlentang untuk melakukan injeksi
- Injeksi dilakukan secara intraperitoneal pada daerah inguinal mencit yang
disuntikkan secara sejajar dengan tubuh mencit
- Setelah pristane diinjeksikan diamati reaksi radang lokal yang timbul pada
daerah injeksi
- Pada dua minggu kedepan mencit diamati apakah terdapat perubahan perilaku
serta pengamatan berat badan untuk menilai efek sistemik pristane pada mencit

Pada reaksi lokal didapatkan adanya keradangan lokal pada tempat injeksi. Muncul
warna kemerahan dan bulu sedikit rontok pada daerah sekitar injeksi pristane
11 20 Juni 2016 Pengukuran penimbangan berat Penimbangan berat badan beserta pengamatan perubahan perilaku diamati satu
badan mencit minggu setelah injeksi pristan. Hal ini bertujuan untuk mengamati adanya efek
sistemik secara akut paska injeksi pristane
Pelaksana :
Tim anggota penelitian Penimbangan dilakukan menggunakan timbangan digital untuk meminimalisir eror
selama pengukuran

Data yang diperoleh kemudian dicatat kemudian dianalisis data sebelum dan
sesudah injeksi pristane menggunakan SPSS. Pengamatan perilaku hanya
berdasarkan pengamatan kualitatif
12 XX Juli 2016 Pembuatan ekstrak cocor bebek Sebanyak 800 gram simplisia daun cocor bebek dimaserasi menggunakan pelarut
(Bryophyllum pinnatum) etanol 96% (2,5 L) selama 48 jam sebanyak 20 kali. Ekstrak etanol difiltrasi
menggunakan kertas Whattman No. 42 (125 mm), kemudian dievaporasi
menggunakan rotary evaporator pada suhu 45° C. Ekstrak disimpan dalam botol
dan suhu -20°C.
13 17 Oktober Pembedahan mencit Setelah diinjeksi pristan selama minimal ± 4 bulan, manifestasi klinis lupus
2016 eritematosus sistemik (LES) pada mencit dievalusi. Mencit dinyatakan siap untuk
Pelaksana : dibedah dengan melihat manifestasi LES nya. Manifestasi LES antara lain:
Tim anggota penelitian - Alopesia
- Asites
- Ruam pada wajah
- Manifestasi artritis
 - Perubahan gait

Alopesia pada mencit BALB/c

Pembedahan mencit

Kemudian dilakukan pembedahan 1 ekor mencit.

 Mencit di-eutanasia dengan cara melakukan dislokasi pada lehernya, kemudian
diambil sampelnya, antara lain:
- Limfa
- Ginjal kanan dan kiri
- Sendi genu dan wrist tangan kanan dan kiri
- Sendi genu dan wrist kaki kanan dan kiri

Limfa dimasukan kedalam tabung sentrifugasi berisi phosphate buffer saline (PBS)
± 4-5 cc + Penicillin Streptomycin (Pen Strep) 1% kemudian segera dibawa ke
laboratorium biomedik FKUB.

Sampel lain dimasukan kedalam tabung berisi formalin.

Setelah dibawa ke Laboratorium Biomedik FKUB, sampel limfa tidak dapat

dilanjutkan kultur dikarenakan sampel terlalu kering.
14 18 Oktober Kegiatan: Persiapan dosis ekstrak daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum):
2016 - Optimasi dosis ekstrak daun Ekstrak daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum) diambil secukupnya dan
cocor bebek (Bryophyllum ditimbang, diberi pelarut dimethyl sulfoxide (DMSO) dihitung stoknya menjadi 1
pinnatum) mg/mL. Dosis optimasi yang diberikan adalah:
- Optimasi faktor - 0,1 µg/mL
pertumbuhan BAFF - 1 µg/mL
- Pembedahan mencit - 10 µg/mL
- Isolasi dan preparasi sel
- Kultur dan pemberian Optimasi faktor pertumbuhan BAFF:
perlakuan Pemberian faktor pertumbuhan BAFF diberikan dengan dosis:
- 10 ng/mL
Pelaksana : - 100 ng/mL
Tim anggota penelitian
Sehingga dibagi menjadi kelompok sebagai berikut:
- K1: BAFF 100 ng/mL
- K2: BAFF 10 ng/mL
- P1: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 0,1 µg/mL
- P2: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 1 µg/mL
- P3: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 10 µg/mL
Pembedahan Mencit:
1 ekor mencit BALB/c di-eutanasia dengan cara melakukan dislokasi pada
lehernya, kemudian mencit dibedah diambil sampelnya, antara lain:
- Limfa
- Ginjal kanan dan kiri
- Sendi genu dan wrist tangan kanan dan kiri
- Sendi genu dan wrist kaki kanan dan kiri

Limfa dimasukan kedalam tabung sentrifugasi berisi phosphate buffer saline (PBS)
± 4-5 cc + Penicillin Streptomycin (Pen Strep) 1% kemudian segera dibawa ke
laboratorium biomedik FKUB.
Sampel lain dimasukan kedalam tabung berisi formalin.

Isolasi dan Preparasi Sel:

Sampel limfa yang sudah diperoleh dipersiapkan untuk dilakukan kultur. Sampel
diletakan di cawan petri beserta PBS 4-5 ml dan Pen Strep 1%. Sampel dipotong
menjadi 3 bagian kemudian dihancurkan dan dihomogenisasi menggunakan
penghancur jaringan. Setelah homogen, sampel ditambahkan RPMI komplit.
Sampel disentrifugasi 900 rpm selamat 9 menit kemudian pelet diambil aliquot
sebanyak 10 µL dan ditambahkan Trypan Blue Solution 0,4% 1:1 untuk dilakukan
viability test, sel hidup dihitung dan diamati selnya menggunakan hemositometer.
Sel kemudian dibagi ke dalam well dengan jumlah sel yang dikultur sebanyak
5x105. Sampel juga diambil aliquot sebanyak 100 µL untuk dilakukan pengecekan
populasi sel B-nya. Pelet dicuci dengan cell staining buffer (CSB) 300 µL,
disentrifugasi 2500 rpm selama 3 menit pada suhu 4°C, sampel dilabel dengan anti-
mouse CD19-FITC (Biolegend) 0,5 µL kemudian di inkubasi 20 menit di ruang gelap
pada suhu ruangan. Setelah diinkubasi diberikan 300 µL CSB dan hasilnya dibaca
di flow sitometer. Presentase sel B yang mengekspresikan CD19 harus minimal
sebanyak 60% untuk dilanjutkan pengkulturan selanjutnya.
Hasil flow sitometri CD19:
Xxx
Hasil Viability Test:
27 x106 sel/ml
 Kultur dan Pemberian Perlakuan:
Penelitian ini memerlukan 24 sampel dengan jumlah sel 1x106 pada tiap well nya.
Sampel kemudian ditambahkan medium kultur RPMI dan diberikan faktor
pertumbuhan 10 ng/mL dan 100 ng/mL Recombinant Mouse BAFF (Carrier-free)
(Biolegend), 10 μg/ml Purified anti-mouse CD40 antibody (Biolegend), 20 μg/ml
Lipopolysaccharides from Escherichia coli (LPS) (Sigma-Aldrich) dan 50 ng/ml
Recombinant mouse IL-4 (Carrier-free) (Biolegend).
Ekstrak daun Bryophyllum pinnatum diberikan setelah penambahan faktor
pertumbuhan. Sampel diinkubasikan pada inkubator pada suhu 37oC selama 72
jam.

K1

P1
K2

P2

P3

Keterangan:
K1: BAFF 100 ng/mL
K2: BAFF 10 ng/mL
P1: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 0,1 µg/mL
P2: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 1 µg/mL
P3: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 10 µg/mL

15 21 Oktober Panen kultur dan pengukuran Panen hasil kultur didapatkan sampel berwarna kuning dimungkinan oleh karena
2016 flow sitometri hasil optimasi jumlah sel yang terlalu banyak. Untuk kultur selanjutnya sel yang dikultur sebanyak
5x105.

Sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian disentrifugasi 2500

rpm selama 3 menit pada suhu 4°C. Pelet yang didapat dari hasil panen kultur
dicuci dengan Cell staining buffer (CSB) (Biolegend), disentrifugasi 2500 rpm 3
menit pada suhu 4°C. Sampel dilabel dengan FITC-anti mouse CD19 (Biolegend)
dan PE anti-mouse CD38 (Biolegend) untuk kelompok maturasi dan dengan FITC
 Annexin V Detection Kit with PI (Biolegend) untuk kelompok apoptosis, sampel
kemudian dilanjutkan pengerjaan sesuai dengan katalog masing-masing label
hasilnya dibaca di flow sitometer.

Hasil optimasi dianalisis dan didiskusikan untuk merencanakan metode

pembedahan dan kultur selanjutnya. Diputuskan untuk menggunakan 100 ng/mL
BAFF; dosis ekstrak daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum) sebesar 0,02
µg/mL; 0,1 µg/mL dan 0,5 µg/mL.
16 24 Oktober Optimasi metode imunositokimia Optimasi metode imunositokimia dengan membandingkan hasil hapusan tetes tebal
2016 hari ke-1 dan tipis, penggunaan blocking buffer dan pemberian dosis perbandingan antibodi
primer (1:100 dan 1:200).

Sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian disentrifugasi 2500

rpm selama 3 menit pada suhu 4°C. Pelet dipisahkan dari supernatannya kemudian
dihapuskan dengan tetesan tipis pada slide yang terlapis poly-L-Lysin. Setelah
terbentuk hapusan sampel diinkubasi dalam suhu ruangan selama 5 menit hingga
kering kemudian difiksasi menggunakan metanol. Slide di cuci dengan PBS 3x5
menit, di-blocking dengan endogen peroksidase (H2O2 3% dalam methanol) dan
diinkubasi 29 menit dalam suhu ruang. Dicuci dengan PBS 3x5 menit kemudian di-
blocking unspecific proteins dengan blocking buffer (background sniper) (Fetal
Bovine Serum 3% dan Triton X-100 0,25%), diinkubasi 60 menit pada suhu ruang,
dilanjutkan cuci dengan PBS 3x5 menit. Inkubasi dengan antibodi primer (NFkB p65
Santa Cruz, nomor katalog: Sc-109) yang dilarutkan dalam blocking buffer,
kemudian diinkubasi semalam pada suhu 4° C.
17 25 Oktober Optimasi metode Setelah diinkubasi semalam pada suhu 4° C, sampel dikeluarkan, dicuci dengan
2016 Imunositokimia hari ke-2 PBS 3x5 menit, diinkubasi dengan antibodi sekunder (Biotin Conjugate) selama 60
menit pada suhu ruang. Dicuci dengan PBS 3x5 menit, diinkubasi dengan
Strepavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) selama 40 menit pada suhu ruang.
Dicuci kembali dengan PBS 3x5 menit, dibilas dengan aquades. Mengaplikasikan
chromagen Diaminobenzidine (DAB) (dengan perbandingan DAB: Buffer 1:40),
inkubasi 1-10 menit pada suhu ruangan, kemudian dibilas dengan aquades 3x5
menit. Memberikan counterstain dengan Mayer’s Hematoxillen (dengan
perbandingan Mayer’s Hematoxillen:aquades sebanyak 1:3), inkubasi 1-10 menit
pada suhu ruang, kemudian membilas dengan aquades. Sampel dikeringkan,
ditutup dengan cover glass, kemudian diamati dibawah mikroskop.
 Pengamatan ekspresi faktor transkripsi dengan melihat hasil positif pada sel B. Sel
dihitung dengan metode per 10 lapang pandang dan dengan penghitungan 1000
sel. Hasil dibandingkan dengan menggunakan perangkan lunak hitung sel ImageJ
versi 1.50i.

Hasil optimasi metode imunositokimia dianalisis dan didiskusikan untuk

merencanakan metode imunositokimia. Diputuskan untuk menggunakan hapusan
tetes tipis, menggunakan blocking, dan menggunakan perbandingan antibodi primer
sebesar 1:100.
18 31 Oktober Kegiatan: Dosis ekstrak daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum) yang diberikan adalah:
2016 - Pembedahan mencit - 0,02 µg/mL
- Isolasi dan preparasi sel - 0,1 µg/mL
- Kultur dan pemberian - 0,5 µg/mL
perlakuan - 1 µg/mL
- 10
Pelaksana :
Tim anggota penelitian Sehingga dibagi menjadi kelompok sebagai berikut:
- K(+): BAFF 100 ng/mL
- P1: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 0,02 µg/mL
- P2: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 0,1 µg/mL
- P3: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 0,5 µg/mL
- P4: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 1 µg/mL
- P5: BAFF 100 ng/mL + Bryophyllum pinnatum 10 µg/mL

Pembedahan Mencit:
1 ekor mencit BALB/c di-eutanasia dengan cara melakukan dislokasi pada
lehernya, kemudian mencit dibedah diambil sampelnya, antara lain:
- Limfa
- Ginjal kanan dan kiri
- Sendi genu dan wrist tangan kanan dan kiri
- Sendi genu dan wrist kaki kanan dan kiri

Limfa dimasukan kedalam tabung sentrifugasi berisi phosphate buffer saline (PBS)
± 4-5 cc + Penicillin Streptomycin (Pen Strep) 1% kemudian segera dibawa ke
laboratorium biomedik FKUB.
Sampel lain dimasukan kedalam tabung berisi formalin.

Isolasi dan Preparasi Sel:

Sampel limfa yang sudah diperoleh dipersiapkan untuk dilakukan kultur. Sampel
diletakan di cawan petri beserta PBS 4-5 ml dan Pen Strep 1%. Sampel dipotong
menjadi 3 bagian kemudian dihancurkan dan dihomogenisasi menggunakan
penghancur jaringan. Setelah homogen, sampel ditambahkan RPMI komplit.
Sampel disentrifugasi 900 rpm selamat 9 menit kemudian pelet diambil aliquot
sebanyak 10 µL dan ditambahkan Trypan Blue Solution 0,4% 1:1 untuk dilakukan
viability test, sel hidup dihitung dan diamati selnya menggunakan hemositometer.
Sel kemudian dibagi ke dalam well dengan jumlah sel yang dikultur sebanyak
5x105. Sampel juga diambil aliquot sebanyak 100 µL untuk dilakukan pengecekan
populasi sel B-nya. Pelet dicuci dengan cell staining buffer (CSB) 300 µL,
disentrifugasi 2500 rpm selama 3 menit pada suhu 4°C, sampel dilabel dengan anti-
mouse CD19-FITC (Biolegend) 0,5 µL kemudian di inkubasi 20 menit di ruang gelap
pada suhu ruangan. Setelah diinkubasi diberikan 300 µL CSB dan hasilnya dibaca
di flow sitometer. Presentase sel B yang mengekspresikan CD19 harus minimal
sebanyak 60% untuk dilanjutkan pengkulturan selanjutnya.

Kultur dan Pemberian Perlakuan:

Penelitian ini memerlukan 108 sampel dengan jumlah sel 5x105 pada tiap well nya.
Sampel kemudian ditambahkan medium kultur RPMI dan diberikan faktor
pertumbuhan 100 ng/mL Recombinant Mouse BAFF (Carrier-free) (Biolegend), 10
μg/ml Purified anti-mouse CD40 antibody (Biolegend), 20 μg/ml
Lipopolysaccharides from Escherichia coli (LPS) (Sigma-Aldrich) dan 50 ng/ml
Recombinant mouse IL-4 (Carrier-free) (Biolegend).
Ekstrak daun Bryophyllum pinnatum diberikan setelah penambahan faktor
pertumbuhan. Sampel diinkubasikan pada inkubator pada suhu 37oC selama 72
jam.
 Proses pengerjaan kultur

Proses pengerjaan kultur

19 3 November Panen kultur dan pengukuran Panen hasil kultur didapatkan sampel berwarna jernih.
2016 flow sitometri
Sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian disentrifugasi 2500
 rpm selama 3 menit pada suhu 4°C. Pelet yang didapat dari hasil panen kultur
dicuci dengan Cell staining buffer (CSB) (Biolegend), disentrifugasi 2500 rpm 3
menit pada suhu 4°C. Sampel dilabel dengan FITC-anti mouse CD19 (Biolegend)
dan PE anti-mouse CD38 (Biolegend) untuk kelompok maturasi dan dengan FITC
Annexin V Detection Kit with PI (Biolegend) untuk kelompok apoptosis, sampel
kemudian dilanjutkan pengerjaan sesuai dengan katalog masing-masing label
hasilnya dibaca di flow sitometer.

Pengukuran flow sitometri

Hasil optimasi dianalisis dan didiskusikan untuk merencanakan metode

pembedahan dan kultur selanjutnya. Diputuskan untuk menggunakan 100 ng/mL
BAFF; dosis ekstrak daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum) sebesar 0,02
µg/mL; 0,1 µg/mL dan 0,5 µg/mL.
20 7 November Imunositokimia hari ke-1 Hasil optimasi metode imunositokimia menyarankan untuk menggunakan metode
2016 hapusan tetes tipis, menggunakan blocking buffer, dan menggunakan perbandingan
antibodi primer sebesar 1:100.

Sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian disentrifugasi 2500

rpm selama 3 menit pada suhu 4°C. Pelet dipisahkan dari supernatannya kemudian
dihapuskan dengan tetesan tipis pada slide yang terlapis poly-L-Lysin. Setelah
terbentuk hapusan sampel diinkubasi dalam suhu ruangan selama 5 menit hingga
kering kemudian difiksasi menggunakan metanol. Slide di cuci dengan PBS 3x5
 menit, di-blocking dengan endogen peroksidase (H2O2 3% dalam methanol) dan
diinkubasi 29 menit dalam suhu ruang. Dicuci dengan PBS 3x5 menit kemudian di-
blocking unspecific proteins dengan blocking buffer (background sniper) (Fetal
Bovine Serum 3% dan Triton X-100 0,25%), diinkubasi 60 menit pada suhu ruang,
dilanjutkan cuci dengan PBS 3x5 menit. Inkubasi dengan antibodi primer (NFkB p65
Santa Cruz, nomor katalog: Sc-109) yang dilarutkan dalam blocking buffer,
kemudian diinkubasi semalam pada suhu 4° C.

Pengerjaan Imunositokimia
21 8 November Imunositokimia hari ke-2 Setelah diinkubasi semalam pada suhu 4° C, sampel dikeluarkan, dicuci dengan
2016 PBS 3x5 menit, diinkubasi dengan antibodi sekunder (Biotin Conjugate) selama 60
menit pada suhu ruang. Dicuci dengan PBS 3x5 menit, diinkubasi dengan
Strepavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) selama 40 menit pada suhu ruang.
Dicuci kembali dengan PBS 3x5 menit, dibilas dengan aquades. Mengaplikasikan
chromagen Diaminobenzidine (DAB) (dengan perbandingan DAB: Buffer 1:40),
inkubasi 1-10 menit pada suhu ruangan, kemudian dibilas dengan aquades 3x5
menit. Memberikan counterstain dengan Mayer’s Hematoxillen (dengan
perbandingan Mayer’s Hematoxillen:aquades sebanyak 1:3), inkubasi 1-10 menit
pada suhu ruang, kemudian membilas dengan aquades. Sampel dikeringkan,
 ditutup dengan cover glass, kemudian diamati dibawah mikroskop.

Pengamatan ekspresi faktor transkripsi dengan melihat hasil positif pada sel B. Sel
dihitung dengan metode per 10 lapang pandang dan dengan penghitungan 1000
sel. Hasil dibandingkan dengan menggunakan perangkan lunak hitung sel ImageJ
versi 1.50i.
22 10 November Diskusi Hasil Penelitian
2016

HASIL KETERCAPAIAN
PENELITIAN TERAPI BIOSIMILAR LUPUS

No, Jenis Kegiatan % Ketercapaian Keterangan

1. Pengurusan ethical 100 % Ethical clearance telah disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
clearance Brawijaya pada tanggal 6 Mei 2014

(formulir ethical clearance terlampir)

2. Pemeriksaan reagen dan 100 % Reagen telah dipesan, beberapa reagen yang telah dipesan antara lain adalah :
bahan - Simplisia daun cocor bebek (Bryophyllum pinnatum) (Balai Materia Medica, Batu)
- Pristan (Santa Cruz, California, USA, nomor katalog: sc-281684)
- Recombinant Mouse BAFF (Carrier-free) (Biolegend, nomor katalog: 591202)
- Purified anti-mouse CD40 antibody (Biolegend, nomor katalog: (102802)
- Recombinant mouse IL-4 (Carrier-free) (Biolegend, nomor katalog: 574302)
- FITC-anti mouse CD19 (Biolegend, nomor katalog: 101506)
- PE anti-mouse CD38 (Biolegend, nomor katalog: 102708)
- PE Mouse Anti Brdu-set (Bioscience, nomor katalog: 556029)
- FITC Annexin V Detection Kit with PI (Biolegend, nomor katalog: 640914)
- NFkB p65 Antibody (F-6) (Santa Cruz, nomor katalog: sc-8008)
- RPMI 1640 Medium, powder (Gibsco, ThermoFisher Scientific, nomor katalog:
 31800022)
- Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4 (Sigma-Aldrich, nomor katalog:
L2630)
- Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X) (Biolegend, 421002)
- Cell staining buffer (Biolegend, nomor katalog: 420201)

(Bukti pembayaran terlampir)

3. Peminjaman laboratorium 100 % - Disetujuinya pemakaian laboratorium Farmakologi FKUB sebagai tempat perawatan
mencit selama 8 bulan
- Disetujuinya pemakaian laboratorium Biomedik FKUB sebagai tempat pengukuran
variabel (Flow sitometri dan imunohistokimia)
4. Pemesanan mencit 100 % Didapatkan sebanyak 150 mencit Balb/c betina dengan kondisi sehat, usia 6-8
minggu, dan berat 25-30 gram yang diperoleh dari lembaga Pusvetma Surabaya

(bukti pembayaran terlampir)

5. Aklimatisasi mencit 100 % Aklimatisasi mencit dilakukan di laboratorium Farmakologi FKUB selama 1 minggu
sebelum dilakukan perlakuan

Terlaksana pada tanggal 6-12 Juni 2014

6. Pemberian pristane 100 % Injeksi pristane dilakukan pada kelompok kontrol positif (75 ekor) pada tanggal 13
Juni 2014

Injeksi dilakukan di Laboratorium Farmakologi FKUB

Evaluasi dilakukan 1 minggu paska injeksi pada tanggal 20 Juni 2014 untuk melihat
respon paska injeksi pristane
 DOKUMENTASI KEGIATAN
PENELITIAN HEWAN COBA LUPUS DIINDUKSI PRISTANE

Kegiatan Rapat Koordinasi Tim Peneliti

Pemeliharaan Mencit Hewan Coba di Laboratorium Farmakologi FKUB

Injeksi Pristane pada Mencit Hewan Coba secara Intraperitoneal