PERCOBAAN 5

ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE

JURNAL PRAKTIKUM BIOKIMIA

oleh :

Diah Ayu Safitri

24030117120037

Departemen Kimia

Fakultas Sains Dan Matematika

Universitas Diponegoro

2019
 LEMBAR PENGESAHAN

Jurnal Praktikum Biokimia

Percobaan 6

Judul Praktikum : Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase

Nama : Diah Ayu Safitri

NIM : 24030117120037

Semarang, 25 September 2019

Menyetujui Mahasiswa Praktikum,

Asisten Praktikum,

Nunung Lailatul K Diah Ayu Safitri

24030115120042 24030117120037
 PERCOBAAN 5

AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE

I. TUJUAN

Menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal.

II. TINJAUAN PUSTAKA

1.1. Enzim
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam
sel hidup dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator reaksi biokimia
yang secara kolektif membentuk metabolisme-perantara dari sel(
Wirahadikusumah, 2001). Dengan adanya enzim, molekul awal yang disebut
substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut
produk (Grisham et al., 1999). Enzim tersusun atas asam-asam amino yang
melipat-lipat membentuk globular, dimana substrat yang dikatalisis bisa
masuk dan bersifat komplementer (Martoharsono, 2006)
1.2. Enzim α-amilase
Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan
atau berfungsi menghidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi
molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan
glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah dengan cara
memecah ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati. Enzim enzim alfa amilase
o
bekerja optimum pada pH sekitar 6 dan pada suhu 60 C. Jika suhu
ditingkatkan, pH optimum juga meningkat sampai sekitar 7. Jika α-amilase
berasal dari Bacillus licheniformis maka akan menghidrolisis pati dengan
hasil utama maltoheksosa, malopentosa dengan jumlah glukosa yang lebih
tinggi (8 – 10%). enzim alfa amilase mampu meningkatkan rasa manis pada
ekstrak sari buah karena aktivitas enzim alfa amilase yang mampu
menghidrolisis pati pada pisang menjadi gula lain yang lebih sederhana (
Darmajana and Agustina, 2008).
1.3. Sifat-Sifat Enzim
 Enzim sebagai suatu senyawa yang berstruktur protein baik murni
maupun protein yang terikat pada gugus non protein, memiliki sifat yang sama
dengan protein lain yaitu : a. dapat terdenaturasikan oleh panas,
b. terpresipitasikan atau terendapkan oleh senyawa-senyawa organik cair
seperti etanol dan aseton juga oleh garam-garam organik berkonsentrasi
tinggi seperti ammonium sulfat,
c. memiliki bobot molekul yang relatif besar sehingga tidak dapat melewati
membran semi permeabel atau tidak dapat terdialisis.
( Poedjiadi, 1994)
1.4. Cara kerja Enzim
Cara kerja enzim dapat dijelaskan dengan dua teori, yaitu teori kunci-
gembok (lock and key theory) dan teori kecocokan yang terinduksi (induced
fit theory).
Menurut Shahib (2005) ada dua teori yang mendukung dalam
penjelasan pembentukan kompleks enzim substrat, teori pertama yang
diajukan oleh Fisher yaitu teori Kunci dan Gembok / “Lock and Key” yang
menjelaskan bahwa adanya kespesifikan enzim terhadap substrat tertentu
yang bentuknya sesuai dengan sisi aktif enzim. Teori kedua adalah teori yang
diajukan oleh Koshland yaitu teori “ Induced Fit” yang menjelaskan bahwa
substrat akan menginduksi suatu perubahan bentuk sisi aktif enzim sehingga
dapat dengan mudah berikatan seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Teori“Lock and Key” dan “Induced Fit” (Shahib, 2005)

 Cara enzim bekerja adalah dengan membentuk senyawa enzim-
substrat, kemudian menghasilkan suatu produk tanpa merubah senyawa enzim
itu sendiri, setelah produk terbentuk maka enzim akan melepaskan diri untuk
membentuk senyawa baru dengan substrat yang lain.
Ada 2 (dua) cara kerja enzim :
1. Lock and key (gembok dan anak kunci)
Setiap enzim memiliki sisi aktif yang tersusun dari sejumlah asam amino.
Bentuk sisi aktif ini sangat spesifik, sehingga hanya molekul dengan
bentuk tertentu yang dapat menjadi substrat bagi enzim.

2. Induced fit (induksi pas)

Sisi aktif enzim merupakan bentuk yang tidak kaku (fleksibel). Ketika
substrat memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif berubah bentuk sesuai
dengan bentuk substrat kemudian terbentuk kompleks enzim-substrat.
Pada saat produk sudah terlepas dari kompleks, maka enzim lepas dan
kembali bereaksi dengan substrat lain.

( Deswita, 2006)

1.5. Komponen Enzim Substrat

Enzim merupakan senyawa organik berupa protein yang berfungsi
sebagai katalis dalam metabolisme tubuh, sehingga disebut juga
biokatalisator.
Komponen penyusun enzim terdiri dari :

1. Apoenzim, yaitu bagian enzim aktif yang tersusun atas protein yang bersifat
labil (mudah berubah) terhadap faktor lingkungan, dan
2. Kofaktor,yaitu komponen non protein yang berupa :
a. Ion-ion anorganik (aktivator)
Berupa logam yang berikatan lemah dengan enzim, Fe, Ca, Mn, Zn, K,
Co. Ion klorida, ion kalsium merupakan contoh ion anorganik yang
membantu enzim amilase mencerna karbohidrat (amilum)

b. Gugus prostetik
 Berupa senyawa organik yang berikatan kuat dengan enzim, FAD
(Flavin Adenin Dinucleotide), biotin, dan heme merupakan gugus
prostetik yang mengandung zat besi berperan memberi kekuatan ekstra
pada enzim terutama katalase, peroksidae, sitokrom oksidase.

c. Koenzim
Berupa molekul organik non protein kompleks, seperti NAD
(Nicotineamide Adenine Dinucleotide), koenzim-A, ATP, dan vitamin
yang berperan dalam memindahkan gugus kimia, atom, atau elektron
dari satu enzim ke enzim lain.

( Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, and Witarto, 2008)

1.6. Faktor – faktor yang mempengaruhi kerja enzim

Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim Beberapa faktor yang
mempengaruhi aktivitas enzim sebagai berikut :
a. Suhu
Enzim mempercepat terjadinya reaksi kimia pada suatu sel hidup.
Dalam batas-batas suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim
akan naik bila suhunya naik. Reaksi yang paling cepat terjadi pada suhu
optimum (Rodwell, 1988). Suhu yang terlalu tinggi akan menyebabkan
enzim terdenaturasi (Poedjiadi, 1994). Pada suhu 0oC enzim tidak aktif
(tidak rusak) dan dapat kembali aktif pada suhu normal (Lay and Sugyo,
1992). Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu ditunjukkan dalam
Gambar 1.

Gambar 1. Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu

(Underwood, 1994).
b. pH
Enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti enzim
mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya,
terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal aminonya,
diperkirakan perubahan kereaktifan enzim akibat perubahan pH lingkungan
(Winarno, 1986). Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ditunjukkan pada
Gambar 2.

c. Konsentrasi enzim
Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju
reaksi enzimatik dimana laju reaksi meningkat dengan bertambahnya
konsentrasi enzim (Poedjiadi, 1994). Laju reaksi tersebut meningkat secara
linier selama konsentrasi enzim jauh lebih sedikit daripada konsentrasi
substrat. Hubungan antara laju reaksi enzim dengan konsentrasi enzim
ditunjukkan dalam Gambar 3.
 Gambar 3. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi
(Poedjiadi, 1994).
d. Konsentrasi substrat
Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada
konsentrasi substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi
substrat meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil
hingga tercapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi
subtrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi (Lehninger, 1982).
e. Aktivator dan inhibitor
Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya.
Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi
enzimatis. Komponen kimia yang membentuk enzim disebut juga kofaktor.
Kofaktor tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti Zn, Fe, Ca, Mn, Cu
atau Mg atau dapat pula sebagai molekul organik kompleks yang disebut
koenzim (Martoharsono, 1984).
Menurut Wirahadikusumah (1997) inhibitor merupakan suatu zat
kimia tertentu yang dapat menghambat aktivitas enzim. Pada umumnya cara
kerja inhibitor adalah dengan menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim
tidak dapat berikatan dengan substrat dan fungsi katalitik enzim tersebut akan
terganggu (Winarno, 1986).

1.7. Inhibitor Enzim

Seringkali enzim dihambat oleh suatu zat yang disebut inhibitor, ada dua
jenis inhibitor yaitu sebagai berikut:
a. Inhibitor kompetitif

Inhibitor kompetitif adalah inhibitor yang bersaing aktif dengan substrat

untuk mendapatkan situs aktif enzim. Inhibitor ini disebabkan oleh
senyawa tertentu yang mempunyai struktur mirip dengan substrat saat
reaksi enzim akan terjadi. Misal, sianida bersaing dengan oksigen dalam
pengikatan Hb.

Pada penghambatan ini zat – zat penghambat mempunyai struktur yang

mirip dengan struktur substrat. Dengan demikian baik substrat maupun zat
penghambat berkompetisi atau bersaing untuk bersatu dengan sisi aktif
 enzim , jka zat penghambat lebih dulu berikatan dengan sisi aktif enzim ,
maka substratnya tidak dapat lagi berikatan dengan sisi aktif enzim.

b. Inhibitor nonkompetitif

Inhibitor nonkompetitif adalah inhibitor yang melekat pada sisi lain

selain situs aktif pada enzim, yang lama kelamaan dapat mengubah sisi
aktif enzim. Inhibitor umpan balik disebabkan oleh hasil akhir suatu
rangkaian reaksi enzim yang menghambat kerja enzim pada reaksi
pertama. Pada penghambatan ini, substrat sudah tidak dapat berikatan
dengan kompleks enzim- inhibitor, karena sisi aktif enzim berubah
(Bahagiawati, 2005).

1.8. Inhibitor α-amilase

Inhibitor α-amilase adalah protein yang menghambat enzim amilase di
dalam saluran pencernaan (midgut) serangga. Enzim amilase diperlukan oleh
serangga, terutama serangga yang makan biji-bijian dan ubi yang kaya dengan
pati. Pati ini harus hidrolisis menjadi molekul karbohidrat yang lebih
sederhana (kecil) seperti disakarida dan monosakarida, agar dapat digunakan
dalam sistem metabolisme serangga. Dengan dihambatnya pemecahan pati
oleh inhibitor α-amilase maka serangga tidak mendapatkan kebutuhan
karbohidratnya, sehingga dapat berakibat fatal bagi serangga tersebut.
Beberapa jenis inhibitor α-amilase telah diisolasi dari berbagai biji tanaman,
seperti Phaseolus vulgaris dan Triticum aestivum. Inhibitor α-amilase dari P.
vulgaris menghambat aktivitas amilase pada ekstrak kasar dari midgut
serangga Lepidoptera, seperti Spodoptera littoralis, Agrotis ipsilon, dan
Plodia interpunctella (Gutierrez et al. 1993).Inhibitor ini juga menghambat
aktivitas amilase di midgut Callosobruchus maculatus dan Tribolium
confusum (Bahagiawati, 2005).

1.9. Fraksinasi dalam Pemurnian kitin deasetilase

Pemurnian fraksi dilakukan dengan kromatografi pertukaran anion.
Hasil pemurnian dengan kromatografi pertukaran anion menunjukkan bahwa
kitin deasetilase memiliki 3 (tiga) buah fraksi a8ktif dengan aktivitas tertinggi
pada fraksi ke-76. Karakterisasi biokimiawi menunjukkan bahwa kitin
 deasetilase mempunyai pH dan suhu optimum masing-masing 8 dan 55 oC,
stabil terhadap panas selama 5 jam. Aktivitas enzim dihambat oleh ion logam
Mn, Ni dan Ca (1 mM), namun tidak dipengaruhi oleh EDTA. Ion Mg dan
Na-asetat dapat meningkatkan aktivitasnya. Hasil analisis SDS-PAGE
menunjukkan adanya dengan perkiraan berat molekul 15-67 kDa (Rochima,
2005).
1.10. Klasifikasi Enzim
Klasifikasi enzim secara internasional meliputi: nama golongan dan
macam reaksi yang dikatalisisnya (Wirahadikusumah, 1989) Menurut
Poedjadi (1994), enzim yang dibagi kedalam enam golongan tersebut
digolongkan berdasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisis, keenam golongan
enzim tersebut yaitu :
a. Oksido-reduktase
Enzim yang berperan dalam reaksi oksidasi-reduksi. Enzim yang
termasuk dalam golongan ini ada dua yaitu dehidrogenase dan oksidase.
Contoh enzim dehidrogenase yaitu: alkohol dehidrogenase dan glutamat
dehidrogenase. Contoh enzim oksidase, yaitu: glukosa oksidase dan glisin
oksidase
b. Transferase
Enzim yang berperan dalam reaksi pemindahan gugus tertentu.
Contoh enzim yang termasuk golongan ini adalah metiltransferase,
hidroksimetiltransferase dan aminotransferase.
c. Hidrolase
Enzim yang berperan dalam reaksi hidrolisis. Ada tiga jenis enzim
hidrolase, yaitu jenis yang memecah ikatan ester, memecah glikosida, dan
yang memecah ikatan peptida. Contoh enzim hidrolase yaitu esterase,
lipase, amilase, aminopeptidase, karboksipeptidase, pepsin, tripsin, dan
kimotripsin.
d. Liase
Enzim yang termasuk golongan ini mempunyai peranan penting
didalam reaksi pemisahan suatu gugus dari suatu substrat (bukan cara
hidrolisis) 9 atau sebaliknya. Contoh enzim golongan ini yaitu:
dekarboksilase, aldolase, dan hidratase.
e. Isomerase
 Enzim yang termasuk dalam golongan ini bekerja pada reaksi
perubahan intramolekular misalnya reaksi perubahan glukosa menjadi
fruktosa. Contoh : ribulosafosfat epimerase, dan glukosafosfat isomerase.
f. Ligase
Enzim yang berperan pada reaksi penggabungan dua molekul, oleh
karenanya enzim-enzim tersebut juga dinamakan sintetase. Ikatan yang
terbentuk adalah ikatan C-O, C-S, C-N, atau C-C. Contoh: glutamin dan
piruvat karboksilase.
(Poedjiadi, 1994).
1.11. Salting Out
Apabila campuran dalam larutan ditambahkan dengan garam, dan
konsentrasi garam yang ditambahkan terus ditingkatkan, maka kelarutan
protein dalam campuran tersebut menjadi berkurang sampai pada
konsentrasi tertentu protein akan mengendap dan terpisahkan. Hal ini
merupakan efek dari salting out.
(Scoper, 1998).
2.12 Taksonomi Singkong
Apel adalah jenis buah-buahan, atau buah yang dihasilkan
dari pohon buah apel. Buah apel biasanya berwarna merah kulitnya
jika masak dan (siap dimakan), namun bisa juga kulitnya
berwarna hijau atau kuning. Kulit buahnya agak lembek, daging
buahnya keras. Buah ini memiliki beberapa biji di dalamnya.. Klasifikasi
tanaman singkong adalah sebagai berikut:

Kingdom: Plantae

Divisi: Magnoliophyta

Kelas: Magnoliopsida

Ordo: Rosales

Famili: Rosaceae

Subfamili: Maloideae atau Spiraeoideae[1]

Bangsa: Maleae
 Genus: Malus

Spesies: M. domestica
(Wikipedia)

2.13 Analisa Bahan

2.13.1 Amilum
Sifat Fisik : Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan,
dalam bahasa sehari-hari disebut pati, terdapat pada
umbi, daun, batang, dan biji-bijian.
Sifat Kimia : Terdiri atas dua macam polisakarida yang keduanya
adalah polimer dari glukosa yaitu amilosa (20%-
80%) dan sisanya amilopektin
(Poedjiadi, 1994).
2.13.2 Aquades
Sifat Fisik : Cairan tak berwarna, titik leleh 00C, titik didih 1000C,
tidak berbau dan tidak berasa.
Sifat Kimia : Terdiri dari satu molekul H2O dengan ikatan H-OH
1050
(Daintith, 1994).

2.13.3 Apel

Sifat Fisik : Berwarna hijau , kalau sudah matang berwarna agak

kemerahan, Rasa jika sudah matang manis
Sifat Kimia : Kestabilan,kereaktifan,dan korosif

2.13.4 Buffer Phosfat

Sifat Fisik : Terdiri dari Larutan A = 0,2 M larutan Na-Phospat
monobasis (27,8 g dalam 1000 ml) dan Larutan B =
0,2 M larutan Na-phosphat dibasis (52,65 g)
Sifat Kimia : Bekerja aktif pada penambahan asam, konsentrasi
relatif rendah, kurang berperan dalam plasma, dalam
 menghambat beberapa metabolik enzim termasuk
Karboksilase, Fumarase, dan Fosfoglukomutase
( Sudarmadji, 1997).
2.12.5 Ammonium Sulfat
Sifat Fisik : Kristal berwarna abu-abu sampai putih. Densitas 1,77
g/ml, titik leleh 513oC dengan penguraian
Sifat Kimia : Larut dalam air, tidak larut dalam aseton dan alkohol,
tidak mudah terbakar
(Daintith, 1994).
2.12.6 Iodine
Sifat Fisik : Berwarna ungu tua, titik didih 103,45oC, BM 253,8
g/mol, titik leleh 113,5oC
Sifat Kimia : Larut dalam etanol dan pelarut organik, dapat bereaksi
dengan amilum meunculkan warna biru tua
(Basri, 2003).
II. METODE PERCOBAAN
2.1. Alat dan Bahan
2.1.1. Alat
2. Tabung Reaksi
3. Sentrifuge
4. Pipet Tetes
5. Kain
6. Gelas ukur
7. Gelas beker
8. Penangas Es
9. Lemari Es
1. Blender
2.1.2. Bahan
1. Jagung Manis
2. Amilum
3. Aquades
4. Larutan Iodine
5. Buffer Fosfat
6. Ammonium Sulfat

2.2. Cara kerja

2.2.1. Isolasi enzim α-amilase

400 g jagung
blender

Pemblenderan selama 15 menit

Penyaringan dengan kain

residu filtrat

Sentrifugasi pada 3000 rpm

selama 5 menit

Ekstrak kasar

5 mL Ekstrak kasar
 Tabung Reaksi

-Penambahan 1 mL buffer fosfat

-Penambahan amilum 1% 3 tetes
-Penambahan 3 tetes iodin

hasil

2.2.2. Pemurnian awal enzim α-amilase

50 mL Ekstrak kasar
Gelas beker

Penambahan ammonium sulfat secara perlahan-lahan

Pendiaman selama 1 jam

residu

filtrat

Pensentrifugasian pada 3000 rpm selama 5 menit

Pemisahan endapan dan filtrat

filtrat endapan

Endapan
Gelas beker

Penambahan 1 mL buffer fosfat

Penambahan amilum 1% 3 tetes
Penambahan 3 tetes iodin

hasil
III. DATA PENAMATAN
No Perlakuan Hasil

1 Isolasi enzim α-amilase

- 400 g apel di homogenisasi dengan
200 ml akuades selama 15 menit
- penyaringan dengan kain
- Filtrat disentrifugasi pada 3000 rpm
selama 5 menit
- Ekstrak kasar diUji aktifitas α-
amilase (Kualitatif : dengan substrat
amilum 1% dan larutan iodin

2 Pemurnian awal enzim α-amilase

50 ml - Ekstrak kasar 50 ml + ammonium
sulfat
- Pengadukan menggunakan
magnetik stirer
- Pendinginan
- Campuran disentrifugasi
- Endapan disuspensi
- Enzim diuji aktifitas α-amilase
(Kualitatif : dengan substrat amilum
1%)
IV. HIPOTESA
Percobaan yang berjudul “Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan
memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal. Enzim
α-amilase adalah enzim yang dapat menguraikan amilum yang memutuskan ikatan
enzim α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul. Prinsip dari
percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan
protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap
awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan
untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang
digunakan adalah fraksinasi (yaitu pemurnian yang didasarkan pada pengendapan
secara bertahap) dan sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan
pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah
suatu enzim enzim α-amilase yang telah murnni.
 DAFTAR PUSTAKA

Azmi, 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae Untuk

Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka, Laboratorium Kimia
Jurusan PMIPA FKIP Universitas Riau, Pekanbaru

Bahagiawati, 2005, Isolasi Dan Purifikasi Inhibitor α-Amilase Dari Biji Kacang
Phaseolus Vulgaris, Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Bioteknologi,
Bogor

Basri, S., 2003, “Kamus Kimia“, Erlangga, Jakarta

Cooper, M.D. 1998. Improving Safety Culture : A Practical Guide. London : J.Wiley &
Sons, Chichester
Daintith, 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta.

Darmajana And Agustina, 2008, Pengaruh Konsentrasi Enzim α-Amilase Terhadap

Sifat Fisik Dan Organoleptik Filtrat Bubur Buah Pisang, Balai Besar Teknologi
Tepat Guna – Lipi, Subang

Deswita, 2006, Fungsi Enzim Dalam Metabolisme, SMAN 2 Batusangkar,

Batusangkar

Grisham, Charles M.; and Reginald H. Garrett. 1999. Biochemistry. Saunders College Pub.
Philadelphia. Pp. 426–7.
Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, And Witarto, 2008, Biodegradasi Substrat
Gergajian Kayu Sengon Oleh Jamur, Dept Silvikultur, Fakultas Kehutanan,
IPB, Bogor

Lay, B. W. and Sugyo,H. 1992. Mikrobiologi. Rajawali Pers. Jakarta. 107-112

Lehninger, 1999,” Biokimia Dasar”, Erlangga, Jakarta
Martoharsono, Soeharsono. 2006. Biokimia I. Yogyakarta: UGM Press.
Murray, R.K., D.K. Granner., P.A. Mayes., and V.W. Rodwell. 2000. Biokimia Harper.
Edisi 24. Penerjemah: Hartono, A. ECG, Jakarta.
Poedjiadi, 1994,” Dasar-dasar Biokimia”, UI Press, Jakarta
Rochima, 2005, Pemurnian Dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil Dari
Bacillus Papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan
Dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor, Bandung

Shahib, M.N., 1992, “Seluk Beluk Biokimia dan Penerapan Enzim”, PT.Citra Aditya Bakti,
Bandung
Sudarmadji, S. 1997. Prosedur Analisa Untuk Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty.
Yogyakarta
Uhan, 2013. Klasifikasi Tumbuhan/ Taksonomi Tumbuhan dari Kingdom sampai
Spesieshttp://uhanbiosintang.blogspot.com/2013/02/klasifikasi-tumbuhan-
lengkapklasifikasi.html. Diakses pada 21 September 2019 pukul 20.46 WIB.
Underwood, A.L., Day, R.A., (1994), Analisa Kimia Kuantitatif, edisi ke-4, Erlangga,
Jakarta.
Wikipedia.2019.Apel. https://id.wikipedia.org/wiki/Apel.27 September 2019
Winarno, 1986, “ Kimia Pangan dan Gizi”, PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta
Wirahadikusuma, Muhammad. 2001. Biokimia Protein, Enzim dan Asam Nukleat.
Bandung: ITB
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PERCOBAAN 5

ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE

ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE

Disusun Oleh :

Diah Ayu Safitri 240303117120037

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2019
 ABSTRAK

Percobaan ‘Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan untuk memperoleh
enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang
digunakan adalah apel yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase merupakan
enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam
pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin.
Prinsip dari percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada
pengendapan protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang
merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan
protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein).
Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu proses pemurnian protein yang
didasarkan pada pengendapan secara bertahap)/ dan sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang
telah murni. Dimana semakin besar penambahan amonium selfat maka semakin kecil
endapan yang terbentuk, dengan kata lain enzim semakin murni. Hasil uji kualitatif setelah
penambahan amilum dan larutan iodin yaitu, ekstrak kasar berwarna ungu pudar, Fraksi
I berwana ungu pudar, Fraksi II berwana ungu pudar.

Kata kunci: Enzim α-amilase, Sentrifugasi, Fraksinasi, Apel

III. DATA PENGAMATAN

No Perlakuan Hasil

1 Isolasi enzim α-amilase Diperoleh ekstrak kasar yan

- 200 g apel di homogenisasi dengan berwarna kuning yag setelah
ditambahkan amilum dan iodin
60 ml akuades selama 15 menit
warnanya menjadi ungu dan
- penyaringan dengan kain setelah beberapa saat warna
- Filtrat disentrifugasi pada 200 rpm ungunya menjadi pudar.
selama 5 menit
- Ekstrak kasar diUji aktifitas α-
amilase (Kualitatif : dengan
substrat amilum 1% dan larutan
iodin

2 Pemurnian awal enzim α-amilase

50 ml - Ekstrak kasar 20 ml + ammonium Diperoleh ekstrak yang berupa
sulfat larutan berwarna kuning kental,
- Pengadukan menggunakan lebih kental daripada ekstrak
kasarnya.
magnetik stirer
- Pendinginan Setelah penambahan iodine
- Campuran disentrifugasi warna larutan menjadi:
Fraksi 1: ungu pudar
- Endapan disuspensi
Fraksi 2: ungu pudar
- Enzim diuji aktifitas α-amilase
(Kualitatif : dengan substrat
amilum 1% dan larutan iodin)
IV. HIPOTESA
Percobaan yang berjudul “Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan
memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal. Enzim
α-amilase adalah enzim yang dapat menguraikan amilum yang memutuskan ikatan
enzim α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul. Prinsip dari
percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan
protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap
awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan
untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang
digunakan adalah fraksinasi (yaitu pemurnian yang didasarkan pada pengendapan
secara bertahap) dan sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan
pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah
suatu enzim enzim α-amilase yang telah murnni.
V. PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber

organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah
jagung manis yang merupakan sumber karbohidrat.

Tabel 1. Kandungan Gizi dalam 100 g apel

Sumber :Direktorat Jendral Holtikultura.Depertemen Pertanian 2009

Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan

memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul,
baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip percobaan ini adalah pemurnian
protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting
out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian
protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk
membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode pada percobaan
ini yaitu Fraksinasi (yaitu, pemurnian yang didasarkan pada pengendapan secara
bertahap), Sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada
pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran.

5.1. Isolasi Enzim α-amilase

Dalam percobaan ini digunakan Apel. Apel ini dihancurkan dengan cara
mekanik menggunakan blender dengan tujuan agar dinding sel hancur sehingga
semua komponen yang terkandung dalam jagung manis dapat keluar termasuk
enzim α-amilase. Penghomogenesian dengan aquades dikarenakan enzim α-
amilase larut dalam pelarut air karena sifat keduanya yang sama-sama polar,
struktur enzim α-amilase adalah:
Gugus OH yang terikat pada atom C itulah yanng menyebabkan enzim α-amilase
menjadi bersifat polar, seingga dapat berikatan dengan molekul air melalui ikatan
hidrogen

Karena enzim dapat larut dalam aquadest, maka enzim α-amilase akan terkandung
didalam filtrat setelah dilakukan penyaringan. Sebelum dilakukan
penghomogenasian, jagung manis tidak boleh diperas terlalu keras karena hal ini
akan menyebabkan enzim α-amilase yang terkandung dalam jagung manis akan
menjadi sedikit karena terbawa oleh filtrat/cairan hasil perasan karena kadar air
yang terlalu banyak ikut terperas. Pelarutan dengan pelarut organik lainnya
sebenarnya dapat dilakukan, namun hal dapat mengganggu karena adanya
pedenaturasian dengan gugus-gugus tertentu, contoh pelarut seperti air, yaitu
alkohol, tetapi karena pH yang tidak sesuai yaitu < 7 maka enzim akan terdeaturasi.
Mekanisme pendenaturasian protein:

1. Denaturasi Protein karena Panas

Panas dapat memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar
yang menopang struktur sekunder dan tersier molekul protein. Hal ini
disebabkan suhu yang tinggi meningkatkan energi kinetik sehingga
menyebabkan molekul penyusun protein bergetar sangat cepat yang
mengakibatkan sisi hidrofobik dari gugus samping molekul polipetida akan
terbuka.
2. Denaturasi Protein karena Asam dan Basa
Asam dan basa dapat memutuskan jembatan garam pada struktur tersier
protein. Hal ini dsebabkankan asam dan basa akan terdisosiasi menjadi produk
bermuatan ionik. Mekanisme denaturasi berlangsung ketika terjadi reaksi
substitusi antara ion positif dan negatif di dalam garam dengan ion positif dan
negatif yang berasal dari asam atau basa yang ditambahkan.
3. Denaturasi Protein karena Logam Berat
 Reaksi yang terjadi pada logam berat dengan protein mengakibatkan
terbentuknya protein logam yang tidak larut. Protein akan mengalami
presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam
berat) diperlukan pH larutan di atas pI karena protein bermuatan negative
begitu pula sebaliknya. Ion-ion positif tersebut adalah : Ag+, Ca2+, Zn2+, Hg2+,
Fe2+, Cu2+ dan Pb2+. Sedangkan ion-ion negatif meliputi : ion salisilat,
triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. Logam berat juga merusak ikatan
disulfida karena afinitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk menarik
sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein.

Filtrat disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dari residunya.

Supernatan ini merupakan ekstrak kasar. Sementara residu mempunyai komponen
antara lain serat, karbohidrat, lemak, kalsium (Ca) , fosfor (P), vitamin, dan senyawa
lainnya. Setelah didapatkan ekstrak kasar, kemudian dilakukan tahap pemurnian
dengan metode fraksinasi (2 fraksi).

5.2. Pemurnian Awal Enzim α-amilase

Proses pemurnian tahap awal enzim α-amilase dilakukan dengan fraksinasi

dengan menggunakan ammonium sulfat terhadap ekstrak enzim α-amilase yang
dilakukan dengan penambahan garam untuk mengendapkan protein. Prinsip dari
fraksinasi ammonium sulfat ini adalah proses pemurnian protein tahap awal yang
didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out. Penambahan
(NH4)2SO4 terus menerus akan menyebabkan kelarutan enzim α-amilase dalam air
akan berkurang karena enzim dan (NH4)2SO4 akan berkompetisi memperebutkan
molekul air sehingga enzim lama kelamaan akan mengendap. Sentrifugasi
digunakan untuk memisahkan endapan protein dari larutannya.

Garam (NH4)2SO4 ini dapat mengendapkan protein dengan cara menyerap

molekul air. Garam ini bersifat larut dalam air, sehingga ketika ditambahkan garam
ini akan menarik atau mengikat molekul air yang melarutkan protein dalam
campuran, sehingga protein akan berkurang kelarutannya akibat pengikatan
pelarut air oleh (NH4)2SO4. Dalam hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam
ini mempunyai beberapa keuntungan antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi
(533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan pada umumnya tidak
mempengaruhi struktur proein. Selain dengan (NH4)2SO4, proses salting out dapat
menggunakan garam-garam lain, tetapi dalam percobaan ini garam divalen seperti
MgCl2, MgSO4, lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan
KCl. Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim
didalam air.

Dalam hal ini, protein yang diendapkan akan lebih murni dibandingkan
dengan yang tidak difraksinasi, karena pengotor seperti air tidak terendapkan.
Fungsi penambahan buffer PO4 adalah sebagai larutan penyangga agar pH-nya
tidak banyak berubah. Dimana aktivitas α-amilase berada pada range pH 5,4-6,4,
maka digunakan buffer PO4 dengan pH 6,1 (buffer asam). Jika pH-nya di atas pH
optimum maka enzim akan mengalami deprotonasi atau perubahan pH baik di atas
maupun di bawah pH optimum akan menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga
aktivitas enzim menurun. Reaksi enzimatisnya adalah sebagai berikut:

E + S [ES] E + P

Enzim substrat enzim-substrat enzim produk

Pada reaksi enzimatis ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan
substrat dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi yang terjadi:

CH 2OH CH2 OH
O

OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH

CH2 OH CH2 OH CH 2OH

O O
OH OH
OH O OH OH
HO HO
OH OH OH

Maltosa Glukosa

(Murray, 2009)

Campuran selanjutnya didinginkan, untuk mencegah denaturasi protein

yang mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Tetapi jika terlalu dingin maka
aktivitas enzim α-amilase juga kurang optimal. Oleh karena itu pendinginan
dilakukan dalam waktu kurang lebih satu jam.

Proses pengadukan dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat proses

pelarutan. Semakin banyak garam ammonium sulfat yang ditambahkan maka
semakin sulit atau semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk proses pelarutan
tersebut. Karena semakin besar tingkat fraksinasinya, maka semakin besar
konsentrasi enzim dan garam ammonium sulfatnya. Sehingga dengan semakin
besar konsentrasi enzim tersebut, maka protein akan semakin murni/semakin
cepat terhidrolisis. Dengan semakin murninya protein, maka kemampuam
amonium sulfat untuk mengendapkan proten semakin kecil, karena protein
tersebut sudah mengalami hidrolisis.
 Hasil percobaan uji kualitatif (uji adanya protein/yang berarti adanya enzim)
yang dilakukan dengan penambahan amilum dan larutan iodine. Digunakan amilum
sebagai substrat karena enzim α-amilase dapat menghidrolisis amilum.
Penggunaan iodin adalah untuk menunjukan terjadinya hidrolisis oleh enzim α-
amilase. Hasil campuran ini berwarna ungu yang lama-lama memudar, yang
menunjukan adanya protein. Pada ekstrak kasar, Fraksi I, Fraksi II setelah dilakukan
penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu memudar, hal ini
menunjukan didalam larutan tersebut terdapat protein..
VI. PENUTUP
6.1. KESIMPULAN
1. Enzim α-amilase dapat diperoleh dari apel
2. Pemurnian enzim tahap awal dilakukan dengan menggunakan metode
fraksinasi, yaitu penambahan ammonium sulfat.
3. Pada hasil percobaan ekstrak kasar, Fraksi I dan Fraksi II, setelah
dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu yang
memudar .Hal ini menunjukan hasil positif adanya enzim α-amilase.

6.2. SARAN
1. Penghomogenisasian apel dengan air harus dilakukan dengan
perbandingan volume yang sesuai, jangan terlalu encer dan jangan terlalu
pekat
2. Pada saat memeras apel untuk mendapatkan filtrat harus perlahan dan
hati-hati agar residu tidak terbawa dan agar enzim α-amilase yang
terkandung dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa
oleh filtrat/cairan hasil perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut
terperas.
3. Menggunakan variasi sumber amilase lain seperti jagung manis dan
singkong untuk dilakukan perbandingan.
 DAFTAR PUSTAKA

Murray, R.K., D.K. Granner., P.A. Mayes., and V.W. Rodwell. 2000. Biokimia Harper.
Edisi 24. Penerjemah: Hartono, A. ECG, Jakarta.
 LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Praktikum Biokimia

Percobaan 6

Judul Praktikum : Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase

Nama : Diah Ayu Safitri

NIM : 24030117120037

Semarang, 28 September 2019

Menyetujui Mahasiswa Praktikum,

Asisten Praktikum,

Nunung Lailatul K Diah Ayu Safitri

24030115120042 24030117120037
 LAMPIRAN

1. Foto

Gambar 1. Hasil endapan fraksi 2 setelah di sentrifugasi

Gambar 2. Hasil uji iodin dan amilum ekstrak kasar(paling kiri) , fraksi 1 tengah , fraksi 2
, iodin+ amilum(paling kanan)

2. Perhitungan

Perhitungan Fraksi Amonium Sulfat

20
1. Fraksi 0-20 = L x 114 gram/L = 2,28 gram
1000
20
2. Fraksi 20-40 = L x 123 gram/L = 2,46 gram
1000