Identifikasi Bakteri dengan Gas Chromatography pada

Asam Lemak Seluler

Pendahuluan
Selama bertahun-tahun, analisis asam lemak rantai pendek (volatile
asam lemak, VFA) telah secara rutin digunakan dalam identifikasi
bakteri anaerob. Dalam berbagai makalah ilmiah, asam lemak antara 9 - 20 karbon
juga digunakan untuk mengkarakterisasi genera dan spesies bakteri, khususnya
organisme Gram negatif nonfermentatif. Dengan kemunculannya gabungan dari
kolom kapiler silika (yang memungkinkan pemulihan asam hidroksi dan resolusi
banyak isomer), itu menjadi praktis untuk menggunakan kromatografi gas sel utuh
metil ester asam lemak untuk mengidentifikasi berbagai organisme.

Asam lemak ditemukan di bakteria

Lebih dari 300 asam lemak dan senyawa terkait ditemukan pada bakteri yang
dianalisis dalam Penelitian MIDI dan Laboratorium Pembangunan. banyaknya
informasi yang terkandung dalam senyawa ini dapat diperkirakan dengan megingat
tidak hanya ada atau tidaknya masing-masing asam, tetapi juga dengan
menggunakan data dalam mode kuantitatif. Sedangkan kemampuan teoritisnya
membedakan antara 2.300 kombinasi yang berbeda tidak praktis karena distribusi
nonrandom dalam kelompok bakteri, sejumlah besar asam lemak menciptakan
kekuatan "penamaan" yang besar untuk Sherlock MIS. Sherlock MIS menggunakan
asam lemak 9-20 karbon panjangnya. Puncaknya secara otomatis dinamai dan
dikuantifikasi oleh sistem. Rantai asam bercabang mendominasi dalam beberapa
Gram positif bakteri, sedangkan asam hidroksi rantai pendek sering menjadi ciri
lipopolisakarida dari bakteri Gram negatif. Itu struktur dari beberapa senyawa ini
ditunjukkan pada Gambar 1. Dalam catatan ini, semua senyawa akan disebut
sebagai asam lemak, meskipun senyawa sebenarnya mungkin aldehida,
hidrokarbon, atau dimetil asetal, dan biasanya dianalisis sebagai metil ester. Sistem
penamaan yang digunakan dalam catatan ini adalah untuk hitung karbon dari ujung
"omega" (yaitu berlawanan dengan karboksil akhir) dan untuk menunjukkan struktur
lain di mana diketahui. Itu berbagai kombinasi fitur dapat menghasilkan sangat besar
jumlah asam lemak. Padahal sebagian besar identifikasi asam lemak telah
dikonfirmasi oleh spektroskopi massal, beberapa masih terdaftar sebagai "tidak
diketahui" atau dengan surat yang menunjuk bahwa dobel posisi ikatan dan / atau
konfigurasi belum dikonfirmasi.

Gambare ndek seng english soale gaiso dipindah

Penanaman Bakteri
Profil asam lemak seluler yang paling stabil dan dapat direproduksi dicapai dengan
mengatur kondisi pertumbuhan dengan hati-hati. Beberapa makalah ilmiah telah
melaporkan efek pertumbuhan suhu dan media pertumbuhan yang berbeda pada
komposisi bakteri asam lemak. Untuk meminimalkan variabel ini, yang spesifik suhu
dan media pertumbuhan telah dipilih di setiap bagian. Sebagai contoh, kebanyakan
bakteri aerobik akan tumbuh dengan baik Trypticase Soy Broth Agar (TSBA), yang
terdiri dari 30g Trypticase Soy Broth dan 15g agar (BBL). Bakteri aerobik, yang tidak
tumbuh dengan baik di TSBA, ditanam di media yang paling sering digunakan untuk
pertumbuhan di laboratorium (misalnya Legionella pada arang buffered ekstrak ragi,
dan Haemophilus pada agar coklat). Suhu yang dipilih untuk database TSBA adalah
28 ° C sebagai suhu umum pertumbuhan berbagai organisme. Data lainnya, CLIN,
menggunakan 35 ° C dan darah agar (Trypticase Soy base) sebagai standar,
dengan media khusus untuk organisme tertentu.

Tabel 1 Perpustakaan Standar Sherlock

Untuk bakteri anaerobik, set data berbasis lempeng-nya menggunakan pertumbuhan

pada 35 ° C pada infus otak-hati dengan suplemen. Database yang berisi lebih dari
800 entri dikembangkan (oleh VPI Anaerobe Lab) menggunakan pertumbuhan
semalaman dari pepton-ekstrak khamir-glukosa.
Pengaruh usia diminimalkan kekeruhan pada saat . Saat menggunakan lempeng,
periode pertumbuhan 24 jam untuk aerob dan 48 jam untuk anaerob. Standarisasi
umur fisiologis dari pertumbuhannya adalah diperoleh dengan pilihan sektor dari
kuadran beruntun di lempeng (Gambar 2). Organisme yang tumbuh lambat mungkin
diinkubasi untuk jangka waktu yang diperlukan untuk mendapatkan pertumbuhan
yang memadai.

Gambar 2 garis kuadran

REAGEN

Empat reagen diperlukan untuk memisahkan asam lemak dari lipid:

Reagen 1, Saponifikasi — 45g natrium hidroksida, 150 ml metanol, dan 150 ml air
suling. Dispensing melalui penggunaan autopipet menjamin reproduktifitas dan
memungkinkan sejumlah besar tes dalam sehari. Reagen 2, Metilasi - 325ml
bersertifikat 6.0N asam hidroklorida dan metil alkohol 275 ml. Ini menjatuhkan pH
larutan di bawah 1,5 dan menyebabkan metilasi (untuk peningkatan volatilitas dalam
kolom parsial polar) dari lemak AC id. Asam lemak metil ester kurang larut dalam
fase berair pada titik ini.
Reagen 3, Ekstraksi — 200 ml heksana dan metil 200ml tert-butil eter. Ini akan
mengekstrak metil ester asam lemak ke dalam fase organik untuk digunakan dengan
kromatografi gas.
Reagen 4, Pembersihan Sampel — 10.8g natrium hidroksida dilarutkan dalam air
suling 900ml. Prosedur ini mengurangi kontaminasi dari port port injeksi, kolom, dan
detektor. Lebih dari 10.000 analisis dapat dilakukan pada kolom sebelum
membutuhkan perawatan apa pun.

PENGOLAHAN SAMPEL
Lima langkah untuk menyiapkan ekstrak siap GC diilustrasikan pada Gambar 3.

Pemanenan — Lingkaran 4mm digunakan untuk memanen sekitar 40mg sel bakteri
dari kuadran ketiga (kedua atau kuadran pertama jika pertumbuhan lambat) dari
kuadran lempeng bergaris. Sel-sel ditempatkan di tabung pertumbuhan yang bersih
ukuran 13x100
Saponifikasi — 1.0ml of Reagent 1 ditambahkan ke masing-masing tabung berisi
sel. Tabung disegel dengan aman teflon berjajar topi (teflon lined caps) di vortex
sebentar dan dipanaskan dalam air mendidih mandi untuk ca. 5 menit, pada saat
tabung (kyk mendidih) divortex (diayun ayunkan) selama 5-10 detik dan dimasukan
kembali kedalam air untuk menyelesaikan pemanasan 30 menit.
Metilasi - Tabung yang sudah dingin dibuka tutupnya, 2ml dari Reagen 2
ditambahkan. Tabung ditutup dan sebentar divortex. Setelah vortexing, tabung
dipanaskan selama 10 ± 1 menit pada 80 ° ± 1 ° C. (Langkah ini sangat penting
dalam waktu dan suhu.)
Ekstraksi - Penambahan 1,25 ml Reagen 3 kedalam tabung lalu disumbat dan
diletakan lembut pada rotator klinis selama sekitar 10 menit. Tabung yang tidak
tertutup dan berair (dibawah) fase, dipipet dan dibuang.
Base Wash— +- 3ml Reagen 4 ditambahkan ke fase organik yang tersisa di tabung,
tabung diambil kembali, dan diletakkan selama 5 menit. saat tidak tertutup, sekitar
2/3 fase organik dipipet ke dalam vial GC yang dibatasi dan siap untuk analisis.

FAKTOR PERANGKAT KERAS

Perangkat Lunak Sherlock MIS hanya dapat digunakan dengan Agilent teknologi
kromatografi gas 5890, 6890 atau 6850. Konfigurasi unik Sistem Sherlock dirancang
untuk analisis optimal dari metil ester asam lemak oleh gas kromatografi.

Ultra 2 Column — 25m x 0.2mm phenyl methyl silicone gabungan dari kolom
kapiler silika memiliki kedua kromatografi kinerja dan umur kolom yang diinginkan
untuk rutinitas analisis ekstrak bakteri. Kolom wajib dimiliki lebih dari 4.000 pelat
teoritis per meter untuk puncak dengan k = 7 hingga 9. Karena fase diam terhubung
dengan tabung silika, akan sedikit berisik dan berguncang (? Pokok e obah obah)
selama suhu proses terprogram.
Gas Chromatograph — saat program, suhu menurun dari 170 ° C hingga 270 ° C
pada 5 ° C per menit. Mengikuti analisis, peningkatan balistik hingga 300 ° C
memungkinkan pembersihan kolom selama 2 menit. Ionisasi detektor yang menyala
memungkinkan hasil selisih dinamis yang besar dan sensitifitas yang tinggi.
Hidrogen adalah gas pembawa, nitrogen adalah "Makeup" gas, dan udara
digunakan untuk mendukung nyala api dari ionisasi detektor
Autosampler — Penggunaan autosampler memungkinkan sistem untuk
dioperasikan tanpa pengawasan hingga 2 hari sekaligus. Sampel login ke dalam
tabel sampel terkomputerisasi dan semuanya sampling (termasuk sampel STAT)
dilakukan secara otomatis.
Komputer — Sinyal elektronik dari detektor GC diteruskan ke komputer di mana
integrasi puncak terjadi dilakukan. Data elektronik disimpan pada hard disk dan
komposisi ester metil asam lemak dari sampel adalah dibandingkan dengan
database yang tersimpan menggunakan pola Sherlock perangkat lunak pengenalan
Kalibrasi dan penamaan puncak

Sherlock SIM menggunakan standar kalibrasi eksternal yang dikembangkan dan

diproduksi oleh Microbial ID, Inc. Standar tersebut adalah campuran dari lemak
jenuh dirantai lurus asam dari 9 hingga 20 karbon panjangnya (9: 0 hingga 20: 0)
dan lima asam hidroksi. Semua senyawa ditambahkan secara kuantitatif bahwa
kinerja kromatografi gas dapat dievaluasi oleh perangkat lunak setiap kali campuran
kalibrasi dianalisis. Senyawa hidroksi sangat sensitif terhadap perubahan dalam
hubungan tekanan / temperatur dan kontaminasi dari port port injeksi. Akibatnya,
senyawa-senyawa yang terbentuk berfungsi sebagai pemeriksaan kontrol kualitas
untuk sistem Data waktu retensi diperoleh dari menyuntikkan kalibrasi campuran
dikonversi ke Ekuivalen Rantai Panjang (ECL) data untuk penamaan asam lemak
bakteri. Nilai ECL untuk setiap asam lemak dapat diturunkan sebagai fungsi elusi
nya waktu dalam kaitannya dengan waktu elusi dari serangkaian dikenal asam
lemak rantai lurus. Dimana Rtx adalah waktu retensi x; Rtn adalah waktu retensi dari
metil ester asam lemak jenuh yang mendahului x; Rt (n + 1) adalah waktu retensi
metil ester asam lemak jenuh eluting setelah x. Dengan demikian, mungkin saja,
dibandingkan dengan standar eksternal, untuk menghitung nilai ECL untuk setiap
senyawa mengikuti analisis. GC dan kolom memungkinkan windows diatur 0,010
unit ECL memberikan presisi besar dalam resolusi isomer. Setelah menamai puncak
dalam sampel yang tidak diketahui, Sherlock membandingkan nilai-nilai ECL untuk
yang paling stabil seri (mis. rantai lurus atau rantai cabang jenuh) ke nilai dan nilai
tertinggi dari tabel penamaan desktop dapat mengkalibrasi ulang secara internal jika
perbedaan yang cukup terdeteksi. Fitur ini memungkinkan sistem dijalankan hingga
dua hari tanpa pengawasan tanpa khawatir tentang penyimpangan antar jalur.

PERPUSTAKAAN
Perpustakaan Sherlock terdiri dari lebih dari 100.000 strains analisis yang diperoleh
dari para ahli dan dari koleksi percobaan. percobaan dikumpulkan dari seluruh dunia
untuk dihindari bias geografis potensial. kemungkinan, 20 atau lebih strain dari suatu
spesies atau subspesies dianalisis untuk membuat entri. Ketika subkelompok
kromatografi ditemukan dalam a takson, lebih banyak strain diperoleh untuk
menggambarkan masing-masing kelompok. Metode budaya dan perpustakaan yang
sesuai adalah ditunjukkan di bidang nama sampel saat masuk komputer. Analisis
hasil sampel yang tidak dikenal dalam sebuah perbandingan otomatis dari komposisi
yang tidak diketahui saring ke database yang disimpan menggunakan matriks
kovarian, pokok analisis komponen dan perangkat lunak pengenalan pola. Matriks
kovarians memperhitungkan mole-for-mole hubungan konversi satu asam lemak ke
yang lain (mis. 16: 0 hingga 16: 1 karena tindakan desaturase), yang mungkin terjadi
dalam kaitannya dengan pergeseran suhu atau perbedaan usia. Perangkat lunak
pengenalan pola menggunakan perhitungan salib istilah (misalnya rasio antara
jumlah asam lemak) sebagai tambahan dasar komponen utama. Perbedaan halus
antara biovars atau subspesies tergantung pada kekuatan perangkat lunak
pengenalan pola untuk membedakan pada tingkat ini. Pustaka dibuka secara
terbuka (yaitu tidak dibatasi oleh himpunan terbatas uji biokimia) dan jumlah spesies
di dalamnya besar dan terus berkembang. Perpustakaan hanya dibatasi oleh MIDI
kemampuan untuk mendapatkan jumlah strain yang memadai untuk membuat entri.
Tentu saja, beberapa kelompok bakteri lebih bisa menerima analisis komposisi asam
lemak untuk identifikasi daripada yang lain. Ini berkaitan dengan apakah galur yang
dikarakterisasi baik tersedia dan apakah "spesies" dapat dibenarkan atas dasar
Hubungan DNA (misalnya Escherichia coli terkait pada tingkat spesies ke Shigella
dysenteriae [lihat Brenner, Int. J. Syst. Bakteriol. 23: 298-307).
RINGKASAN

Sistem Identifikasi Mikroba Sherlock sepenuhnya

sistem analitik kromatografi gas otomatis, yang
mengidentifikasi bakteri berdasarkan profil asam lemak unik mereka.
Sistem akan menganalisis sekitar 45 sampel per hari (dengan
menara ganda 90 sampel per hari dapat dianalisis), dengan biaya
sekitar $ 1,50 per sampel dalam bahan habis pakai laboratorium standar.
Karena seorang teknisi dapat mengekstrak 75 sampel per hari,
waktu operator per sampel rata-rata sekitar 6 menit.
Karena tidak ada tes subyektif yang diperlukan, penamaannya adalah
sangat obyektif dan dapat direproduksi.