UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL

BATANG KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia

(Hemsley) A. gray) DENGAN BEBERAPA METODE
UJI

NI NYOMAN AYU PUTRI INTAN PERMATA SARI

17.01.321

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI MAKASSAR
MAKASSAR
2019
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL
BATANG KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia
(Hemsley) A. gray) DENGAN BEBERAPA METODE
UJI

SKRIPSI

Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Mencapai Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

NI NYOMAN AYU PUTRI INTAN PERMATA SARI

17.01.320

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

i
SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI MAKASSAR
MAKASSAR
2019
HALAMAN PERSETUJUAN
SKRIPSI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL

BATANG KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia
(Hemsley) A. Gray) DENGAN BEBERAPA METODE
UJI

NI NYOMAN AYU PUTRI INTAN PERMATA SARI

17.01.320

Disetujui Oleh :

Pembimbing Utama Pembimbing Pertama

ii
Drs. Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt Suwahyuni Mus, S.Si, M.Kes,Apt
NIP. 19630801 199003 1 001 NIDN. 0930058502

Pada Tanggal, 23 Februari 2019

HALAMAN PENGESAHAN
SKRIPSI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL

BATANG KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia
(Hemsley) A. gray) DENGAN BEBERAPA METODE
UJI

NI NYOMAN AYU PUTRI INTAN PERMATA SARI

17.01.320

Disetujui Oleh :

iii
Pembimbing Utama Pembimbing pertama

Drs.Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt Suwahyuni Mus, SSi., M.Kes., Apt

NIP : 19630801 199003 1 001 NIDN : 0930058502

iv
v
 HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Ni Nyoman Ayu Putri Intan Permata Sari

NIM : 17.01.320

Dengan ini menyatakan bahwa data-data yang terdapat dalam skripsi yang
berjudul :

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL BATANG

KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray) DENGAN
BEBERAPA METODE UJI

Adalah MURNI hasil penelitian yang telah saya lakukan. Bilamana di

kemudian hari terbukti bahwa data tersebut merupakan hal jiplakan/plagiat
dari karya tulis orang lain maka sesuai dengan kode etik ilmiah, saya
menyatakan bersedia untuk diberikan sanksi seberat-beratnya termasuk
PENCOPOTAN/PEMBATALAN gelar akademik saya oleh pihak Sekolah
Tinggi Ilmu Farmasi Makassar.
Demikian Surat pernyataan ini agar dapat dipergunakan sebagaimana
mestinya.

Makassar, 23 Februari 2019

Yang membuat pernyataan

Ni Nyoman Ayu Putri Intan Permata Sari

vi
 KATA PENGANTAR

Puja dan puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa,

berkat rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

Pada kesempatan, saya ucapkan terima kasih kepada Ayahanda

I Nyoman Sudanan dan Ibunda Ni Wayan Sudani sebagai orang yang

selalu mendoakan dan menguatkan penulis selama perjuangan hingga

mencapai gelar sarjana ini. Sejauh ini hanya ini yang bisa penulis

persembahkan buat semua jerih payah, doa dan kasih sayang ayah dan

ibu. Terima kasih karena telah mendoakan, mendidik, membimbing, ,

memotivasi bahkan memberikan materi yang saya pergunakan untuk

menuntut ilmu hingga pada saat ini.

vii
 Selanjutnya, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih dan

penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat

Drs. Syaharuddin Kasim, M.Si.,Apt selaku Pembimbing Utama dan Ibu

Suwahyuni Mus, S.Si., M.Kes., Apt selaku Pembimbing Pertama atas

segala perhatian dan bimbingan yang telah diberikan selama proses

penyelesaian skripsi ini.

Penyusunan skripsi ini dapat terselesaikan berkat bantuan dari

berbagai pihak. Penulis mengucapkan terima kasih yang

sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Drs. Sahibuddin A.Gani, Apt., selaku Ketua Yayasan

Almarisah Madani Makassar.

2. Ibu Dr. Nursamsiar, M.Si., selaku Ketua Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi

(STIFA) Makassar.

3. Tim dewan penguji yang telah berkenan untuk menguji skripsi ini dan

memberikan masukan serta saran untuk perkembangan skripsi ini

4. Teman-teman STIFA Transfer B 2017. Terima kasih kepada

teman-teman yang selama ini telah menjadi partner dalam berbagai

hal, kalian semua telah menjadi teman belajar,saling berbagi,

membantu dan memotivasi satu sama lain.

5. Teman- teman seperjuangan Anti Baper dan Bubuhan Parumpa yang

menjadi keluarga kedua saya di Kota Makassar ini, tempat berbagi

suka dan duka, banyak kenangan yang kita lalui bersama-sama

viii
 semoga tetap menjadi keluarga meskipun mungkin nanti tidak

bersama-sama lagi.

. Namun disadari bahwa penyusunan dan penulisan skripsi ini

masih jauh dari kesempurnaan, oleh karena itu kritik dan saran dari

pembaca sangat diharapkan untuk perbaikan dari skripsi ini. Akhir

kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi siapapun yang

membacanya.

Makassar, November 2018

Penulis

Ni Nyoman Ayu Putri Intan P.S

ABSTRAK

JUDUL : Uji Aktivitas AntIoksidan Ekstrak Etanol Batang Kembang

Bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray) Dengan
Beberapa Metode Uji

(Dibimbing oleh : Syaharuddin Kasim dan Suwahyuni Mus)

Kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) merupakan

tumbuhan liar yang memiliki senyawa antioksidan alami. Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etanol batang
kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) dengan
beberapa metode uji. Batang kembang bulan diekstraksi dengan metode
maserasi sederhana menggunakan pelarut etanol 70%. Ekstrak kental
yang dihasilkan diuji skrining fitokimia dan dilakukan penentuan aktivitas
antioksidan menggunakan vitamin C sebagai pembandingnya. Hasil
penelitian yang diperoleh yaitu pada metodi uji DPPH memiliki nilai IC50

ix
sebesar 240,56 ppm, metodi uji ABTS memiliki nilai IC50 129,696 ppm
dan pada metode FRAP dinyatakan ekuivalen dengan vitamin C sebesar
48,2 µmol AEAC/gr sampel.

Kata kunci : Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray), antioksidan,

DPPH, ABTS, FRAP.

x
 ABSTRACT

TITLE : Antioxidan Activity Test Of Ethanol Extract Kembang Bulan

Steams (Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray) With Various
Methods

(Supervised by : Syaharuddin Kasim dan Suwahyuni Mus)

Kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) is wild plant

that has natural antioxidant compounds. This research aims to determine
the antioxidant activity of ethanol extract of kembang bulan steams with
various test methods. Kembang bulan steam extracted by simple
maceration method using 70% ethanol solvent. The thick extract produced
was tested for phytochemical screening and determination of antioxidant
activity test using vitamin C as comparison. The results of the research
obtained are that DPPH test method has an IC50 value of 240,56 ppm,
ABTS test method has an IC50 value of 129,696 ppm and FRAP test
method is expressed equivalent to vitamin C of 48,2 µmol AEAC/gr sample.

Keywords : Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray), antioxidant,

DPPH, ABTS, FRAP.

xi
xii
 DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN UJIAN AKHIR ....................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ................................................ iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ................................................ iv

HALAMANPERYATAAN ORISINALITAS ........................................ iv

KATA PENGANTAR .......................................................................... vi

ABSTRAK ....................................................................................... viii

ABSTRACT ........................................................................................ ix

DAFTAR ISI ....................................................................................... x

Daftar Gambar ................................................................................. xiii

Daftar Tabel ..................................................................................... xiv

Daftar Lampiran .............................................................................. xiv

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................... 1

I.1 Latar Belakang ................................................................................ 1

I. 2 Rumusan Masalah ......................................................................... 4

I. 3Tujuan Penelitian ............................................................................ 4

I. 4 Manfaat Penelitian ......................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................. 5

II. 1 Uraian Tumbuhan ....................................................................... 5

II. 1.1 Klasifikasi Tumbuhan ............................................................... 5

II. 1.2 Nama Lain Tumbuhan................................................................ 6

xiii
II. 1.3 Morfologi Tumbuhan .................................................................. 6

II. 1.4 Tempat Tumbuh ......................................................................... 6

II. 1.5 Kandungan Kimia ....................................................................... 7

II. 1.6 Kegunaan Tumbuhan................................................................. 7

II. 2 Ekstraksi ....................................................................................... 7

II. 3 Radikal Bebas ............................................................................. 9

II. 4 Antioksidan ................................................................................. 10

II. 5 Pengujian Aktivitas Antioksidan ................................................ 13

II. 6 Nilai IC50 (Inhibitor Concentration) ............................................... 15

II. 3.4 Spektrofotometri UV Vis ........................................................... 16

BAB III METODE PENELITIAN ......................................................... 20

III. 1 Jenis Penelitian .......................................................................... 20

III. 2 Waktu dan Tempat Penelitian .................................................... 20

III. 3 Pelaksanaan Penelitian.............................................................. 20

III. 3.1 Sampel Penelitian ................................................................... 20

III. 3.2 Alat dan Bahan ....................................................................... 20

III. 3.3 Prosedur Kerja ........................................................................ 21

III. 3.3.1 Pembuatan Ekstrak Batang Kembang Bulan ....................... 21

III. 3.3.2 Uji Fitokimia ........................................................................ 21

II. 3.3.3 Pembuatan Larutan Induk ..................................................... 23

III. 3.3.4 Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ... 24

III. 3.3.5 Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode ABTS .... 25

III. 3.3.6 Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode FRAP.... 26

xiv
III. 3.4 Variabel Penelitian .................................................................. 28

III. 3.5 Pengumpulan dan Analisis Data ............................................. 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................ 29

BAB V PENUTUP .............................................................................. 36

V.1 Simpulan...................................................................................... 36

V. 2 Saran .......................................................................................... 36

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................... 37

xv
 DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Tumbuhan Kembang Bulan .............................................. 5

Gambar 2. Reksi Oksidasi ABTS Oleh Kalium Persulfat Menghasilkan

ABTS•+ kation radikal dan reaksinya dengan senyawa

antiradikal........................................................................... 14

Gambar 3. Reaksi Penghambatan Radikal DPPH ............................... 15

Gambar 4. Bagian- Bagian Spektrofotometri UV-Vis............................ 17

Gambar 5. Nilai IC50 Ekstrak Etanol Batang Kembang Bulan

Dan Vitamin C .................................................................... 33

xvi
 DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Kategori antioksidan ............................................................. 16

Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia .......................................................... 31

Tabel 3. Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan Vitamin C

Dengan Metode DPPH ........................................................... 49

Tabel 4. Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak

Etanol Batang Kembang Bulan Dengan Metode DPPH ........ 51

Tabel 5. Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak

Etanol Vitamin C Dengan Metode ABTS ............................... 53

Tabel 6. Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak

Etanol Batang Kembang Bulan Dengan ABTS ..................... 55

xvii
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Skema Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Batang

Kembang Bulan ............................................................. 42

Lampiran 2. Skema Uji Aktivitas Vitamin C Dengan Beberapa

Metode Uji ...................................................................... 43

Lampiran 3. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol

Batang Kembang Bulan Metode Uji DPPH .................... 44

Lampiran 4. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol

Batang Kembang Bulan Metode Uji DPPH .................... 45

Lampiran 5. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol

Batang Kembang Bulan Metode Uji DPPH .................... 46

Lampiran 6. Rendemen Esktrak Etanol Batang Kembang Bulan

xviii
 Dengan metode Maserasi .............................................. 47

Lampiran 7. Perhitungan Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

DPPH ............................................................................. 48

Lampiran 8. Perhitungan Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

ABTS ............................................................................. 52

Lampiran 9. Skema Kerja Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

Uji FRAP ........................................................................ 56

Lampiran 10. Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Kembang

Bulan.............................................................................. 59

Lampiran 11. Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Batang Kembang

Bulan ............................................................................ 60

Lampiran 12. Pengujian Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

DPPH ............................................................................. 61

Lampiran 13. Pengujian Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

ABTS ............................................................................. 62

Lampiran 14. Pengujian Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

FRAP ............................................................................. 63

xix
xx
 BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Dewasa ini antioksidan menjadi topik penting dalam berbagai disiplin

ilmu, khususnya dalam bidang kedokteran dan kesehatan. Teori senyawa

radikal dan radikal bebas semakin berkembang. Hal ini didasari karena

semakin dimengerti bahwa sebagian penyakit diawali oleh reaksi oksidasi

yang berlebihan di dalam tubuh (Sayuti dan Yenrina, 2015).

Menurut Sadikin (2001) serangan radikal bebas terhadap molekul di

sekelilingnya akan menyebabkan reaksi berantai, kemudian menghasilkan

senyawa radikal baru. Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas

bermacam – macam, mulai dari kerusakan sel atau jaringan, penyakit

autoimun, penyakit degeneratif, hingga dapat menimbulkan kanker.

Penggunaan senyawa antioksidan semakin berkembang baik untuk

makanan maupun pengobatan seiring dengan bertambahnya

pengetahuan tentang radikal bebas (Boer, 2000).

Tubuh manusia tidak mempunyai cadangan antioksidan dalam

jumlah berlebih, sehingga jika terjadi paparan radikal berlebih, maka tubuh

membutuhkan antioksidan yang berasal dari luar tubuh. Adanya

kekhawatiran akan kemungkinan efek samping dari antioksidan sintetik

menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang sangat potensial

untuk dikembangkan (Sayuti dan Yenrina, 2015).

1
 2

Salah satu tumbuhan yang berkhasiat sebagai antioksidan alami

adalah tanaman kembang bulan (Tithonia diversifolia Hemsley A. Gray).

Penggunaannya oleh masyarakat menggunakan 5 lembar atau setara

2 g daun kembang bulan segar atau yang dikeringkan direbus kemudian

dikonsumsi sebagai obat (Sasmita, et al., 2017). Tumbuhan ini digunakan

sebagai obat sembelit, nyeri perut, gangguan pencernaan, sakit

tenggorokan, nyeri hati, memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi, analgesik,

antimalaria, antivirus, antidiabetes, antimikroba (Mwaura, et al., 2013).

Bagian tumbuhan yang dimanfaatkan untuk pengobatan tradsional adalah

daun, kulit akar, dan batang (Verawati, et al., 2011). Berdasarkan

penelitian Olayinka (2015) tanaman kembang bulan memiliki kandungan

fitokimia yaitu alkaloid, saponin, tanin, terpenoid, flavonoid dan fenol yang

tersebar pada daun, batang, dan akar.

Senyawa flavonoid memiliki potensi sebagai antioksidan karena

memiliki gugus hidroksil yang terikat pada karbon cincin aromatik dan akan

menyumbangkan satu atom hidrogen untuk menstabilkan radikal bebas

(Hamid, et al., 2010). Penelitian Hanifa et al, (2012) menyebutkan

akivitas antioksidan pada ekstrak etanol daun kembang bulan sebesar

4,525 ppm dan termasuk dalam kategori antioksidan yang sangat kuat.

Banyak penelitian aktivitas antioksidan lainnya yang mengacu terhadap

daun kembang bulan. Penelitan pada bagian batang kembang bulan belum

banyak diteliti kadar aktivitas antoksidannya. Berdasarkan penelitian

Magfira (2018) kadar fenolik total pada batang kembang bulan

 3

sebesar 0,38%, kadar senyawa fenol berkontribusi secara signifikan

terhadap aktivitas antioksidan.

Metode uji yang telah dikembangkan untuk penentuan kandungan

antioksidan dalam sampel antara lain dengan metode spektrofotometri

diantaranya adalah DPPH, ABTS, dan FRAP, dimana masing-masing

metode mempunyai prinsip dalam menangkal radikal bebas. Pada metode

FRAP pengukuran berdasarkan transfer elektron yaitu antioksidan akan

mendonorkan elektron sehingga Fe3+ tereduksi menjadi Fe2+. Pada

metode ABTS dan DPPH, metode pengukuran berdasarkan kemampuan

antioksidan dalam dengan cara mendonorkan atom H, pada ABTS

antioksidan mendonorkan atom H ke radikal ABTS+ sedangkan DPPH

mendonorkan atom H ke radikal DPPH yang keduanya menyebabkan

penurunan warna seiring berkurangnya jumlah radikal (Apak, et al., 2007).

Pengukuran antioksidan pada metode uji ini menggunakan

spektrofotometri UV-Vis karena waktu analisisnya relatif cepat dan

hasilnya memiliki ketelitian yang cukup memadai (Hanani, et al., 2005).

Berdasarkan uraian di atas dilakukan penelitian tentang uji aktivitas

ekstrak etanol batang kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A

Gray) dengan beberapa metode uji.

 4

I.2 Rumusan Masalah

Apakah ekstrak etanol batang kembang bulan (Tithonia diversifolia

(Hemsley) A. Gray) memiliki aktivitas antioksidan dengan beberapa

metode uji?

I.3 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etanol batang

kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) dengan

beberapa metode uji.

I.4 Manfaat Penelitian

Menambah pengetahuan tentang aktivitas antioksidan ekstrak etanol

batang kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray)

sehingga memberi informasi keilmuan demi kemajuan ilmu pengetahuan.

5
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Tumbuhan

II.1.1 Klasifikasi Tumbuhan

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Asterales

Suku : Asteraceae

Marga : Tithonia

Jenis : Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray (Hutapea, 1994)

Gambar 1. Tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia

(Hemsley) A. Gray (Sulistyowati, 2015)

5
6
 7

II.1.2 Nama Lain Tumbuhan

Tithonia diversifolia atau tumbuhan kembang bulan mempunyai

beberapa nama lokal, diantaranya Tree marigold, Mexican sunflower

(Amerika); paitan, harsaga (Indonesia); rondo semaya (Jawa Tengah);

Ki pahit (Sunda).

II.1.3 Morfologi Tumbuhan

Tumbuhan kembang bulan berupa tumbuhan perdu dengan tinggi

mencapai 5 m, batang tegak, bulat, berkayu, dan berwarna hijau. Daun

tunggal dengan panjang 26-32 cm, lebar 15-25 cm, ujung dan pangkal

runcing, pertulangan menyirip, dan berwarna hijau. Bunga majemuk

muncul di ujung ranting, tangkai bulat, kelopak berbentuk tabung,

berbulu halus, putik melengkung, dan berwarna kuning. Buahnya

berbentuk kotak, bulat, buah muda berwarna hijau dan buah tua

berwarna cokelat. Biji berbentuk bulat, keras, dan berwarna cokelat.

Tanaman ini berakar tunggang dan berwarna putih kotor (Hutapea, 1994).

II.1.4 Tempat Tumbuh

Umumnya Tithonia diversifolia atau tumbuhan kembang bulan

tumbuh liar di tempat-tempat curam, misalnya di tebing-tebing, tepi sungai,

dan selokan. Tumbuhan kembang bulan tumbuh dengan mudah ditempat

dengan ketinggian 5-1500 meter di atas permukaan laut, juga merupakan

tumbuhan tahunan yang menyukai tempat-tempat terang dan tumbuh di

tempat yang terkena sinar matahari langsung (Sulistijowati, A dan

Gunawan, D., 2001).

 8

II.1.5 Kandungan Kimia

Tithonia diversifolia mengandung komponen bioaktif seperti saponin,

polifenol dan flavonoid pada bagian daun, kulit batang dan akarnya

(Mwanauta, 2014). Metabolit sekunder lain adalah saponin, glikosida dan

tanin (Essiet, 2013). Sedangkan kandungan-kandungan lain dari kembang

bulan adalah karbon dan nitrogen (Hanifa, 2015).

II.1.6 Kegunaan Tumbuhan

Tumbuhan Tithonia diversifolia digunakan dalam pengobatan rakyat

Amerika dan Venezuela yaitu ekstrak batang dan daunnya diambil

secara oral untuk mengobati abses, hematoma, dan kram otot, di Meksiko

dan Nigeria digunakan secara oral untuk pengobatan malaria, pengobatan

kondisi dermatologis termasuk memar,luka, dan infeksi kulit. Orang

Taiwan menggunakan infus daun untuk mengobati diabetes, sedangkan di

Indonesia digunakan untuk pengobatan diabetes, diare, penyakit hati,

sakit perut, dan luka (Ajao dan Moteetee, 2017).

II.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu proses penyarian zat aktif dari bagian

tanaman obat yang bertujuan untuk menarik komponen kimia yang

terdapat dalam bagian tanaman obat tersebut. Proses ekstraksi pada

dasarnya adalah proses perpindahan massa dari komponen zat padat

yang terdapat pada simplisia ke dalam pelarut organik yang digunakan.

Pelarut organik akan menembus dinding sel dan selanjutnya akan masuk

ke dalam rongga sel tumbuhan yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan
 9

terlarut dalam pelarut organik pada bagian luar sel untuk selanjutnya

berdifusi masuk ke dalam pelarut. Proses ini terus berulang sampai terjadi

keseimbangan konsentrasi zat aktif antara di dalam sel dengan

konsentrasi zat aktif di luar sel (Marjoni, 2016).

Ekstrak adalah sediaan kering, kental, atau cair dibuat dengan

menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang sesuai, diluar

pengaruh matahari langsung (DepKes RI, 1979).

Ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai metode dan cara yang

sesuai dengan sifat dan tujuan ekstraksi itu sendiri. Metode ekstraksi

secara dingin bertujuan untuk mengekstraksi senyawa-senyawa yang

terdapat dalam simplisia yang tidak tahan terhadap panas atau bersifat

thermolabil. Metode ekstraksi panas digunakan apabila senyawa-senyawa

yang terkandung dalam simplisia sudah dipastikan tahan panas (Marjoni,

2016).

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur ruangan (kamar) (DepKes RI, 2000). Keuntungan utama

maserasi adalah pada metode ini ekstrak tidak dipanaskan sehingga

kemungkinan kecil bahan alam menjadi terurai (Heinrich, et al., 2005).

Kelemahan utama maserasi adalah memakan banyak waktu, pelarut yang

digunakan cukup banyak dan besar kemungkinan beberapa senyawa

hilang (Mukhriani, 2014). Selain itu, beberapa senyawa memiliki kelarutan

terbatas pada suhu kamar (Heinrich, et al., 2005).

 10

II.3 Radikal Bebas

Radikal bebas adalah suatu molekul atau atom yang mempunyai

satu atau lebih elektron tidak berpasangan. Radikal ini dapat berasal dari

atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion logam transisi. Senyawa radikal

bebas sangat reaktif dan selalu berusaha mencari pasangan elektron agar

kondisinya stabil. Radikal dapat terbentuk secara endogen dan eksogen.

Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses metabolisme

normal didalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal dari bahan

pencemar yang masuk kedalam tubuh melalui pernapasan, pencernaan,

dan penyerapan kulit (Jacinto, 2011).

Radikal bebas dalam jumlah normal bermanfaat bagi kesehatan

misalnya memerangi peradangan, membunuh bakteri, dan mengendalikan

tonus otot polos pembuluh darah serta organ-organ dalam. Sementara

dalam jumlah berlebih mengakibatkan stres oksidatif. Keadaan tersebut

dapat mengakibatkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan,

hingga ke organ tubuh. Oksigen reaktif dapat merugikan molekul dalam

sel, sehingga dapat menghancurkan membran sel, asam nukleat, dan

protein. Peristiwa ini dapat mempercepat proses penuaan dan munculnya

penyakit lain seperti penyakit jantung dan kanker (Jacinto, 2011).

Radikal bebas termasuk hidroksil (OH), superoksida (O2ˉ), oksida

nitrat (NO), nitrogen dioksida (NO2), peroksil (ROO) dan lipid peroxyl

(LOO). Selain itu, hidrogen peroksida (H2O2), ozon (O3), oksigen singlet,

asam hipoklorida, asam nitrat (HNO2), peroksinitrit, dinitrogen trioksida

 11

dan lipid peroksida bukanlah radikal bebas dan umumnya disebut oksidan,

namun dapat dengan mudah menyebabkan reaksi radikal bebas terhadap

organisme hidup (Ganestra, 2007) .

Berbagai kemungkinan dapat terjadi sebagai akibat kerja radikal

bebas, misalnya gangguan fungsi sel, kerusakan struktur sel, molekul

termodifikasi yag tidak dikenali oleh sistem imun, dan bahkan mutasi.

Semua bentuk gangguan tersebut dapat memicu munculnya berbagai

penyakit (Winarsi, 2007).

II.4 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan.

Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi,

dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan

senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat

radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif (Winarsi, 2007).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi

3 kelompok, yaitu :

1. Antioksidan primer

Antioksidan primer disebut juga antioksidan enzimatis. Suatu senyawa

dikatakan sebagai antioksidan primer, apabila dapat memberikan atom

hidrogen secara cepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal

antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yag

lebih stabil. Antioksidan primer sifatnya sebagai pemutus reaksi

berantai, bekerja dengan cara mencegah pembentukan senyawa

 12

radikal bebas baru, atau mengubah radikal bebas yang telah terbentuk

menjadi molekul yang kurang reaktif. Contoh antioksidan primer

adalah Superoksida Dismutase (SOD), Glutation Peroksidase (GPx),

katalase dan protein pengikat logam. Superoksida Dismutase (SOD).

2. Antioksidan sekunder

Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau

antioksidan non-enzimatis. Antioksidan dalam kelompok ini juga

disebut sistem pertahanan preventif. Dalam sistem pertahanan ini,

terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara

mengklat logam, menangkap radikal dan mencegah terjadinya reaksi

berantai. Antioksidan sekunder berperan sebagai pengikat iom-ion

logam, penangkap oksigen, pengurai hidroperoksida menjadi

senyawa nonradikal. Senyawa pengkelat logam yang membentuk

ikatan-ikatan σ dengan logam sifatnya efektif sebagai antioksidan

sekunder karena hanya senyawa ini menurunkan potensil redoks dan

karenanya menstabilkan bentuk teroksidasi dari ion-ion logam.

Antioksidan sekunder meliputi vitamin E, vitamin C, karoten, flavanoid,

bilirubin, dan albumin. Potensi antioksidan ini dengan cara memotong

reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara

menangkapnya (scavenger free radical) sehingga radikal bebas tidak

beraksi dengan komponen seluler.

3. Antioksidan tersierKelompok antioksidan tersier meliputi enzim

DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini

 13

berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas

radikal bebas.

(Sayuti dan Yenrina, 2015).

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dibagi atas :

1. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik meliputi butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi

toluen (BHT) , propil galat, tert-butil hidroksi quinon (TBHQ) dan

tokoferol. Antioksidan alami yang telah diproduksi secara sintetis

untuk tujuan komersial.

2. Antioksidan alami

Antioksidan alami umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik

yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat,

kumarin, tokoferol, dan asam-asam organik polifungsional. Golongan

flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonoid,

isoflavon, flavonol, dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat

meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain.

Senyawa antioksidan alami polifenolik ini adalah multifungsional dan

dapat beraksi sebagai pereduksi, penangkap radikal, pengkelat logam

dan peredam terbentuknya singlet oksigen.

(Trilaksani, 2003).
 14

II.5 Pengujian Aktivitas Antioksidan

1. Pengujian Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)

Metode FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) bekerja

berdasarkan reduksi dari analog ferroin, kompleks Fe 3+ dari

tripiridiltriazil Fe(TPTZ)3+ menjadi kompleks Fe2+, Fe(TPTZ)2+ yang

berwarna biru intensif oleh antioksidan pada suasana asam. Hasil

pengujian diinterpretasikan dengan peningkatan absorbansi dan

dapat disimpulkan sebagai jumlah Fe2+ (dalam mikromolar) ekuivalen

dengan antioksidan standar (Antolovich et al., 2002).

Mekanisme reaksi reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ (Jayanthy, 2011) sebagai

berikut :

K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6

Fe3+ + e- Fe2+

2. Pengujian 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulphonic acid

(ABTS)

Suatu radikal ABTS dapat diproduksi dengan cara oksidasi

kalium persulfat (K2S2O8) sebelum penambahan antioksidan. ABTS

merupakan radikal dengan pusat nitrogen dengan karakteristik warna

biru hijau, ketika tereduksi oleh antioksidan menjadi bentuk nonradikal

yang tidak berwarna (Shalaby, 2013). Prinsip uji ABTS vadalah

penghilangan warna kation ABTS untuk mengukur kapasitas

antioksidan yang langsung bereaksi dengan radikal kation ABTS (Yu,

2008). Pengurangan radikal kation dengan spektrofotometri pada

 15

panjang gelombang 734 nm sebagai persentase penghambatan

(Mastuti, 2013). Reaksi radikal ABTS adalah :

'

Gambar 2. Reaksi oksidasi ABTS oleh kalium persulfat menghasilkan

ABTS•+ kation radikal dan reaksinya dengan senyawa
antiradikal (Oliveiraa, 2014)
3. Pengujian 2,2- diphenyl-1-picrylhyrazyl (DPPH)

Uji peredaman warna radikal bebas DPPH merupakan uji untuk

menentukan aktivitas antioksidan dalam sampel yang akan diujikan

dengan melihat kemampuannya dalam menangkal radikal bebas

DPPH. Sumber radikal bebas dari metode ini adalah senyawa 2,2-

diphenyl-1-picrylhyrazyl. Prinsip dari uji ini adalah adanya donasi atom

hidrogen dari substansi yang diujikan kepada radikal DPPH menjadi

senyawa non radikal difenilpicrihydrazil yang akan ditunjukkan oleh

perubahan warna (Molyneux, 2004). Perubahan warna yang terjadi

adalah perubahan warna dari ungu menjadi kuning, yang berarti

intensitas perubahan warna DPPH berbanding lurus dengan aktivitas

antioksidan untuk merendam radikal bebas tersebut (Rahmawati et al,

 16

2016). Nilai absorbansi DPPH berkisar antara 515-520 nm (Marxen, et

al., 2007).

Gambar 3. Reaksi penghambatan radikal DPPH (Oliveiraa, 2014)

II.6 Nilai IC50 (Inhibitor Concentration)

Nilai penurunan absorbansi DPPH yang diperoleh dapat menentukan

nilai persentase penghambatan radikal DPPH (% inhibisi), dari nilai %

inhibisi dapat ditentukan (Inhibitor Concentration). Nilai merupakan

bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak (ppm) yang mampu

menghambat proses oksidasi sebesar 50%. Semakin kecil nilai berarti

semakin tinggi aktivitas antioksidan (Zuhra, et al., 2008).

Konsentrasi sampel dan persen inhibisinya diplot masing-masing

pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan tersebut

digunakan untuk menentukan nilai dari masing-masing sampel dinyatakan

dengan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC 50

(Nurjanah, et al., 2011).

 17

Tabel 1. Kategori antioksidan (Firdianny, 2013).

Kategori IC50 (ppm)

Sangat Aktif <50

Aktif 50-100
Sedang 101-250
Lemah 250-500

II.7 Uraian Spektrofotometer UV-Vis

Metode spektrofotometri yaitu analisis dengan menggunakan

spektrofotometer. Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat

yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan

sinar dan spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

adalah alat pengukur intesitas cahaya dan ditransmisikan atau yang

diabsorbsi. Spektrofotometri digunakan untuk mengukur energi secara

JKJrelatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan

sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar, 2007).

Spektrofotometer UV-Vis adalah analisis spektroskopik yang

memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dengan panjang

gelombang 200-400 nm dan sinar tampak 400-750 nm dengan memakai

instrumen spektrofotometer. Penyerapan sinar UV dan sinar tampak pada

umumnya dihasilkan oleh eksistasi elektron-elektron ikatan, akibatnya

panjang gelombang pita yang mengabsorbsi dapat dihubungkan dengan

 18

ikatan yang mungkin ada dalam suatu molekul (Gandjar dan Rohman,

2007).

Spektrofotometer Visibel dapat digunakan untuk informasi kualitatif

sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif bahan kimia. Dalam

aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan

sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur (Gandjar dan

Rohman, 2007). Spektrofotometer visibel tersusun dari sumber spektrum

tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan

sampel atau blanko dan alat ini dapat mengukur perbedaan absorbsi

antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar, 2007).

Gambar 4. Bagian-bagian dari spektrofotometer UV-Vis

1. Sumber radiasi

Sebagai sumber cahaya berasal dari lampu Deutrium (H0) untuk UV

dengan panjang gelombang 180 – 400 nm dan lampu Tungsen

(wolfram) untuk Vis dengan panjang gelombang 400 – 800 nm (Rusli,

2009).
 19

2. Monokromator

Monokromator digunakan untuk mendeskripsikan sinar ke dalam

komponen-komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan

dipilih oleh celah (slit). Monokromator berputar sedemikian rupa

sehingga kisaran panjang gelombang dilewatkan pada sampel

sebagai scan instrumen melewati spektrum (Sastrohamidjojo, 2002).

3. Kuvet

Pada umumnya spektrofotometri melibatkan larutan, dengan demikian

diperlukan wadah untuk menempatkan larutan (Rusli, 2009).

4. Detektor

Detektor berfungsi mengubah energi radiasi yang jatuh mengenainya

menjadi suatu besaran yang dapat diukur (Rusli, 2009).

5. Rekorder

Rekorder adalah alat untuk mencatat, dapat berupa gambar atau

angka-angka (Rusli, 2009).

Hal–hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektofotometri

UV-Vis sebagai berikut :

1. Penentuan panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah

panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk

memperoleh panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan

 20

dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang

gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.

2. Pembuatan kurva kalibrasi

Larutan seri dibuat dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai

konsentrasi. Masing–masing absorbansi larutan dengan berbagai

konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan

antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer

terpenuhi maka kurva kalibrasi berupa garis lurus.

3. Waktu operasional

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau

pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu

pengukuran yang stabil (Gandjar dan Rohman, 2007).

21
 BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Jenis penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental

berskala laboratorium.

III.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biofarmaka Fakultas Farmasi

Universitas Hasanuddin Makassar, Laboratorium Kimia Farmasi Sekolah

Tinggi Ilmu Farmasi Makassar pada bulan Agustus 2018 sampai Januari

209i.

III.3 Pelaksanaan Penelitian

III.3.1 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan adalah batang tumbuhan kembang bulan

yang diambil dari kelurahan Tamalanrea Jaya, Kecamatan Tamalanrea,

Kota Makassar, Provinsi Sulawesi Selatan.

III.3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah labu tentukur,

mikropipet, timbangan analitik , herbs dryer, spektrofotometer UV-Vis.

Bahan-bahan yang digunakan antara lain batang kembang bulan

(Tithonia diversifolia) kering, aquades, asam sitrat ,etanol p.a, etanol 70%,

FeCl3, kalium persulfat, DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), ABTS

(2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic acid) diamonium salt), TPTZ,

pereaksi mayer, pereaksi dragendorf, pereaksi wagner, HCl pekat, H2SO4.

20
 21

III.3.3 Prosedur Kerja

III.3.3.1 Pembuatan Ekstrak Batang Kembang Bulan

1. Pengumpulan dan pengolahan sampel

Bagian tumbuhan yang digunakan sebagai sampel yaitu batang

kembang bulan. Batang kembang bulan yang telah dikumpulkan,

dibersihkan dari kotoran-kotoran yang menempel, setelah itu dicuci

menggunakan air mengalir, ditiriskan, dipotong-potong dengan ukuran

tertentu. Dikeringkan di dalam herbs drier pada suhu 45°C selama 6 hari,

setelah sampel kering lalu dihaluskan untuk diproses selanjutnya.

2. Pembuatan Ekstrak Dengan Maserasi

Sebanyak 100 gram simplisia batang kembang bulan yang telah

dihaluskan, dimasukkan ke dalam bejana maserasi dan dibasahi dengan

500 ml etanol 70%, kemudian tambahkan etanol 70% sebanyak 1000 ml.

Ekstraksi menggunakan metode maserasi selama 3 × 24 jam dan

diremaserasi dengan pelarut etanol. Maserat diuapkan hinggga menjadi

ekstrak kental.

III.3.3.2 Uji Fitokimia

Sampel dilakukan skrining fitokima kualitatif untuk mengetahui

beberapa senyawa metabolit sekunder. Uji ini dilakukan berdasarkan

prosedur standar (Kokate et al. 1997, Trease dan Evan 2002, Hegde et al.

2010) :
 22

a. Alkaloid

Ekstrak dilarutkan aquades 3 mL ditambahkan 1 mL HCl

dihomogenkan, lalu dipanaskan lalu disaring. Filtrat dilakukan beberapa

test:

1) Uji Wagner: 1 mL ekstrak ditambahkan dengan reagen wagner, terjadi

endapan merah kecoklatan menunjkan adanya alkaloid

2) Uji Dragendroff”s: 1 mL ekstrak ditambahkan reagen dragendroff,

terjadi endapan jingga menunjukkan adanya alkaloid

3) Uji Mayer: 1 mL ekstrak ditambahkan reagen mayer, terjadi endapan

kekuning-kuningan menunjukkan positif adanya alkaloid.

b. Flavonoid

1) Uji NaOH 10% : Sampel dilarutkan dalam air dan disaring lalu

ditambahkan 2 mL NaOH 10% terjadi perubahan warna menjadi

kuning coklat.

2) Uji Fenolik : Sampel 0,5 ditambahkan air kemudian di teteskan Feri

klorida, perubahan warna hijau-biru atau ungu menunjukan adanya

kelompok fenolik.

3) Uji Shinoda : Sampel dilarutkan dalam etanol lalu dipanaskan,

kemudian dimasukkan potongan magnesium, lalu diteteskan dengan

HCl. Warna merah muda, orange, atau warna merah dan ungu

menunjukan positif adanya flavonoid.

 23

c. Saponin

Sebanyak 1 gram ekstrak dilarutkan dengan aquadest 5 mL

dipanaskan, lalu dikocok selama 5 menit. Buih yang dihasilkan dan

bertahan kurang lebih 15 menit menunjukkan adanya saponin.

d. Steroid/Terpenoid

Ekstrak dilarutkan dalam etanol ditambahkan 2 mL asam asetat

anhidrat didinginkan dengan es ditambahkan tetesan H2SO4. Perubahan

warna dari ungu ke biru atau hijau-biru menunjukkan adanya steroid.

Perubahan warna pink ke ungu menunjukkan adanya terpenoid.

e. Tanin

Sebanyak 4 mL sampel ditambah 4 mL larutan FeCl3. Jika terbentuk

warna hijau, biru sampai hitam, menunjukkan adanya tanin.

III.3.3.3 Pembuatan Larutan Induk

1. Pembuatan larutan induk ekstrak etanol batang kembang bulan

Pembuatan larutan induk ekstrak batang kembang bulan dilakukan

dengan cara menimbang ekstrak sebanyak 50 mg dan dilarutkan dengan

etanol p.a dalam labu tentukur 5 ml (larutan stok konsentrasi 10000 ppm).

2. Pembuatan larutan induk vitamin C

Larutan induk vitamin C yang digunakan dibuat dengan cara

menimbang saksama kurang lebih 10 mg vitamin C dan dilarutkan dengan

etanol p.a dalam labu tentukur 10 ml kemudian dicukupkan dengan etanol

p.a hingga tanda batas.

 24

III.3.3.3 Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

1. Pembuatan Larutan Stok DPPH

Larutan DPPH yang digunakan dibuat dengan cara menimbang

saksama kurang lebih 0,0039 g DPPH kemudian dilarutkan dalam etanol

p.a dalam labu tentukur 50 ml dan dicukupkan dengan etanol p.a hingga

mencapai tanda batas.

2. Penentuan panjang gelombang maksimal

Larutan DPPH dipipet sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke

dalam labu tentukur 5 ml dan dicukupkan hingga batas. Serapan diukur

dengan spektrofotometer UV-Vis yang telah diatur panjang gelombangnya

dari 400-800 nm.

3. Pembuatan larutan blanko

Larutan DPPH dipipet sebanyak 1 ml pada labu tentukur 5 ml

kemudian dicukupkan hingga batas, kemudian dihomogenkan dan

diinkubasi selama 30 menit. Diukur serapannya pada panjang gelombang

515 nm.

4. Pengukuran aktivitas pengikatan DPPH dengan ekstrak etanol

batang kembang bulan

Larutan stok konsentrasi 10000 ppm dipipet masing-masing 40 μl,

80 μl, 140 μl, 160 μl, 200 μl pada larutan stok kedalam labu tentukur 5 ml

sehingga diperoleh konsentrasi 80 ppm, 160 ppm 240 ppm, 320 ppm, 400

ppm kemudian ditambahkan 1 ml larutan DPPH dan dicukupkan dengan

 25

etanol p.a sampai tanda batas dan diukur serapan sampel pada panjang

gelombang 400-800 nm.

5. Pengukuran aktivitas DPPH dengan Vitamin C

Larutan vitamin C sebanyak 5 μl, 10 μl, 15 μl, dan 20 μl, 25 μl dipipet

dari larutan induk vitamin C kedalam labu tentukur 5 ml, kemudian

ditambahkan 1 ml larutan DPPH dan dicukupkan dengan etanol p.a

sampai tanda batas. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang

400-800 nm.

III.3.3.5 Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode ABTS

1. Pembuatan larutan ABTS

Ditimbang sebanyak 18 mg ABTS, dilarutkan dengan 5 ml air suling.

Kemudian ditimbang kalium persulfat sebanyak 3,5 mg, dilarutkan dengan

5 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan dicukupkan volumenya

dengan etanol p.a sampai 25 ml, kemudian diinkubasi selama 12-16 jam.

2. Penentuan panjang gelombang maksimal

Larutan ABTS dipipet sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan kedalam

labu tentukur 5 ml dan dicukupkan dengan etanol p.a hingga batas.

Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis yang telah diatur

panjang gelombangnya dari 400-800 nm.

3. Pembuatan larutan blanko

Larutan ABTS sebanyak 1 ml dipipet kedalam labu tentukur 5 ml dan

dicukupkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan ini kemudian
 26

diinkubasi selama 30 menit dan diukur serapannya pada panjang

gelombang 400-800 nm.

4. Pengukuran aktivitas pengikatan ABTS dengan ekstrak etanol

batang kembang bulan

Larutan stok konsentrasi 10000 ppm dipipet masing-masing

masing-masing 20 μl, 40 μl, 60 μl, 80 μl dan 100 μl dari larutan stok ke

dalam labu tentukur 5 ml hingga diperoleh konsentrasi 40 ppm, 80 ppm,

120 ppm, 160 ppm, 200 ppm. Kemudian ditambahkan masing-masing 1 ml

ABTS dan dicukupkan dengan etanol p.a. Inkubasi selama 30 menit,

diukur serapan sampel pada panjang gelombang 400-800 nm.

5. Pengukuran Aktivitas Pengikatan ABTS dengan Vitamin C

Larutan induk vitamin C dipipet masing-masing 5 μl; 7,5 μl; 10 μl,

12,5 μl dan 15 μl pada labu tentukur 5 ml. Sehingga diperoleh konsentrasi

1 ppm; 1,5 ppm; 2 ppm; 2,5 ppm; 3 ppm. Kemudian ditambahkan 1 ml

ABTS pada masing-masing konsentrasi dan dicukupkan dengan etanol

p.a pada labu tentukur 5 ml hingga tanda batas. Larutan tersebut

kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm.

II.3.3.6. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode FRAP

1. Pembuatan Larutan Reagen FRAP

a. Larutan 3 mM FeCl3 dalam asam sitrat 5 mM (50 mL)

Dilarutkan 24,33 mg serbuk FeCl3 dan dilarutkan dalam 50 mL

larutan asam sitrat 5 mM (48 mg dalam 50 mL H2O).

 27

b. Larutan 1 mM TPTZ dan dilarutkan dalam HCl 0,05 M sebanyak

100 mL. Campuran dihomogenkan dengan cara divortex.

2. Pembuatan Larutan Seri Konsentrasi Kurva Baku Vitamin C

Larutan induk vitamin C 1000 ppm dilakukan pengenceran dengan

mengambil 1 mL larutan dimasukkan dalam labu tentukur 10 mL

dicukupkan dengan etanol p.a hingga tanda batas sehingga dihasilkan

konsentrasi 100 ppm.

3. Pengukuran Aktivitas Pengikatan FRAP dengan Vitamin C

Larutan vitamin C konsentrasi 1, 2, 3, 4 dan 5 ppm ditambahkan

dengan 1,5 mL TPTZ, diinkubasi selama 3 menit selanjutnya ditambahkan

0,5 mL FeCl3 dan dicukupkan volume hingga 5 mL dengan etanol,

kemudian ditentukan panjang gelombang maksimal dengan

spektrofotomteter UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm.

4. Pengukuran Aktivitas Pengikatan FRAP Ekstrak Batang Kembang

Bulan

Larutan seri ekstrak etanol batang kembang bulan dibuat dalam

konsentrasi 0,5 mL di pipet dan ditambahkan 1,5 mL TPTZ, diinkubasi

selama 3 menit selanjutnya ditambahkan 0,5 mL FeCl3 dan di cukupkan

volume dengan etanol p.a. dalam labu tentukur 5 mL dan diinkubasi pada

ruang gelap selama 30 menit lalu diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 400-800 nm dengan spektrofotometer UV-vis.

 28

III.3.4 Variabel Penelitian

Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah variabel bebas,

variabel terikat. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi

konsentrasi ekstrak etanol batang kembang bulan. Variabel terikat dalam

penelitian ini adalah aktivitas antioksidan.

III.3.5 Pengumpulan dan Analisis Data

Metode analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah

metode deskriptif yaitu berupa data kualitatif dan kuantitatif. Data

kuantitatif berupa grafik dan table. Nilai persentase inhibisi yang diperoleh

selanjutnya dimasukkan ke dalam persamaan regresi dengan konsentrasi

ekstrak (µg/ml) sebagai absis (sumbu X) dan nilai % inhibisi antioksidan

sebagai ordintanya (sumbu Y). Nilai IC50 dihitung pada saat nilai % inhibisi

sebesar 50% dengan menggunkan persamaan Y = a + bx.

Abs Blanko−Abs sampel

Aktivitas antioksidan = x 100%
Abs blanko

(Molyneux, 2004).
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A Gray) dikenal

sebagai tumbuhan liar yang sangat agresif membentuk koloni sehingga

menjadi gulma bagi tanaman budidaya tetapi diketahui bahwa Tithonia

diversifolia dapat dimanfaatkan sebagai pengobatan herbal. Telah

dilakukan penelitian tentang uji aktivitas antioksidan batang kembang

bulan dengan beberapa metode uji yaitu DPPH, ABTS, dan FRAP.

Tahap penelitian sebelum dilakukan pengujian antioksidan yaitu

proses pengestrakan senyawa pada simplisia batang Thitonia diversifolia.

Pemilihan metode ekstraksi dalam penelitian ini didasarkan atas

sensitivitas senyawa antioksidan terhadap suhu yang tinggi. Oleh karena

itu dipilih metode maserasi, dimana metode ekstraksi ini dilakukan tanpa

pemanasan serta dilakukan dalam suhu ruangan. Prinsip ekstraksi

dengan metode maserasi adalah terjadinya proses difusi larutan penyari

ke dalam sel tumbuhan yang mengandung senyawa aktif. Difusi tersebut

mengakibatkan tekanan osmosis dalam sel menjadi berbeda dengan

keadaan di luar sel. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang

sama dengan pelarut kemudian terdesak keluar karena adanya

perbedaan tekanan osmosis di dalam sel dan di luar sel (Dean, 2009).

29
Penggunaan etanol 70% sebagai pelarut dalam maserasi karena Pelarut

etanol memiliki polaritas yang tinggi sehingga dapat menghasilkan persen

30
 31

rendemen (yield) lebih banyak dibandingkan menggunakan pelarut lainnya.

Etanol memiliki dua sisi yang terdiri dari gugus OH- yang bersifat polar dan

gugus CH2CH3 yang bersifat non polar sehingga dapat melarutkan

senyawa organik dalam tumbuhan baik yang bersifat polar maupun non

polar, tidak beracun dan tidak mudah ditumbuhi kapang serta kuman (Aziz,

et al., 2014). Proses penyarian diawali dengan pembasahan, proses

pembasahan dengan pelarut ini dimaksudkan untuk memberikan

kesempatan sebesar-besarnya kepada cairan penyari untuk masuk ke

pori-pori simplisia sehingga mempermudah proses penyarian selanjutnya.

Proses maserasi dilakukan 3 hari dengan beberapa kali pengadukan.

Selanjutnya dilakukan remaserasi untuk mencegah terjadinya kejenuhan

pelarut sehingga menghasilkan ekstrak yang lebih optimal. Pengadukan

dapat meningkatkan kontak antara cairan penyari dengan partikel-partikel

sampel sehingga ekstraksi dapat berlangsung dengan efektif dan

menghindari memadatnya serbuk, akibatnya pelarut sulit menembus

bahan sehingga kesulitan mengambil senyawa-senyawa aktif (Rosita, et

al., 2017).

Ekstrak yang diperoleh berupa ekstrak kental, dengan bau yang khas,

warna coklat dan rasa ekstrak sedikit pahit. Ekstrak kental yang

didapatkan dari 100 g simplisia batang Thitonia diversifolia yaitu sebesar

7,775 g , dengan hasil rendamen sebesar 7,775% .

Skrining fitokimia adalah uji kualitatif kandungan senyawa aktif dalam

suatu sampel. Uji fitokimia digunakan untuk mendeteksi senyawa

 32

tumbuhan bedasarkan golongannya sebagai informasi awal dalam

mengetahui golongan senyawa kimia yang mempunyai aktivitas biologi

dari suatu tumbuhan. Skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrak kental

etanol batang Tithonia diversifolia. Hasil skrining fitokimia ekstrak batang

Tithonia diversifolia. dapat dilihat pada tabel 2 :

Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Dengan Visualisasi Warna

Uji Skrining Standar Acuan Hasil

Fitokimia
Alkaloid
- Mayer Endapan kekuningan - (endapan coklat)
- Wagner Endapan merah kecoklatan - (endapan coklat)
-Dragendorf Endapan jingga - (endapan coklat)
Flavonoid
- NaOH Kuning coklat + (kuning coklat)
- Fenolik Hijau-biru atau ungu + (hijau tua)
- Shinoda Merah + (merah)
Tanin Hijau, biru sampai hitam + (hijau tua)
Saponin Berbuih permanen - (berbuih sementara)
Perubahan hijau ke biru - (tidak terjadi
Steroi/terpenoid
perubahan warna)
Keterangan:
+ : terdeteksi
- : tidak terdeteksi

Hasil skrining fitokimia ekstrak etanol batang kembang bulan terdapat

senyawa metabolit sekunder seperti flavonoid, tanin. Hasil skrinig fitokimia

berbeda dengan penelitian Olayinka et al. (2015) yaitu terdapat semua

senyawa metabolit sekunder pada batang Tithonia diversifolia. Hal ini

disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya faktor lingkungan seperti

tinggi tempat, jenis tanah, iklim dan pembentukan metobolit sekunder di

dalam tanaman yang dipengaruhi oleh suhu, pH, aktivitas air dan intensitas

cahaya (Fransworth, 1966). Senyawa metabolit sekunder yang

 33

diperkirakan sebagai antioksidan dari ekstrak etanol batang Tithonia

diversifolia yaitu flavonoid. Selain itu, senyawa metabolit sekunder seperti

tanin juga memiliki kolerasi dengan aktivitas antioksidan (Pujimulyani,

2010).

Prinsip dari metode DPPH adalah interaksi antioksidan dengan

radikal bebas DPPH dengan mendonorkan atom hidrogen dari sebagian

gugus hidroksilnya ke senyawa radikal bebas DPPH sehingga membentuk

senyawa radikal bebas yang lebih stabil. Semua elektron pada radikal

bebas DPPH menjadi berpasangan sehingga terjadi perubahan warna

larutan ungu tua menjadi kuning. Absorbansi yang terbaca adalah molekul

DPPH sisa yang tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan.

Penangkapan radikal tersebut mengakibatkan ikatan rangkap diazo pada

DPPH berkurang (Zuhra, et al., 2008). Intensitas warna ini diukur pada

panjang gelombang maksimum 517 nm.

Alasan menggunakan panjang gelombang maksimum menurut Gandjar

dan Rohman (2007), panjang gelombang tersebut memiliki kepekaan atau

sensitifitas yang maksimal yaitu perubahan absorbansi setiap satuan

konsentrasi adalah yang paling besar.

Metode ABTS merupakan metode penentuan aktivitas antioksidan

yang diperoleh dari hasil oksidasi kalium persulfat dengan garam

diammmonium ABTS (Molyneux, 2004). Prinsip uji ABTS adalah

penghilangan warna kation ABTS untuk mengukur kapasitas antioksidan

yang langsung bereaksi dengan radikal kation ABTS. ABTS mempunyai

 34

karakteristik warna biru-hijau, yang bila tereduksi oleh antioksidan akan

berubah membentuk nonradikal tidak berwarrna. Intensitas warna ini

diukur pada panjang gelombang visibel 750 nm.

Pengukuran absorbansi dilakukan setelah larutan sampel diinkubasi

selama 30 menit, waktu inkubasi digunakan untuk menandakan radikal

dan larutan sampel telah bereaksi sempurna, yaitu dengan penurunan

absorbansi yang stabil.

Parameter yang digunakan untuk menginterpretasikan hasil

pengujian aktivitas antioksidan pada batang Tithonia diversifolia dengan

menggunakan radikal DPPH dan ABTS adalah nilai Inhibition

Concentration 50% (IC50), nilai tersebut menggambarkan besarnya

konsentrasi senyawa uji yang dapat menangkap radikal sebesar 50%.

Berdasarkan parameter tersebut diperoleh data hasil perhitungan

nilai IC50 ekstrak batang Tithonia diversifolia dan vitamin C pada

gambar 5.

240.56
Nilai IC50 (ppm)

Ekstrak Etanol Batang Kembang Bulan Vitamin C

129.696

3.738 2.437

DPPH ABTS

Gambar 5. Nilai IC50 Ekstrak Etanol Batang Tithonia diversifolia dan

Vitamin C
 35

Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menunjukkan

bahwa ekstrak etanol batang kembang bulan (Tithonia diversifolia)

mempunyai nilai IC50 sebesar 240,56 ppm (101-250 ppm) termasuk

kategori antioksidan sedang dan nilai IC50 vitamin C sebagai pembanding

adalah 3,738 ppm (<50 ppm) sangat kuat. Pada metode ABTS nilai IC50

sebesar 129,696 ppm, termasuk kategori aktivitas antioksidan yang

sedang (101-250 ppm) dan nilai IC50 vitamin C sebagai pembandingnya

adalah 2,437 ppm aktivitas antioksidan dinyatakan sangat kuat.

Pengukuran aktivitas antioksidan menghasilkan nilai IC50 yang

berbeda-beda dari metode DPPH dan ABTS. Hal ini disebabkan dari

mekanisme dan sensitifitas dari masing-masing metode dalam menangkal

radikal bebas. Hasil IC50 ABTS lebih kecil atau kuat daripada DPPH,

karena metode ABTS memiliki beberapa kelebihan yaitu waktu reaksi

yang lebih cepat, memiliki fleksibilitas karena dapat digunakan pada range

pH yang luas, ABTS larut dalam air dan pelarut organik sehingga dapat

menilai aktivitas antioksidan sampel di berbagai media, dapat menentukan

kapasitas antioksidan dari senyawa/sampel hidrofilik dan lipofilik (Shalaby,

2013).

Metode FRAP atau Ferric Reducing Antioxidant Power adalah salah

satu metode penentuan kandungan antioksidan secara spektrofotometri

yang berdasarkan pada reduksi analog ferroin kompleks Fe3+ dari

tripiridiltriazin Fe(TPTZ)3+ menjadi kompleks Fe2+, Fe(TPTZ)2+ yang

berwarna biru intensif oleh antioksidan pada suasana asam. Daya reduksi
 36

merupakan salah satu indikator potensi suatu senyawa mempunyai

aktivitas antioksidan, karena dapat menstabilkan radikal dengan

mendonorkan elektron sehingga senyawa radikal menjadi stabil (Kim,

2005). Hasil pengujian diinterpretasikan dengan peningkatan absorbansi

pada panjang gelombang 595 nm dan dapat disimpulkan sebagai jumlah

Fe2+ (dalam mikromolekular) ekuivalen dengan antioksidan standar.

Penentuan aktivitas antioksidan metode FRAP berdasarkan regresi

linier dari kurva baku equivalen vitamin C antara sampel banding kadar

equivalen Fe dalam µmol. Persamaan kurva baku yang digunakan

y = 0,0734x + 0,2026 dengan nilai r = 0,9888. Selanjutnya dari data

absorbansi yang diperoleh , aktivitas antioksidan dapat dilihat dengan

menggunakan persamaan Ascorbic Acid Equivalen capacity (AEAC). Hasil

pengukuran yang didapatkan dari kapasitas antioksidan yaitu replikasi I

49,2 µmol AEAC/gr sampel, replikasi II 49,3 µmol AEAC/gr sampel, dan

replikasi III 49,5 µmol AEAC/gr sampel, dengan nilai rata-rata aktivitas

antioksidan sebesar 49,3 µmol AEAC/gr.

Vitamin C digunakan sebagai pembanding karena berfungsi sebagai

antioksidan sekunder. Hal itu dikarenakan vitamin C mempunyai gugus

hidroksi bebas yang bertindak sebagai penangkap radikal bebas (Kim,

2005). Vitamin C juga merupakan senyawa murni sehingga pada

konsentrasi yang lebih rendah sudah dapat memberikan aktivitas

penghambatan yang lebih besar.

 BAB V

PENUTUP

V.1 Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat

disimpulkan bahwa nilai IC50 dari ekstrak etanol batang kembang bulan

dengan metode DPPH yaitu sebesar 240,56 ppm, metode ABTS yaitu

sebesar 129,696 ppm yang htergolong antioksidan sedang dan metode

FRAP memiliki nilai AEAC sebesar 48,2 µmol AEAC/gr sampel.

V.2 Saran

Pada penelitian selanjutnya dapat dilakukan pengujian lebih lanjut

mengenai aktivitas antioksidan berdasarkan fraksi-fraksi pelarut.

36
37
 38

DAFTAR PUSTAKA

Antolovich, M., Prenzler, P. D., Patsalides, E., McDonald. S. dan Robards,

K. 2002. Methods For Testing Antioxidant Activity: 127 : 193.

Apak,R., Guclu , K., Demirata, B., Ozyurek, M., Celik, S E. 2007.

Comparative Evaluation of Various Total Antioxidant Capacity
Assay Applied to Phenolic Compound With CUPRAC Assay.
Molecules 12:1496-1547.

Ajao,A.A. dan Moteetee, A.N.2017. “Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray.

(Asteraceae: Heliantheae), an invasive plant of significant
ethnopharmacological importance: A review”.South African Journal
of Botany 113: 396–403.
Aziz, T., Febrizky, S., Mario, A.D., 2014, Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap
Persen Yield Alkaloid dari Daun Salam India (Murraya koenigii).
Jurnal Teknik Kimia, 20.

Boer, Y. 2000. “Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Kandis

(Garcinia parvifolia Miq)”. Jurnal Matematika dan IPA 1 (1) : 26- 33.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979. Farmakope Indonesia.

Edisi 3. Jakarta: Depkes RI.

Dean, J, 2009. Extraction Techniques In Analytical Science. London: John

Wiley And Sons LTD 43-46.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar

Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Depkes RI.

Essiett, U.A., and Akpan, E.M. 2013. “Proximate Composition and

Phytochemical Constituents of Aspilia africana (Pers) C. D. Adams
and Tithonia diversifolia (Hemsl) A. Gray Stems (Asteraceae)”. Bull
Env Pharmacol Life Sci. 2.(4) : 33-37.

Fransworth, N.R. 1966. “Biological and Phytochemical Screening of Plants”.

Journal of Pharmaceutical Science. 22 (3): 226-276.

Firdianny, I., Rahmiyani, I., Irasutisna, K. 2013. “Antioxidant Capacities

From Various Leaves Extracts of Four Varieties Mangoes Using
DPPH, ABTS Assays and Correlation With Total Phenolic,Flavonoid,
Carotenoid”. Int.J Pharmacy and Pharmaceutical Sci.
5,pp.189-194.
 39

Gandjar, I. , dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.
Ganestra, M. 2007. “Oxyl Radicals, Redox – Sensitive Signaling Cascades
and Antioxidant”.Cell Signal (19) : 1807 – 1819.

Hamid, A.A., Aiyelaagbe, O,O., Usman, L.A, Ameen O.M., Lawal, A. 2010.
“Antioxidant: It’s Medical and Pharmacological Applications”.
Africcan Journal of Pure and Applied Chemistry Vol 4(8): 142-151.

Hanani, E., Mun’im., dan Sekarani, R. 2005. “Identifikasi Senyawa

Antioksidan Dalam Spons Callyspongia SP dari Kepulauan Seribu”.
Majalah Ilmu Kefarmasian. 2(3) : 127.

Hanifa, R.A, Lukmayani, Y, Syafni, L. 2015. “Uji Aktivitas Antioksidan serta

Penetapan Kadar Flavonoid Total dari Ekstrak dan Fraksi Daun
Paitan (Tithonia Diversifolia (Hemsley) A Gray)”. Prosiding Penelitian
SPeSIa Unsiba. Farmasi Gelombang 2.

Hutapea, J.R. 1994. Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jakarta: badan

Penelitian dan pengembangan Kesehatan: 297.

Hedge, K dan Joshi, A. 2010.” Library Der Pharmaceia”.Research Scholar.

Heinrich, M., Joanne, B., Simon, G dan Wiliamso, E.M. 2005.

Farmakognosi dan Fitoterapi. Diterjemahkan oleh Syarief, W.R.,
Aisyah, C., Elviana, E., dan Fidiasari, E.R. Jakarta:EGC :118.

Jacinto, S.D., Ramos, E,F., Siguan, A.P.T., Can oy, R.J.C. 2011.
“Determining the Antioxidant Property of Plant Extracts: A
Laboratory Exercise”. Asian Journal Of Biology Education. (5): 22–
25.

Jayanthi. P. dan Lalitha, P. 2011. Reducing Power of The Solvent Extracts

of Eichhornia crassipes (Mart.) Solms. International Journal
Pharmacy and Pharmaceutical Sci. 3.(3)126-128.

Kim,O.S. 2005. “Radical Scavenging Capacity and Antioxidant Activity of

The Vitamin Fraction In rice bran”. J Food Sci. (3): 208- 213.
Khopkar, S.M. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh
Saptorahardjo, A. Jakarta: UI Press.

Kokate C,K, Purohit A.P dan Ghokhale S,B. 1997. Pharmacognosy. Nirali
Prakashan, Pune. India
 40

Magfira. 2018. “Analisis Penghambatan Ekstrak Etanol Batang Kembang

Bulan Thitonia diversifolia) Dengan DPPH, ABTS, dann FRAP”.
Skripsi. Makassar: Universitas Hassanudin.

Marjoni,R. M. 2016. Dasar-Dasar- Fitokimia. Jakarta: Trans Info Media.

Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., dan Hintze R. 2007.
“Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic
Extracts of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis
of Spectrophotometric Measurements”. Sensors. (7): 2080-2095.

Mastuti, R. 2015. “Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak

Etanol Bunga Celosia”. BioWallacea Jurnal Ilmiah Ilmu Biologi.
2(3):143-148.

Mukhriani. 2014. “Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, Dan Identifikasi

Senyawa Aktif”. Jurnal Kesehatan. 7(2): 361-367.

Mwaura, L, Kandungu, J, Anjarwalla, P, Ofori, D.A, Jamnadass, R.,

Stervenson, P.C, Smith, P. 2013.”Thitonia diversifolia(Hemsley) A.
Gray”. Pesticidal Plant Leaflet.

Mwanauta, R.W., Mtei, K.A., and Ndakidemi, P.A. 2014. “Prospectiv

Bioactive Compounds from Vernonia amygdalina, Lippia javanica,
Dysphania ambrosioides and Tithonia diversifolia in Controlling
Legume Insect Pests”. Agricultural Sciences. 5. pp.1129-1139.

Molyneux, P. 2004. “The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl

Hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity”. Songklanakarin
J. Sci. Technol. 26(2): 212-219.

Nurjanah., Izzati, L., Abdullah, A. 2011. “Aktivitas Antioksidan dan

Komponen Bioaktif Kerang Pisau (Solen sp)”. Jurnal Ilmu Kelautan.
16(3): 119-124.

Olayinka, Bolaji ,U, Raiyemo, Damilola, A, Etejere, Emmanuel O. 2015.

“Phytochemival And Proximate Compotion Of Tithonia
diversifolia (Hemsley.) A. Gray”. Annals. Food Science and
Tecvhnology . Vol 16(1):195-200.
Oliveiraa., S, Glalci, A.S., Camila, R.E., Thuany, A.S., Edmar S., Orian F.,
Marcelo, J., Pena, F., Paulete, R. 2014. Evaluation ofAntiradical
Assays Used in Determining The Antioxidant Capacity of Pure
Compounds and Plant Extracts. Artigo. 37(3). pp.497-503.
 41

Pujimulyani, D., Raharjo, S., Marsono, Y., dan Santoso, U. 200 . “Aktivitas
Antiosidan Dan Kadar Senyawa Fenolik Pada Kunir Putih (Curcuma
Mangga Val) Segar Dan Setelah Blanching”. Agritech. 30(2): 68-74.

Rahmawati, A., Muflihunna., dan Sarif, L.M. 2016. “Analisis Aktivitas

Antioksidan Produk Sirup Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L)
Dengan Metode DPPH”. Jurnal Fitofarmaka. 2(2): 97-101.

Rusli, R. 2009. “Penetapan Kadar Boraks Pada Mie Basah Yang Beredar
Di Pasar Ciputat Dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis
Menggunakan Pereaksi Kurkumin”. Skripsi, Jakarta: Universitas
Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah.

Roberta, R., Nicoletta, P., Anna, P., Ananth, P., Min, Y.C., Rice, E. 1999.
“Antioxidant activity applying an improved ABTS Radical cation
decolorization assay”. Free radical Biology and Medicine.26: 1232.

Rosita, J.M., Taufiqurahman, I., dan Edyson. 2017. “Perbedaan Total

Flavonoid Antara Metode Maserasi Dengan Soxhletasi Pada Ekstrak
Daun Binjai (Mangifera caesia)”. Dentin (Jur. Ked. Gigi). 1(1):
100-105.

Sadikin, M. 2001. Pelacakan Dampak Radikal Bebas terhadap

Makromolekul. Kumpulan Makalah Penelitian: Radikal Bebas dan
Antioksidan dalam kesehatan. Jakarta:Fakultas Kedokteran UI.

Sasmita, F.M ., Susetyarini, E, Husamah, dan Pantiwati, Y. 2017. “Efek

Ekstrak Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) terhadap Kadar
Glukosa Darah Tikus Wistar (Rattus norvegicus) yang Diinduksi
Alloxan”. Biosfera Vol 34 (1): 22-31.

Sastrohamidjojo, H., 2002, Dasar-dasar Spektroskopi, Yogyakarta:

Gadjah Mada University Press.

Sayuti, K dan Yenrina, R. 2015. Antioksidan Alam dan Sintetik. Padang:

Andalas University.

Shalaby, E.A., dan Shanab, S.M. 2013. Antioxidant Compounds, Assay

of Determination and Mode of Action. AJPP. 7(10): 535-537.

Sulistyowati, E dan Amanatie,. 2015. “Structure Elusidation of the Leaf of

Tithonia diversifolia(Hemsl) Gray”. Jurnal Sains dan Matematika Vol.
23 (4): 101-112.

Sulistijowati, A dan Gunawan, D. 2001. Efek Ekstrak Daun Kembang Bulan

(Tithonia diversifolia A. Gray) terhadap Candida albicans serta Profil
 42

Kromatografinya..Yogyakarta : Fakultas Farmasi Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta.

Trease, G.E. dan Evan, W.C. 2002. Pharmacognosy Edition 15th. Saunder
Publishers. London

Trilaksani, W., 2003, Antioksidan, Jenis, Sumber, Mekanisme Kerja dan

Peran Terhadap Kesehatan, Institut Pertanian Bogor: Bogor.
Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius,
Yogyakarta

Vijayalakshmi, M., and Ruckmani, K. 2016. Ferric Reducing Antioxidant

Power assay in Plant Extract. ISI Impact Factor. (11):570-572.

Verawati, Aria, M., Novicaesaa, M. 2011. Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak

Etanol daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia A. Gray)
Terhadap Mencit Putih Betina. Scientia Vol 1 (1).

Yu, L. 2008. Wheat Antioxidants. United States Of America, Wiley.

Zuhra, C.F., Tarigan, J., dan Sihotang, H. 2008. “Aktivitas antioksidan

senyawa Flavonoid dari daun Katuk (Sauropus androgynus (L)
Merr.)”. Jurnal Biologi Sumatera. 3(1): 7-10.
 43

Lampiran 1. Skema Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Batang

Kembang Bulan

Sampel batang kembang bulan

(Tithonia diversifolia (Hemsley) A Gray

- Pengumpulan sampel
- Sortasi basah
- Pencucian
- Perajangan
- Pengeringan dengan oven
- Sortasi kering
- Penyerbukan
- Dimaserasi dengan etanol 70% selama 3 × 24 jam

Filtrat Residu

- Diremaserasi

Filtrat Residu

- Disaring
- Diuapkan

Uji Fitokimia
-Uji Flavonoid
-Uji Alkaloid Ekstrak kental
-Uji Tanin
-Uji Steroid/ terpenoid
 44

Lampiran 2. Skema Uji Aktivitas Antioksidan Vitamin C Dengan

Beberapa Metode Uji

Vitamin C dibuat larutan stok

1000 ppm

Pembuatan seri konsentrasi

DPPH ABTS FRAP

Pembacaan absorbansi dengan spektrofotometri

UV-Vis pada panjang gelombang (400-800 nm)

Absorbansi

Analisis Data
 45

Lampiran 3. Skema Kerja Uji Aktivitas Antioksidan Ektsrak Etanol

Batang Kembang Bulan Dengan Metode Uji DPPH

Estrak Etanol Batang Kembang Bulan

- Dibuat larutan Induk

10000 ppm

- Dipipet masing-masing konsentrasi

40 ɥL 80 µl 120 ɥL 160 ɥL 200 ɥL

- Dimasukkan kedalam labu tentukur

5 ml
80 ppm 160 ppm 240 ppm 320 ppm 400 ppm
- Ditambahkan 1 ml larutan DPPH dan dicukupkan
dengan etanol p.a sampai tanda batas

Absorbansi
 46

- Diinkubasi selama 30 menit

- Diukur dengan spektrofotometri UV- Vis
pada panjang gelombang 400-800 nm.

Lampiran 4. Skema Kerja Uji Aktivitas Antioksidan Ektsrak Etanol

Batang Kembang Bulan Dengan Metode Uji ABTS

Estrak Etanol Batang Kembang Bulan

- -Dipipet
Dibuat larutan Induk konsentrasi
masing-masing
10000 ppm

- Dipipet masing-masing konsentrasi

20 ɥL 40 ɥL 60 ɥL 80 ɥL 100 ɥL

- Dimasukkan kedalam labu tentukur 5 ml

- Ditambahkan 1 ml larutan ABTS dan
dicukupkan dengan etanol p.a sampai
tanda batas
47
 48

Lampiran 5. Skema Kerja Uji Aktivitas Antioksidan Ektsrak Etanol

Batang Kembang Bulan Dengan Metode Uji FRAP

Estrak Etanol Batang Kembang Bulan

- Dibuat larutan induk

- Dibuat larutan Induk
1000 ppm

- Dipipet 0,5 mL
- Dimasukkan kedalam labu tentukur 5 ml
- Ditambahkan 1,5 mL TPTZ
- Diinkubasi selama 3 menit
- Ditambahkan 0,5 mL FeCl3
- Dicuk etanol p.a hingga tanda batas
- Diinkubasi selama 30 menit
- Diukur dengan spektrofotometri UV- Vis
Absorbansi
pada panjang gelombang 400-800 nm.

Analisis Data

Kesimpulan
 49

Lampiran 6. Rendemen Ekstrak Etanol Batang Kembang Bulan

Dengan Maserasi

Persen rendemen metode ekstraksi maserasi

Bobot ekstrak = Bobot total – Bobot cawan porselen
= 42,5264 – 34,7505 g
= 7,775 g
Bobot simplisia = 100 g
Rendemen = Bobot ekstrak - Bobot simplisia
 100 %
Bobot simplisia

7,775 g
=  100 %
100 g

= 7,775 %
 50

Lampiran 7. Perhitungan Aktivitas Antioksidan Vitamin C dan

Ekstrak Etanol Batang Kembang Bulan Dengan Metode
DPPH

a. Persen inhibisi vitamin C

k
k
b
0,8483  0,7643
konsentrasi 1 ppm = x 100 % = 9,9021 %
0,8483
0,8483  0,6567
konsentrasi 2 ppm = x 100 % = 22,586 %
0,8483
0,8483  0,5210
konsentrasi 3 ppm = x 100% = 38,583%
0,8483
0,8483  0,4257
konsentrasi 4 ppm = x 100% = 49,817 %
0,8483
 51

0,8483  0,2317
konsentrasi 5 ppm = x 100% = 72,686 %
0,8483

Gambar 5. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan

dengan pebanding Vitamin C

80
70 y = 15.281x - 7.1258
60 R² = 0.9861
% Inhibisi

50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6
Konsentrasi (ppm)

Perhitungan persamaan kurva baku:

Keterangan :
y : koefisien IC50 pada persamaan linear yang bernilai 50
a : perpotongan pada sumbu y ; x = 0 (interstep)
b : koefien regresi atau kemiringan (slope)
x : nilai IC50 r : Koefisien relasi
Perhitungan IC50:
y = 15,281x – 7,1258
50 = 15,281x – 7,1258
50  7,1258
x =
15,281
x = 3,738 bpj (Aktivitas sangat kuat)

Table 3. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan vitamin C dengan

metode DPPH
Konsentrasi
Absorbansi Rata-rata % Inhibisi Nilai IC50 (ppm)
(ppm)
0,851
Blanko 0,8483 - -
0,845
 52

0,849
0,738
1 0,775 0,7643 9,9021
0,780
0,691
2 0,640 0,6567 22,586
0,639
0,551
3 0,530 0,521 38,583 3,738
0,482
0,421
4 0,442 0,4257 49,817
0,414
0,230
5 0,224 0,2317 72,686
0,241

b. Persentase inhibisi ekstak etanol batang kembang bulan

0,8616  0,6526
Konsentrasi 80 ppm = x 100 % = 24,257 %
0,8616

0,8616  0,5600
Konsentrasi 160 ppm = x 100 % = 35,004 %
0,8616

0,8616  0,4086
Konsentrasi 240 ppm = x 100 % = 52,576 %
0,8616
 53

0,8616  0,3043
Konsentrasi 320 ppm = x 100 % = 64,681 %
0,8616

0,8616  0,2320
Konsentrasi 400 ppm = x 100 % = 73,073 %
0,8616

Gambar 6. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan

ektrak etanol batang kembang bulan dengan metode
DPPH

80
70
60
50
%inhibisi

y = 0.1591x + 11.726
40 R² = 0.987
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Konsentrasi (ppm)

Perhitungan persamaan kurva baku:

Keterangan :
y : koefisien IC50 pada persamaan linear yang bernilai 50
a : perpotongan pada sumbu y ; x = 0 (interstep)
b : koefien regresi atau kemiringan (slope)
x : nilai IC50 r : Koefisien relasi
Perhitungan IC50 :
y = 0,1591x + 11,726
50 = 0,1591x + 11,726
50  11,726
x =
0,1591
x = 240,56 ppm (Aktivitas sedang)
 54

Tabel 4. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol

batang kembang bulan metode DPPH

Konsentrasi
Absorbansi Rata-rata % Inhibisi Nilai IC50 (ppm)
(ppm)
0,824
Blanko 0,880 0,8616 - -
0,881
0,604
80 0,681 0,6526 24,257
0,673
0,559
160 0,558 0,5600 35,004
0,563
0,406
240 0,395 0,4086 53,576 240,56
0,425
0,313
320 0,292 0,3043 64,681
0,308
0,210
400 0,241 0,2320 73,073
0,245

Lampiran 8. Perhitungan uji aktivitas antioksidan dengan metode

ABTS

a. Persentase inhibisi vitamin C

0,9156  0,7253
konsentrasi 1 ppm = x 100% = 20,784 %
0,9156
 55

0,9156  0,6556
konsentrasi 1,5 ppm = x 100 % = 28,396 %
0,9156

0,9156  0,5570
konsentrasi 2 ppm = x 100 % = 39,165 %
0,9156

0,9156  0,4630
konsentrasi 2,5 ppm = x 100 % = 49,432 %
0,9156

0,9156  0,3240
konsentrasi 3 ppm = x 100 % = 64,613 %
0,9156

Gambar 7. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan

vitamin C dengan metode ABTS

70
y = 21.74x - 2.9996
60
R² = 0.986
50
%I nhibisi

40

30

20

10

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

konsentrasi (ppm)

Perhitungan persamaan kurva baku:

Keterangan :
y : koefisien IC50 pada persamaan linear yang bernilai 50
a : perpotongan pada sumbu y ; x = 0 (interstep)
b : koefien regresi atau kemiringan (slope)
x : nilai IC50 r : Koefisien relasi
Perhitungan IC50 :
 56

y = 21,74x - 2,9996
50 = 21,74x - 2,9996
50  2,9996
x =
21,74
= 2,437 ppm (Aktivitas sangat kuat)

Tabel 5. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan vitamin C dengan

metode ABTS

Konsentrasi Nilai IC50

Absorbansi Rata-rata % Inhibsi
(ppm) (ppm)
0,901
Blanko 0,934 0,9156 - -
0,912
0,713
1 0,731 0,7253 20,784
0,732
0,654
1,5 0,658 0,6556 28,396
0,655
0,573
2 0,573 0,5570 39,165 2,437
0,525
0,469
2,5 0,457 0,4630 49,432
0,463
0,331
3 0,318 0,3240 64,613
0,323

b. Persentase inhibisi radikal bebas batang kembang bulan

 57

0,7783  0,5746
konsentrasi 40 ppm = x 100% = 26,172 %
0,7783

0,7783  0,4666
konsentrasi 80 ppm = x 100 % = 40,048 %
0,7783

0,7783  0,3736
konsentrasi 120 ppm = x 100 % = 51,997 %
0,7783

0,7783  0,3386
konsentrasi 160 ppm = x 100 % = 56,494 %
0,7783

0,7783  02793
konsentrasi 200 ppm = x 100 % = 64,114%
0,7783

Gambar 8. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan

ekstrak etanol batang kembang bulan metode ABTS

70
60
50
%Inhibisi

40
y = 0.2308x + 20.066
30 R² = 0.9609
20
10
0
0 50 100 150 200 250
Konsentrasi (ppm
 58

Perhitungan persamaan kurva baku:

Keterangan :
y : koefisien IC50 pada persamaan linear yang bernilai 50
a : perpotongan pada sumbu y ; x = 0 (interstep)
b : koefien regresi atau kemiringan (slope)
x : nilai IC50 r : Koefisien relasi
Perhitungan IC50 :
y = 0,2308x + 20,066
50 = 0,2308x +20,066
50  20,066
x =
0,2308
= 129,696 ppm (Aktivitas sedang)

Tabel 6. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol

batang kembang bulan dengan metode ABTS

Konsentrasi
Absorbansi Rata-rata % Inhibisi Nilai IC50 (ppm)
(ppm)
0,755
Blanko 0,795 0,7783 - -
0,785
0,575
40 0,574 0,5746 26,172
0,575
0,426
80 0,504 0,4666 40,048
0,47
0,384
120 0,364 0,3736 51,997 129,696
0,373
0,336
160 0,341 0,3386 56,494
0,339
0,265
200 0,294 0,2793 64,114
0,279
 59

Lampiran 9. Hasil Perhitungan Uji Aktivitas Antioksidan Dengan

Metode FRAP

Perhitungan daya reduksi besi (nilai FRAP) dilakukan denga

menggunakan kurva baku vitamin C dan nilai FRAP dengan konsentrasi
sampel (µg/mL).

1. Kurva Baku Vitamin C

Kurva baku vitamin C dibuat 5 seri konsentrasi yaitu 1, 2, 3, 4 dan 5
µg/mL yang setara dengan 5,68; 11.35; 17,03; 22,71 dan 28,39 µmol

2. Perhitungan Seri Konsentrasi

Ditimbang seksama 10 mg serbuk vitamin C dan dilarutkan dalam 10
mL etnanol p.a, sehingga diperoleh larutan stok dengan kadar 1000
µg/mL atau setara dengan:

𝑚𝑔 𝑉𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛 𝐶 1000
M= x
𝑀𝑟 𝑉𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛 𝐶 𝑝 (𝑚𝐿)
10 𝑚𝑔 1000
M= x
176,124 𝑔/𝑚𝑜𝑙 𝑝 (𝑚𝐿)

M= 5,68 𝑚𝑜𝑙 ~5680 µmol

Selanjutnya, dilakukan pengenceran vitamin C hingga diperoleh
konsentrasi 100 µg/mL ~ 568 µmol
5000
Faktor pengenceran   10 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
500 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

Perhitungan Pengenceran:
1. Konsentrasi µmol sebanyak 5 mL (5000 µL)
C1 x V1 = C2 x V2
568 µmol x V1 = 5,68 µmol x 5000 µL
V1 = 50 µL ad etanol p.a 5 mL (1 µg/mL)
2. Konsentrasi µmol sebanyak 5 mL (5000 µL)
C1 x V1 = C2 x V2
568 µmol x V1 = 11,35 µmol x 5000 µL
V1 = 100 µL ad etanol p.a 5 mL (2 µg/mL)
3. Konsentrasi µmol sebanyak 5 mL (5000 µL)
C1 x V1 = C2 x V2
568 µmol x V1 = 17,03 µmol x 5000 µL
V1 = 150 µL ad etanol p.a 5 mL (3 µg/mL)
 60

4. Konsentrasi µmol sebanyak 5 mL (5000 µL)

C1 x V1 = C2 x V2
568 µmol x V1 = 22,71µmol x 5000 µL
V1 = 200 µL ad etanol p.a 5 mL (4 µg/mL)
5. Konsentrasi µmol sebanyak 5 mL (5000 µL)
C1 x V1 = C2 x V2
568 µmol x V1 = 28,39 µmol x 5000 µL
V1 = 250 µL ad etanol p.a 5 mL (5 µg/mL)

a. Pengukuran Absorbansi
Tabel. Data absorbansi kurva baku vitamin C
Konsentrasi Konsentrasi Kadar Sampel
Absorbansi Rata-rata
(µg/mL) (µMol) (µmol)
1 5,68 0,291 45,9 48,2
2 11,35 0,332 49,3
3 17,03 0,415 49,5
4 22,71 0,504
5 28,39 0,572

Absorbansi dari seri konsentrasi standar vitamin C

Persamaan Kurva Baku Vitamin C

0.7
0.6 y = 0.0734x + 0.2026
R² = 0.988
Absorbansi

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6
Konsentrasi (µmol)

Perhitungan daya reduksi besi (FRAP), sampel berdasarkan

persamaan kurva baku vitamin C y = 0,0734x + 0,2026 yakni:
1. Absorbansi sampel 0,564
y = 0,0734x + 0,2026
0,540 = 0,0734x + 0,2026
0,540  0,2026
X =
0,0734
= 4,59 µmol
Maka konsentrasi sampel ekuivalen Fe2+ = konsentrasi x FP
 61

= 4,59 x 10
= 45,9 µmol

2. Absorbansi sampel 0,565

y = 0,0734x + 0,2026
0,565 = 0,0734x + 0,2026
0,565  0,2026
X =
0,0734
= 4,93 µmol
Maka konsentrasi sampel ekuivalen Fe2+ = konsentrasi x FP
= 4,93 x 10
= 49,3 µmol
3. Absorbansi sampel 0,566
y = 0,0734x + 0,2026
0,566 = 0,0734x + 0,2026
0,566  0,2026
X =
0,0734
= 4,95 µmol
Maka konsentrasi sampel ekuivalen Fe2+ = konsentrasi x FP
= 4,95 x 10
= 49,5 µmol
 62

Lampiran 10. Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Kembang Bulan

Pencucian sampel Pengeringan sampel Penyerbukan simplisia

dengan air mengalir dengan herbs dryer

Pemekatan ekstrak Penyaringan maserat Proses maserasi selama

etanol kembang bulan dengan vacuum 3 hari
 63

Lampiran 11. Skrining Fitokimia

Wagner Dragendorf Mayer

Mayer
 64

Uji Alkaloid

Uji Tanin Uji Steroid/Terpenoid Uji Saponin

Uji Flavonoid

Lampiran 12. Pengujian Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH

Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan seri

DPPH ekstrak sampel dan vitamin C konsentrasi
65
 66

Lampiran 13. Pengujian Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

ABTS

Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan seri

ABTS sampel dan vitamin C konsentrasi

Perubahan warna radikal DPPH ungu ke kuning setelah dinkubasi

selama 30 menit pada sampel dan vitamin C

Pembacaan absorbansi
dengan spektrofotometri UV-
 67

Lampiran 14. Pengujian Antioksidan Ekstrak Etanol Batang Kembang

Bulan Dengan Metode FRAP

Pembuatan larutan TPTZ Pembuatan larutan FeCl3

Peningkatan warna seiring dengan peningkatan konsentrasi vitamin C , dan

pengukuran sampel replikasi sebanyak 3 kali
 68

``