LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI

ACARA 2
TEKNIK PEWARNAAN BASIL TAHAN ASAM (BTA)

KELOMPOK 1
Nama kelompok dan NIM

D3 KEPERAWATAN
SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN (STIKes) MUHAMMADIYAH
PRINGSEWU LAMPUNG
TAHUN 2017
1. DASAR TEORI

A. TEKNIK PEWARNAAN
Bakteri sangat sulit diamati jika menggunakan mikroskop cahaya biasa.
Hal tersebut dikarenakan sifat mikroorganisme yang tidak mampu mengabsobsi
dan membiaskan cahaya. Oleh karena itu bakteri hanya akan tampak tembus
pandang dan hal tersebut akan mempersulit proses pengidentifikasian. Untuk
mengatasi permasalahan tersebut diperlukan teknik pewarnaan agar terdapat
kontras antara sel bakteri dan latar belakangnya.
Pewarnaan bertujuan untuk mengamati morfologi sel bakteri. Sebelum
dilakukan pewarnaan, perlu dilakukan penyiapan olesan dan fiksasi bakteri.
Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya
dengan metanol. Fiksasi bertujuan untuk melekatkan bakteri pada gelas objek,
mematikan bakteri serta sel bakteri supaya terlihat jelas setelah diwarnai.

B. PEWARNAAN BASIL TAHAN ASAM (BTA)

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang memiliki kandungan lemak
lebih tebal, sehingga dalam pengamatannya tidak dapat diwarnai menggunakan
pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain).
Kelompok bakteri tersebut disebut sebagai bakteri tahan asam (BTA) karena
kemampuan mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan
pemucat. Golongan bakteri BTA pada umumnya bersifat patogen pada manusia
diantaranya adalah Mycobacterium tuberculosis.
Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat
menyebabkan penyakit tuberculose (TBC). Bakteri tersebut termasuk gram
positif, berbentuk basil. panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul,
pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan
suhu normal manusia. Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan
pernafasan. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum
penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC
berwarna merah.
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam mampu
memilahkan kelompok Mycobacterium dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri
ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama
 (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan
asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam
karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol
fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna

2. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mempelajari dan mengenal cara pewarnaan tahan asam.
2. Melihat bentuk bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.

3. BAHAN DAN ALAT

A. Alat-alat
a. Objek glass
b. Lidi
c. Api bunsen
d. Rak pewarnaan
e. Pipet tetes
f. Botol semprot
g. Label pensil kaca
h. Mikroskop
B. Bahan
a. Sputum
C. Reagen
a. Carbol fuchsin 0,3%
b. Asam alkohol 3%
c. Methylene blue 0,3%
d. Oil imersi
e. Aquades

4. CARA KERJA
1) Pembuatan Sediaan
a. Alat pelindung diri (APD) digunakan dengan baik, benar, dan lengkap.
b. Alat dan bahan disiapkan.
c. Objek glass diambil, difiksasi, lalu diberi label.
d. Membuka tutup tabung yang berisi sampel.
 e. Sampel sputum diambil dengan lidi pada bagian yang berlendir.
f. Dibuat apusan pada objek glass.
g. Sediaan diletakkan pada posisi miring dan dikeringkan pada suhu
kamar.
h. Mulut tabung dipanaskan dan ditutup kembali.
2) Fiksasi
a. Fiksasi dilakukan dengan cara mengelilingi kaca preparat/objek glass
pada api bunsen sebanyak tiga kali.
3) Pewarnaan BTA
a. Sediaan diletakkan pada rak pewarnaan.
b. Sediaan ditetesi cat ZNA (Carbol fuchsin 0,3%), dipanaskan sampai
menguap (jangan sampai mendidih), kemudian ditunggu 5 menit, lalu
dibilas dengan aquades.
c. Sediaan ditetesi ZNB (Asam alkohol 3%), kemudian ditunggu ½
menit, lalu dibilas dengan aquades.
d. Sediaan ditetesi ZNC (Methylene blue 0,3%), kemudian ditunggu 1
menit, lalu dibilas dengan aquades.
e. Sediaan dikering anginkan.

4) Pembacaan Preparat BTA

a. Sediaan diamati menggunakan mikroskop lensa objektif perbesaran
10X untuk mencari lapang pandang.
b. Preparat ditetesi 1 tetes oil imersi.
c. Preparat diamati dengan lensa objektif pembesaran 100X.
d. Bila ditemukan BTA pada sediaan, maka jumlah BTA dihitung per
lapang pandang, dan dicatat jumlahnya.
5. HASIL PENGAMATAN
1) Struktur Bakteri Tahan Asam

No Gambar Keterangan
1 Nama Spesies:

Perbesaran:
Reagen:
Warna:
Bentuk:

6. PEMBAHASAN
Berisi:
1) Prinsip dan tujuan Pewarnaan BTA
2) Prosedur teknik pewarnaan BTA
3) Fungsi alat-alat yang digunakan dalam pewarnaan BTA
4) Fungsi dari masing-masing zat pewarna yang digunakan (Carbol fuchsin,
Asam alkohol, Methylene blue)
a. Contoh: Penambahan asam alkohol untuk membilas atau
melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri
(mikroorganisme).
5) Analisa hasil pengamatan:
a. Spesies bakteri BTA
b. Karakteristik bakteri BTA tersebut
c. Jelaskan singkat dan padat patologi dan patofisiologi bakteri BTA
tersebut
7. KESIMPULAN DAN SARAN
8. DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. New York : John Wiley &
Sons.
Dwidjoseputro. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan dan
Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat.Bandung : Citra Aditya Bakti.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : P.T Gramedia Pustaka Utama.
Jawetz, Melnick, Adelberg’s. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Salemba
Medika.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo
Persada.
Pelczar, M. J. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta : UI – Press.
1. Pembuatan dan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)
 Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam (BTA) yang
menggunakan tiga jenis cat Ziehl Neelson (ZN) yaitu carbol fuchsin 0,3 %,
asalm alcohol 3 % dan methylene blue 3 %. Dalam pengecatan ini digunakan
sample sputum.
 Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak yang
menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain yang
ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar bakteri
tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri
menjadi lebih mudah, tetapi apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis.

Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson yng
menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :

1. Pewarnaan dengan Carbol Fuchsin 3 %

Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus dinding dari Bakteri tahan asam,
sehingga dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel bakteri tersebut sehingga
warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan,
pemanasan dilalukan jangan sampai mendidih cukup samapai menguap agar sel-sel
bakteri tersebut tidak rusak.

2. Penambahan larutan asam alcohol 0,3 %

Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna
(decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah mampu
menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam
pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu
samapai 5 menit. Saat penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan
dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat
seperti halnya bakteri BTA.

3. Pemberian zat warna Methylene Blue

  Terakhir dilakukan penambahan Methylene blue. Methylene Blue merupakan
pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
asam alkohol.
 Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang
permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA
terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA
tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak
dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah.

4. Waktu yang dipelukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda. Hal ini dilakukan
untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat pembacaan preparat pada
mikroskop.
 Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan
dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna
pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan
pemanasan.
 Menunggu selama ½ menit setelah penambahan larutan asam alkohol bertujuan
agar zat warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa.
 Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene blue bertujuan
agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA sehingga ada
perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.
 Setelah pewarnaan dan menunggu selama waktu diatas, dilakukan pembilasan
dengan aquadest yang bertujuan untuk membilas zat warna yang berlebih sebelum
dilanjutkan dengan pewarnaan berikutnya.

5. Hal yang perlu diperhatikan

Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna yang
tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol jangan sampai
berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir
sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga
 terlalu sedikit dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak akan
melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu
mendekati warna sel BTA.
Kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades diantara penambahan
pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna
berikutnya.

6. Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA

Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada komponen
dinding selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin (lapisan lemak) yang sangat
banyak sehingga dalam proses penyrapan warna perlu dilakukan pemanasan untuk
memuaikan dinding sel tersebut sehingga pewarna dapat diserap. Namun dalam dinding
sel bakteri non BTA lapisan lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakuka penyerapan
warna tidak perlu dilakukan pemanasan dan pelunturan warna pun sangat mudah
dilakukan saat penambahan asam alkohol.

7. Pengamatan preparat pewarnaan BTA

 Pada pengamatan dengan mikroskop lensa objektif pembesaran 10X terlihat lapang
pandang berwarna ungu, ditemukan sel epitel tenggorokan yang terkelupas saat
pasien mengeluarkan sputum, dan sel bakteri belum terlihat.
 Pada pengamatan dengan mikroskop lensa objektif pembesaran 100X terlihat sel
epitel yang ukurannya semakin besar, dan ditemukan bakteri BTA berwarna merah
dan bakteri non BTA berwarna biru. Pada preparat sputum ditemukan :
 Bakteri BTA berbentuk streptobasil.
 Bakteri BTA berbentuk basil.
 Bakteri BTA berbentuk coccus.