Penerapan rasio diagnostik PAH telah digunakan oleh para peneliti lingkungan untuk

mengidentifikasi sumber-sumber PAH. Rasio diagnostik PAH telah ditinjau, dikritik, dikomentari
tentang penggunaannya dan banyak peneliti telah menetapkan batasan mereka. Menjelaskan alasan
mengapa rasio molekuler PAH yang dihitung dari konsentrasi lumpur limbah sebaiknya tidak
digunakan untuk memahami sumber PAH. Tobiszewski menyatakan bagaimana rasio diagnostik PAH
biasa digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi dan menilai sumber emisi polusi. Beberapa rasio
diagnostik didasarkan pada PAH induk, yang lain pada proporsi alkil-tersubstitusi untuk molekul yang
tidak tersubstitusi. Rasio ini berlaku untuk PAH yang ditentukan dalam media lingkungan yang
berbeda: udara (fase gas + partikel), air, sedimen, tanah, serta organisme biomonitor seperti daun
atau jarum konifer, dan kerang.

Eksposur dari berbagai pekerjaan dan campuran polutan tingkat tinggi yang mengandung PAH
diketahui menyebabkan gejala seperti iritasi mata, mual, muntah, dan diaore. Campuran PAH juga
diketahui menyebabkan iritasi dan peradangan kulit. Anthracene, benzo (a) pyrene, dan naphthalene
adalah iritan kulit langsung, sedangkan anthracene dan benzo (a) pyrene dilaporkan sebagai
penyensitif kulit, mis. Sebagai penyebab respons kulit alergi pada hewan dan manusia. Serangkaian
masalah kesehatan (peningkatan risiko kanker kulit, paru-paru, kandung kemih, dan gastrointestinal)
untuk pekerja yang terpapar pada campuran PAH dan paparan tempat kerja lainnya dari bahan kimia
PAH telah dilaporkan, PAH misalnya BaP dan Pyrene telah diidentifikasi sebagai penyebabnya.
kanker pada hewan laboratorium. Kontak kulit yang berulang dengan PAH naphthalene dapat
menyebabkan kemerahan dan peradangan pada kulit. Kerusakan DNA yang disebabkan oleh
paparan PAH telah ditunjukkan oleh banyak penulis. Paparan jangka panjang terhadap PAH diduga
meningkatkan risiko kerusakan sel melalui mutasi gen dan mortalitas kardiopulmoner. Jadi karena
bahaya yang dapat ditimbulkan, perlu memiliki pengetahuan untuk menganalisis PAH menggunakan
HPLC.

2.1 Definisi HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) berasal dari kromatografi kolom klasik dan merupakan salah
satu alat terpenting kimia analitik saat ini. HPLC adalah metode pilihan untuk memeriksa kemurnian
puncak entitas kimia baru, memantau perubahan reaksi dalam prosedur sintetis atau meningkatkan,
mengevaluasi formulasi baru dan melakukan kontrol kualitas. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
sekarang menjadi salah satu alat paling kuat dalam kimia analitik. Ini memiliki kemampuan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, dan mengukur senyawa yang ada dalam setiap sampel yang dapat
dilarutkan dalam cairan (Kumar dan Dwivedi, 2015).

Prinsip HPLC adalah larutan sampel yang disuntikkan ke dalam kolom bahan berpori (fase diam) dan
fase cair (fase gerak) dipompa pada tekanan tinggi melalui kolom. Prinsip pemisahan yang diikuti
adalah adsorpsi zat terlarut pada fase diam berdasarkan afinitasnya terhadap fase diam. Teknik HPLC
memiliki fitur berikut (Kumar dan Dwivedi, 2015):

Sebuah. Resolusi tinggi

b. Diameter kecil, stainless steel, kolom kaca

c. Analisis cepat

d. Tekanan fase seluler relatif lebih tinggi

e. Laju aliran fase seluler yang dikendalikan

Jantung dari sistem HPLC adalah kolom. Mengubah kolom akan memiliki efek terbesar pada resolusi
analit selama pengembangan metode. Memilih kolom terbaik untuk aplikasi memerlukan
pertimbangan kimia fase diam, kapasitas retensi, ukuran partikel, dan dimensi kolom. Tiga
komponen utama kolom HPLC adalah perangkat keras, matriks, dan fase diam. Ada beberapa jenis
matriks untuk mendukung fase diam, termasuk silika, polimer, alumina, dan zirkonium. Silika adalah
matriks paling umum untuk kolom HPLC. Matriks silika kuat, mudah diderivatisasi, dibuat sesuai
ukuran bola yang konsisten, dan tidak cenderung mengompres di bawah tekanan. Silika stabil secara
kimiawi untuk sebagian besar pelarut organik dan sistem pH rendah. Salah satu kekurangan dari
dukungan silika padat adalah bahwa ia akan larut di atas pH 7 (Kumar and4 Dwivedi, 2015)

Gambar Dalam beberapa tahun terakhir, kolom yang didukung silika telah dikembangkan untuk
digunakan pada pH tinggi. Sifat, bentuk dan ukuran partikel dari silika mendukung efek pemisahan.
Partikel yang lebih kecil menghasilkan jumlah lempeng teoretis yang lebih banyak, atau meningkat.
Sifat fase diam akan menentukan apakah kolom dapat digunakan untuk kromatografi fase normal
atau fase terbalik. Kromatografi fase normal menggunakan fase diam polar dan fase gerak non-polar.
Secara umum, lebih banyak senyawa polar terelusi lebih lambat daripada senyawa non-polar (Kumar
dan Dwivedi, 2015).

2.2 Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH)

Hidrokarbon aromatik polycyclic (PAHs) adalah hidrokarbon aromatik dengan dua atau lebih cincin
benzena yang tergabung dalam berbagai konfigurasi struktural dan tidak mengandung atom hetero
atau membawa substituen. PAH yang berisi hingga empat cincin disebut PAH ringan dan yang berisi
lebih dari empat cincin adalah PAH berat. PAH berat lebih stabil dan lebih beracun daripada PAH
ringan. PAH hanya terdiri dari karbon dan hidrogen yang terikat pada sistem cincin sederhana hingga
kompleks, pengaturan cincin benzen mereka memiliki keragaman karakteristik fisik, kimia, dan
toksikologi yang beragam. Tabel 1. Pola hubungan cincin dalam PAH dapat terjadi sedemikian rupa
sehingga atom karbon tersier adalah pusat dari dua atau tiga cincin yang saling terkait, seperti dalam
antrasena PAH-annelated linear atau PAHpyrene pericondensed. Namun, sebagian besar PAH
muncul sebagai hibrida yang mencakup berbagai komponen struktural, seperti naftalena,
asenafthilena, asenaftena, fluor, fenantrena, antrasena, fluorantena, piren, antrasena, krisan, krisan,
benzo (b) fluorantena, benzo (k) fluorantena, benzo (a) pyrene, benzo (ghi) perylene dibenz (a, h)
antrasena dan indeno (1,2,3-cd) pyrene. Secara umum, peningkatan ukuran dan angularitas molekul
PAH menghasilkan peningkatan hidrofobik dan stabilitas elektrokimia secara bersamaan (Boongla
dkk, 2017).

PAH adalah polutan organik persisten berbahaya, sedangkan PAH dengan berat molekul tinggi
(HMW) bahkan lebih merusak lingkungan dan kesehatan manusia. Dua faktor utama yang
berkontribusi terhadap persistensi PAH HMW di lingkungan adalah stabilitas molekul PAH dan
hidrofobisitas. Pola hubungan cincin dalam PAH dapat terjadi sedemikian rupa sehingga atom
karbon tersier adalah pusat dari dua atau tiga cincin yang saling terkait, seperti dalam anthracene
PAH-annelated kata linier dan piren PAH terkondensasi. Rasio konsentrasi tertentu
pasangan PAH digunakan secara luas untuk penentuan kualitatif sumber-sumber PAH. Rasio ini
disebut rasio diagnostik molekuler PAH dan biasanya digunakan untuk konsentrasi PAH di udara,
tanah, dan sedimen. Beberapa ilmuwan telah memperluas penggunaan rasio ini juga untuk lumpur
limbah, menunjukkan bahwa perhitungan rasio ini dengan konsentrasi PAH individu dapat sama
efektifnya dengan di tanah atau sedimen. Rasio diagnostik PAH dapat menyediakan alat penting
untuk identifikasi emisi polusi PAH (Boongla dkk, 2017).

Penerapan rasio diagnostik PAH telah digunakan oleh para peneliti lingkungan untuk
mengidentifikasi sumber-sumber PAH. Rasio diagnostik PAH telah ditinjau, dikritik, dikomentari
tentang penggunaannya dan banyak peneliti telah menetapkan batasan mereka. Katsoyiannis, Terzi
et al. (2007) menjelaskan alasan mengapa rasio molekuler PAH yang dihitung dari konsentrasi
lumpur limbah sebaiknya tidak digunakan untuk memahami sumber PAH. Tobiszewski menyatakan
bagaimana rasio diagnostik PAH biasa digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi dan menilai
sumber emisi polusi. Beberapa rasio diagnostik didasarkan pada PAH induk, yang lain pada proporsi
alkil-tersubstitusi untuk molekul yang tidak tersubstitusi. Rasio ini berlaku untuk PAH yang
ditentukan dalam media lingkungan yang berbeda: udara (fase gas + partikel), air, sedimen, tanah,
serta organisme biomonitor seperti daun atau jarum konifer, dan kerang. Rasio diagnostik PAH
membedakan polusi PAH yang berasal dari produk minyak bumi, pembakaran minyak bumi dan
biomassa atau pembakaran batu bara. Senyawa yang terlibat dalam masing-masing rasio memiliki
massa molar yang sama, sehingga dianggap memiliki sifat fisikokimia yang sama. Sejumlah penelitian
menunjukkan bahwa rasio diagnostik berubah nilainya ke tingkat yang berbeda selama transfer fase
dan degradasi lingkungan. Perhitungan rasio biasanya dibatasi untuk PAH dalam massa molekul
tertentu. Struktur kimia dari beberapa PAH yang dipelajari secara umum di antara 16 PPA EPA
ditunjukkan pada Gambar 1 (Boongla dkk, 2017).

Gambar

Rute utama paparan PAH dalam populasi umum adalah dari menghirup udara dalam ruangan,
makan makanan yang mengandung PAH, merokok, atau menghirup asap dari perapian terbuka, dari
bahan bakar fosil yang kita gunakan untuk mengendarai mobil kita, memasak makanan kita,
menghangatkan rumah kita, dan bahan bakar industri kita. PAH dalam daun tanaman pertanian,
berkontribusi pada paparan organisme terhadap bahan kimia ini melalui jalur makanan. Paparan
pekerja terhadap PAH, mis., Selama produksi kokas, atap menggunakan produk bitumen,
pengilangan minyak, dan gasifikasi batubara. Paparan terhadap PAH dapat juga terjadi dari pekerja
yang menghirup asap knalpot seperti mekanik, pedagang kaki lima, atau kendaraan bermotor dan
mereka yang terlibat dalam penambangan, pengerjaan logam. Rute utama paparan adalah konsumsi
makanan dan bagi perokok, kontribusi dari merokok bisa menjadi besar. Makanan dapat
terkontaminasi dari sumber lingkungan (alami dan sebagian besar antropogenik), dari pengolahan
makanan industri, dan dari beberapa praktik memasak domestik. PAH dapat memasuki rantai
makanan dengan pengendapan dari udara, atau dengan pengendapan dan transfer dari tanah dan
air (Boongla dkk, 2017).

Paparan manusia terhadap PAH juga terjadi melalui penghirupan asap rokok, paparan emisi industri,
knalpot mobil, tempat limbah berbahaya, bahan bakar jet, dan lubang pembakaran, dan konsumsi
makanan bakar. Manusia juga terpapar PAH melalui udara, air dan makanan yang terkontaminasi
yang mereka konsumsi. PAH sering diukur di atmosfer untuk penilaian kualitas udara, di jaringan
biologis untuk pemantauan efek kesehatan, dalam sedimen dan moluska untuk pemantauan
lingkungan, dan bahan makanan untuk alasan keamanan. Sumber eksklusif untuk kontaminasi
Benzol (a) pyrene (BaP) terhadap lingkungan dan paparan terhadap manusia termasuk emisi industri
dan mobil, tempat limbah berbahaya, asap rokok, pembakaran biomassa, pembakaran limbah,
insinerator kota, letusan gunung berapi, pemanasan rumah dan konsumsi arang makanan panggang
dan diasap (Boongla dkk, 2017).

Eksposur dari berbagai pekerjaan dan campuran polutan tingkat tinggi yang mengandung
PAH diketahui menyebabkan gejala seperti iritasi mata, mual, muntah, dan diaore. Campuran PAH
juga diketahui menyebabkan iritasi dan peradangan kulit. Anthracene, benzo (a) pyrene, dan
naphthalene adalah iritan kulit langsung, sedangkan anthracene dan benzo (a) pyrene dilaporkan
sebagai penyensitif kulit, mis. Sebagai penyebab respons kulit alergi pada hewan dan manusia.
Serangkaian masalah kesehatan (peningkatan risiko kanker kulit, paru-paru, kandung kemih, dan
gastrointestinal) untuk pekerja yang terpapar pada campuran PAH dan paparan tempat kerja lainnya
dari bahan kimia PAH telah dilaporkan, PAH misalnya BaP dan Pyrene telah diidentifikasi sebagai
penyebabnya. kanker pada hewan laboratorium. Kontak kulit yang berulang dengan PAH
naphthalene dapat menyebabkan kemerahan dan peradangan pada kulit. Kerusakan DNA yang
disebabkan oleh paparan PAH telah ditunjukkan oleh banyak penulis. Paparan jangka panjang
terhadap PAH diduga meningkatkan risiko kerusakan sel melalui mutasi gen dan mortalitas
kardiopulmoner (Boongla dkk, 2017).

2.3 Beberapa Penelitian PAH dengan Instrumen HPLC

2.3.1 Kejadian hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) di kerang (Mytilus galloprovincialis) dan belut
(Anguilla anguilla) dari Bizerte lagoon, Tunisia, dan penilaian risiko kesehatan manusia terkait

Pembuangan langsung dan tidak langsung limbah perkotaan, agri budaya dan industri dan limpasan
telah mengakibatkan peningkatan kontaminasi kimia laguna oleh berbagai senyawa beracun seperti
polychlorinated biphenyls (PCBs), atau pestisida ganochlorine (OCPs), hidrokarbon aromatik poliklik
(PAH) ), eter difenil polibrominasi (PBDEs) dan analognya yang teretoksilasi (MeO-PBDEs), organotin
dan logam berat. Ini telah menyebabkan penurunan produksi ikan dan bivalvia selama beberapa
dekade terakhir. Untuk menempatkan ini ke dalam perspektif, hanya 61,06 t kerang diproduksi pada
tahun 2002 dibandingkan dengan 116,500 t pada tahun 1998. Penurunan tajam ini adalah salah satu
alasan utama yang telah menyebabkan otoritas Tunisia untuk mulai fokus pada menjaga kualitas
kimia dan biologis organisme laut di area (Barhoumi, 2016).

Hidrokarbon aromatik polycyclic, salah satu polutan yang paling luas menyebar di
lingkungan, adalah kontaminan di mana-mana di lingkungan perairan, termasuk laguna pesisir.
Karena efek karsinogenik dan mutagenik mereka, mereka membentuk kelas polutan yang banyak
dipelajari. Mereka termasuk sekelompok besar zat beragam, mulai dari dua cincin benzena hingga
struktur kompleks yang terkandung dalam grup hingga 10 cincin. Kegiatan antropogenik, termasuk
pembakaran minyak, kayu, bahan bakar fosil atau bahan organik baru-baru ini, dan ada sewa
hidrokarbon yang terhubung dengan prospeksi minyak mentah, adalah penyebab utama tingginya
tingkat PAH di lingkungan. PAH juga dapat diproduksi di alam sebagai hasil dari kebakaran hutan
atau rembesan alami minyak bumi, atau berasal dari prekursor biogenik. PAH yang memasuki
ekosistem perairan dapat pertama kali diakumulasi dalam sedimen berbutir halus dan partikel
tersuspensi karena sifat hidrofobiknya, yang kemudian diemobilisasi ulang dalam kolom air,
kemudian menjadi tersedia secara biologis bagi organisme asli (Barhoumi, 2016).

Kerang sp. Telah terbukti secara efisien mengakumulasi jejak kontaminan dan telah ditetapkan
sebagai organisme penjaga dalam pemantauan kualitas air dan dalam program penelitian. Kerang
adalah feed filter sessile, mampu mengakumulasi dan mentoleransi polutan konsentrasi tinggi, hadir
di wilayah geografis yang sangat luas, mudah dikumpulkan, dan terutama berlimpah di perairan
pesisir dan muara. Selain itu, kerang memiliki kemampuan terbatas untuk memetabolisme polutan
organik terutama PAH dan karena itu saat ini digunakan untuk memantau kontaminasi PAH di
lingkungan laut. Namun, akumulasi zat-zat ini tidak hanya tergantung pada karakteristik fisikokimia
kontaminan, tetapi juga dari fisiologi kerang dan kandungan lipidnya (Barhoumi, 2016).

Asupan makanan dari makanan yang terkontaminasi, dan terutama produk air, dianggap sebagai
salah satu sumber utama dari paparan total manusia terhadap bahan kimia beracun. Akumulasi PAH
dalam organisme laut dapat memengaruhi kesehatan dan produktivitasnya secara negatif. Ini juga
dapat mempengaruhi status gizi dan kesehatan populasi manusia yang sering mengonsumsi
makanan laut. Paparan manusia terhadap PAH ini dapat menyebabkan peningkatan tingkat kanker,
mutasi, dan cacat lahir. Oleh karena itu beberapa negara dan Organisasi Kesehatan Dunia (WHO)
telah menetapkan batas konsentrasi maksimum PAH di beberapa organisme laut di mana kesehatan
konsumen manusia terancam. Risiko kesehatan akibat asupan makanan PAH sering dinilai
menggunakan benzo [a] ekuivalen piren (B (A) Peq) dan batas ambang toksikologis (dosis referensi
oral (RfD) untuk efek non-karsinogenik dan faktor kemiringan kanker (CSF) untuk efek karsinogenik) )
(Barhoumi, 2016).

Lokasi pengambilan sampel

Laguna Bizerte adalah laguna terbesar kedua di Tunisia. Terletak di bagian yang sangat penting
secara ekonomi di Tunisia utara (lintang, 37 ° 80′ – 37 ° 14′N; bujur, 9 ° 46′ – 9 ° 56′E). Ini mencakup
area seluas 128 km2 dan memiliki kedalaman rata-rata 7m. Ini berkomunikasi, di Utara, dengan Laut
Mediterania oleh kanal sepanjang 7 km dan, di Selatan, dengan Danau Ichkeul di tepi Sungai Tinja.
Anak sungai utama dari laguna ini adalah sungai Tinja, Mrezig, Garek, Ben Hassine, dan Gueniche.
Enam stasiun pengambilan sampel dipilih dengan di daerah laguna Bizerte yang digunakan untuk
penelitian kami (Gbr. 1). Mereka dipilih berdasarkan kemungkinan perbedaan dalam tingkat
kontaminasi ketersediaan pasir bivalvia dan ikan: dua daerah non-urban yang dianggap relatif tidak
terkontaminasi (S2 dan S3), dan empat zona jelas terkena tekanan antropogenik (S1, S4, S5 dan S6) .
S1 (37 ° 12′58.51 ″ N, 9 ° 55′25.16 ″ E), terletak di dekat daerah pertanian kerang dan menerima
pembuangan kronis dari limpasan kota dan pembuangan air kotor dari kota Menzel Jemil. Juga,
menerima limbah dari beberapa unit industri, seperti kain tekstil dan industri elektronik yang
berlokasi di kota. Kedua stasiun S2 (37 ° 9′23.86 ″ N, 9 ° 52 ′ 53.04 ″ E) dan S3 (37 ° 8′38.82 ″ N, 9 °
50′29.25 ″ E), dianggap jauh dari sumber polusi tetapi dipengaruhi oleh input pertanian. S4 (37 °
8′53.24 ″ N, 9 ° 48′43.67 ″ E) dan S5 (37 ° 10′24.85 ″ N, 9 ° 48′22.60 ″ E), terletak di bagian barat
selatan laguna dan menerima limbah industri dan perkotaan, dari kompleks baja El Fouledh dan kota
Menzel Bourguiba. Stasiun keenam, S6 (37 ° 10′18.22 ″ N, 9 ° 45′32.12 ″ E), terletak di Sungai Tinja
dekat dengan daerah perkotaan. Ini dipengaruhi oleh badan air yang berasal dari Danau Ichkeul di
musim dingin dan laguna Bizerte di musim panas (Barhoumi, 2016).
Pengumpulan dan persiapan sampel

Kerang liar Mediterania (M. galloprovincialis) dengan ukuran yang sama (panjang cangkang 4-6 cm)
dikumpulkan pada akhir Mei 2012 (periode istirahat seksual), di 5 lokasi pengambilan sampel (S1
hingga S5) di laguna Bizerte (Gbr. 1). Tiga kumpulan sedikitnya 30 individu dikumpulkan di setiap
stasiun pengambilan sampel. Pekerjaan ini dilakukan oleh penyelam scuba, yang beroperasi pada
kedalaman sekitar 3-5 m. Spesimen kemudian segera dibawa ke laboratorium dalam kotak es.
Setelah itu, kerang dibuka dan jaringan lunak dikeluarkan dari cangkang dan segera dibekukan (-20 °
C) dalam stoples kaca bersih, sebelum dikeringkan dan dihomogenkan dengan blender. Belut biasa
(A.anguilla) dalam fase kuning (belum matang) dikumpulkan pada bulan April 2012, di 3 stasiun (S1,
S4 dan S6) (Gbr. 1). Di setiap stasiun, total 10 ikan ditangkap, disimpan dalam tangki plastik 80 L
dengan udara menggelegak dan segera diangkut ke laboratorium, di mana berat dan panjangnya
dicatat (510,7760,7 g berat, panjang 58,573,5 cm). Penanganan ikan dilakukan sesuai dengan
pedoman Uni Eropa (OJEU, 2010). Mereka ditidurkan dengan dislokasi serviks, dan jaringan otot
masing-masing ikan dengan cepat dibedah, dan disimpan secara terpisah pada -20 ° C sampai
pengeringan beku dan homogenisasi dengan blender (Barhoumi, 2016).

  Bahan kimia

Standar (padatan) dari 15 USEP PAHs Prioritas [naphthalene (Nap), acenaphthene (Ace), fluorene
(Fl), phenanthrene (Phe), anthracene (Ant), fluoranthene (Flu), pyrene (Pyr), benzo [a] an -thracene
(BaA), chrysene (Ch), benzo [b] fluoranthene (BbF), benzo [k] fluoranthene (BkF), benzo [a] pyrene
(BaP), dibenzo [a, h] anthra-cene (DahA) , benzo [g, h, i] perylene (BghiP) dan indeno [1,2,3-cd]
pyrene (I (1,2,3cd) P)] dengan kemurnian mulai dari 95 hingga 99,9%, dibeli dari Supelco (Bellefonte,
PA, USA). Standar selanjutnya diencerkan dengan asetonitril (ACN) untuk menyiapkan solusi kalibrasi
dalam kisaran 15-400 ng mL-1. Semua pelarut yang digunakan untuk pemrosesan sampel dan
analisis (aseton, ACN, heksana, dan Etil asetat) memiliki tingkat kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) dan dibeli dari Fisher (Inggris). Asam sulfat (95-97%) diperoleh dari Biotechnica. Adsorben
Florisil Highpurity (60-100mesh) diperoleh dari Fluka, diaktifkan pada 650 ° C dan mundur pada 130 °
C selama 5 jam; itu disimpan dalam desikator sampai digunakan. Alumina (150 basa, tipe T
partikelisasi 0,063-0,2 mm) (Merck, Darmstadt, Jerman) dicuci dengan diklorometana dan diaktifkan
selama 14 jam pada 150 ° C. Natrium sulfat anhidrat (Na2SO4) dibeli dari Fluka dan memiliki tingkat
analitik. Itu dipanaskan pada 300 ° C dan disimpan dalam oven pada 130 ° C. Air yang digunakan
berasal dari sistem Milli Q (Barhoumi, 2016).

Analisis kimia

Ekstraksi dan pembersihan

Prosedur yang digunakan untuk menentukan konsentrasi PAH dalam jaringan lunak kerang dan otot
ikan telah dijelaskan sebelumnya, dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 5 g sampel beku-
kering adalah Soxhlet diekstraksi dengan n-heksana: aseton (4: 1; v / v) selama 16 jam dengan
kecepatan lima siklus per jam. Ekstrak yang diperoleh (250 mL) dipekatkan sampai 10 mL
menggunakan rotary vacuum evaporator pada 25 ° C. Lipid ditentukan dengan metode gravimetri.
Secara singkat, 1 mL ekstrak pekat diambil untuk menguapkan pelarut sampai diperoleh berat
konstan, yang merupakan berat kering lipid. Di sana ekstrak utama diuapkan sampai hampir kering
di bawah nitrogen tream dan kemudian dilarutkan dengan 10 mL heksana sebelum pembersihan
H2SO4. Lima mL H2SO4 pekat ditambahkan ke ekstrak, dan campuran dikocok dengan kuat selama 2
menit. Kedua lapisan dipisahkan, dan lapisan berair kuning-coklat dibuang. Prosedur ini diulang dua
kali diikuti dengan membilas ekstrak dengan air dan natrium bikarbonat (5%). Setelah itu, ekstrak
dikurangi menjadi sekitar 2mL di bawah aliran nitrogen lembut dan kemudian dibersihkan pada
kolom n-heksana yang sebelumnya dikondisikan (kolom kaca (diameter internal 1cm panjang 15 cm)
yang berisi potongan-potongan wol kaca pada frit kaca) diisi dengan Masing-masing 1g alumina aktif,
Florisil dan natrium sulfat anhidrat. PAH dielusi dari kolom menggunakan 40 mL etilasetat / heksana
(1: 1). Akhirnya, ekstrak diuapkan sampai kering dengan aliran nitrogen lembut pada suhu kamar
dan kemudian dilarutkan dalam 0,5 mL asetonitril (Barhoumi, 2016).

  lisis instrumen

Penentuan PAH dalam sampel yang diekstraksi diselesaikan menggunakan unit HPLC analitik (JASCO,
Jepang) yang dilengkapi dengan pompa JASCO PU-2089 HPLC, tipe 7125 Rheodyne injector (dengan
loop 20 μL), dan detektor fluoresensi (FP-2020) ) dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi yang
dapat bervariasi sepanjang analisis (Kel / Em: 224 / 330nm pada 0m in, 252 / 370nm pada 13,8
menit, 252/402 nm pada 15,3 menit, 288 / 462nm pada 16,7 menit, 238 / 398nm) pada 17,8 menit,
252 / 402nm pada 20,3 menit, 290 / 430nm pada 24,7 menit, 300 / 401nm pada 34,5 menit, 293 /
498nm pada 37,5 menit) (Barhoumi, 2016).

Hasil

Tabel 1 Tingkat PAH (ng g-1 berat kering) dan konten lipid (%) di jaringan kerang dan otot belut dari
Bizerte lagoon.

Gambar

Konsentrasi total PAH (AHPAH) dan congener individual yang diamati pada jaringan kerang,
dan otot belut tercantum dalam Tabel1. Konsentrasi ΣPAH dalam sampel kerang berkisar antara
107,476,9 ng g-1 dw (stasiun 2) hingga 430,7733,0 ng g-1 dw (stasiun 5) dengan konsentrasi rata-rata
264,8 ng g-1 dw. Konsentrasi ΣPAHs menunjukkan perbedaan yang signifikan antara stasiun (p
<0,001) dengan pengecualian stasiun S1 dan S4 (p> 0,05). Naphthalene adalah congener yang
mendominasi di kerang dari semua lokasi pengambilan sampel, dengan dua pengecualian: stasiun S1
dan S4 di mana Phe adalah congener yang mendominasi diikuti oleh Ace. Di sisi lain BaP dan DahA
hanya ditemukan di kerang dari stasiun S4. Fluoranthene dan BaA tidak ditemukan di stasiun S2 dan
S3. PAH prioritas lainnya ditemukan di kerang dari sebagian besar stasiun pengambilan sampel. Ada
peningkatan konsentrasi ΣPAH dibandingkan dengan stasiun referensi, S2 dan S3 (masing-masing
107.476.9 dan 209.877.2 ng g-1 dw) dalam sampel kerang yang diambil di stasiun S5, S4 dan S1
(430.7733.0 , 292.2728.7 dan 284.0722.9 ng g-1 dw, masing-masing). Ini kemungkinan adalah tanda
tangan dari sumber polusi lokal, seperti kompleks baja "El Fouledh" (di sebelah stasiun S5 dan S4),
pabrik baut (MATUBO) dan pabrik Pemintalan, Tenun dan Kerajinan (MAFILTA) (di sebelah stasiun S1
), serta efek dari aktivitas perkotaan yang penting, pelabuhan dan galangan kapal yang terletak di
sana. Kerang yang dikumpulkan di stasiun S2 dan S3, adalah yang paling tidak terpengaruh oleh
polusi karena mereka jauh dari sumber polusi. Konsentrasi jaringan pada S2 ditemukan empat
urutan besarnya lebih rendah daripada di daerah yang paling terkontaminasi (S5), tetapi sampai jauh
di atas batas deteksi. Transportasi atmosfer dan pengendapan mungkin merupakan jalur yang
bertanggung jawab atas terjadinya PAH, bahkan di daerah yang jauh dari input polutan langsung
yang kemudian diakumulasikan oleh organisme akuatik (Barhoumi, 2016).

2.3.2 Jurnal Validasi Metode HPLC untuk Penentuan Prioritas Hidrokarbon Aromatik Polisiklik (PAHS)
dalam Air Limbah dan Sedimen

Sebuah. Abstrack

Sebuah metode sederhana ekstraksi dan penentuan enam belas prioritas hidrokarbon aromatik
polisiklik prioritas (PAH) dari air limbah dan sedimen menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) telah divalidasi dengan batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ), metode pemulihan
dan reproduktifitas dan faktor lainnya. Parameter HPLC, seperti komposisi fase gerak dan aliran yang
distandarisasi untuk penentuan PAH menggunakan detektor ultra violetdiode array (UV-DAD).
Ekstraksi PAH dilakukan dengan cairan-cair dan Ultrasonication menggunakan pelarut diklorometana
dan aseton / heksana untuk air dan sedimen. Kromatografi kolom silika gel dilakukan untuk
pembersihan ekstrak. Linearitas kurva kalibrasi baik untuk semua enam belas PAH (R2, 0,991-0,996)
dalam kisaran konsentrasi 2,5-300 ppb. Analisis sampel air dan endapan berduri standar
menghasilkan pemulihan yang baik antara 78-100% dan 82-106%, masing-masing. Estimasi LOD dan
LOQ masing-masing berkisar antara 0,01-0,51 ppb dan 0,03-1,71 ppb. Metode yang dijelaskan telah
digunakan untuk menentukan enam belas kandungan PAH dalam sampel air dan sedimen yang
dikumpulkan dari saluran air kota (Kumar dan Verma, 2014).

b. pengantar

Hidrokarbon aromatik poliklik atau hidrokarbon polyaromatik adalah kelompok senyawa aren
organik yang terdiri dari dua atau lebih cincin benzen aromatik dengan massa molekul mulai dari 128
Dalton hingga 278 Dalton. Ada ratusan hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) di lingkungan, di
antaranya; enam belas PAH telah diklasifikasikan sebagai polutan prioritas oleh United States
Environmental Protection Agency. Enam belas PAH prioritas termasuk naphthalene, acenaphthene,
acenaphthylene, fluorene, phenanthrene, antracene, fluoranthene, pyrene, benzo [ant] anthracene,
chrysene, benzo fluoranthene, benzo [k] fluoranthene, benzo (a) pyrene, dibenzo , h] antrasena,
indeno [1,2,3-cd] pyrene dan benzo [g, h, i] perylene. Mereka menjadi perhatian karena toksisitas
dan kecenderungan untuk menumpuk di sedimen, tanah dan melalui bioakumulasi, biomagnifikasi
dalam rantai makanan (Kumar dan Verma, 2014).

PAH dilepaskan ke lingkungan terutama dari produk minyak bumi (sumber petrogenik) dan aktivitas
antropogenik dari proses pembakaran tidak lengkap yang melibatkan batubara, produk minyak bumi
dan biomassa (sumber pirogenik). Karena tekanan uapnya yang rendah, non-polar, lipofilik dan
sangat hidrofobik, mereka terdistribusi secara global dalam sistem atmosfer, darat, dan akuatik.
Senyawa PAH dengan berat molekul rendah memiliki kelarutan air yang lebih tinggi yang berkurang
dengan meningkatnya massa molekul. PAH umumnya cenderung lebih mudah diserap ke dalam
bahan organik. Di lingkungan, PAH mudah dikaitkan dengan zat organik seperti biopolimer, zat
humat dan karbon hitam. Namun, di lingkungan akuatik, mereka muncul sebagai molekul bebas

c. Material dan metode

• Bahan Kimia, Pelarut dan Standar

Pelarut tingkat HPLC (heksana, aseton dan diklorometana), natrium sulfat (kelas AR), air (kelas HPLC)
dan asetonitril (grade gradien HPLC) diperoleh dari Fisher Scientific dan Merck, India yang digunakan
dalam pemrosesan dan analisis. Pelarut yang digunakan dalam fase gerak terdegradasi oleh
Sonication sebelum digunakan. Silica gel (100-200 mesh) yang diperoleh dari Supelco (Sigma-Aldrich,
USA) diaktifkan pada 130 ° C selama 16 jam dan digunakan sebagai absorben selama pembersihan
kolom kromatografi. Sodium sulfat anhidrat (Merck, India) dibersihkan dengan pelarut dalam Soxhlet
dan disimpan dalam desikator tertutup. Larutan standar individu dari 16 senyawa PAH [naphthalene
(Npt), acenaphthene (ANe), acenaphthylene (ANy), fluorene (Fle), phenanthrene (Phe), antracene
(Ant), fluoranthene (Flt), pyanth (Pyr), benzo [ a] anthracene (BaA), chrysene (Chr), benzo [b]
fluoranthene (BbF), benzo [k] fluoranthene (BkF), benzo (a) pyrene (BaP), dibenzo [a, h] anthracene
(DBA), indeno [1,2,3-cd] pyrene (Ind), dan benzo [g, h, i] perylene (BghiP)] dan solusi campuran
prioritas 610 EPA dibeli dari Supelco (Sigma-Aldrich, USA). Solusi standar kerja disiapkan dengan
mengencerkan solusi stok sesuai kebutuhan. Air ultra murni disiapkan menggunakan sistem
pemurnian air Mili-Q plus.

• Peralatan

Semua gelas dibersihkan dengan deterjen diikuti oleh air deionisasi dan akhirnya pelarut bilas dan
dikeringkan dalam oven udara panas. Teknik LLE dan Sonication menggunakan corong pisah dan
rendaman air Ultrasonik diikuti untuk ekstraksi PAH dari air dan sedimen, masing-masing. Vacuum
rotary evaporator (Eyela, Tokyo, Jepang), Turbovap

Gambar

(Caliper, USA) dan Minivap (Supelco, USA) digunakan untuk konsentrasi ekstrak. Sistem
HPLC (Seri 1100, Agilent Technology Inc., Santa Clara, CA, USA) digunakan dalam kombinasi dengan
sistem pengiriman pelarut kuartener dengan unit degasser vakum, sampler otomatis, oven kolom,
dan UV-DAD (detektor array ultra violet-diode) ) (λ = 254 nm) untuk analisis kromatografi.

• Kondisi Analitik

Pemisahan kromatografi dilakukan pada LC-PAH SupelcosilTM, kolom analitik (25cm x 4,6 mm, film 5
μm) dan Eclipse XDB-C8 (4,6 x 12,5 mm, film 5 μm) sebagai kolom pelindung dengan 20 sampel
injeksi μL dan sampel aliran gradien dengan asetonitril dan air @ 1,0 ml / menit. Suhu dalam oven
kolom diatur ke 30◦C. Fase gerak dengan kondisi elusi multi-langkah gradien digunakan dengan total
jangka waktu 50 menit per sampel injeksi ekstrak (Tabel 1).

• Ekstraksi Sampel

Satu (1L) sampel air diambil dalam corong pemisah dan diekstraksi dengan diklorometana tiga kali
(50, 30, 20 ml) dengan pengocokan kuat masing-masing selama 2 menit. Fase organik dilewatkan
melalui natrium sulfat anhidrat untuk menghilangkan jejak kandungan air dan ekstrak dipekatkan
hingga mendekati 5 ml dengan vakum rotary evaporator (Eyela, Tokyo, Jepang). Volume ekstrak
pekat dikurangi di bawah aliran gas nitrogen murni menggunakan Turbo Vap (Caliper, USA) dan
Minivap (Supelco, USA) dan pelarutnya ditukar dengan asetonitril (1,0 ml).

Teknik ultrasonication digunakan untuk ekstraksi PAH dari sampel sedimen. Selama proses ini,
sekitar 20 g sampel sedimen dicampur secara menyeluruh dengan natrium sulfat anhidrat untuk
mendapatkan bubuk yang mengalir bebas dan diekstraksi dengan 50 ml campuran aseton-heksana
(1: 1 v / v) selama 30 menit dalam rendaman ultrasonik. Setelah Sonication, ekstrak diizinkan untuk
mengendap dan lapisan pelarut disaring melalui kertas saring Whatman 41. Proses itu diulang untuk
dua kali lagi. Ekstrak pelarut yang terkumpul terkonsentrasi hingga mendekati 1,0 ml di bawah
tekanan tereduksi dalam penangas air 40 0C menggunakan rotary evaporator (Eyela, Tokyo, Jepang).

• Ekstrak Pembersihan

Pembersihan ekstrak diperlukan untuk menghilangkan senyawa yang diekstraksi bersama yang
dapat mengganggu selama analisis instrumental. Ekstrak sampel dibersihkan menggunakan
kromatografi kolom silika gel. Untuk tujuan ini, kolom kromatografi gelas (25 cm x 10 mm id)
dikemas dengan sumbat wol kaca, 10 g silika gel aktif (100-200 mesh), 1 cm lapisan natrium sulfat
dan sumbat wol kaca digunakan untuk memisahkan fraksi analit yang diperlukan dari senyawa
pengganggu lainnya. Ekstrak terkonsentrasi dan dua bilasan heksana 2 ml dari tabung sampel
dipindahkan ke atas kolom. Kolom pertama kali dielusi dengan 30 ml heksana yang mengandung
hidrokarbon alifatik dan yang dibuang. Selanjutnya, elusi akhir dilakukan dengan 35 ml
diklorometana pada laju aliran ∼2 ml min-1 dan dipertahankan untuk kuantifikasi PAH. PAH yang
mengandung fraksi dipekatkan hingga mendekati 1 ml dengan rotary evaporator. Tambahan 20 ml
heksana ditambahkan ke ekstrak pekat dan diuapkan untuk menghilangkan jejak diklorometana.
Ekstrak akhir dipekatkan menjadi 1 ml di bawah aliran lembut nitrogen murni, menggunakan Turbo
Vap (Caliper, USA) dan Minivap (Supelco, USA) dan segera pelarut ditukar dengan asetonitril untuk
analisis PAH dengan HPLC.

• Kontrol Kualitas Analitik Dasar

Metode ini dilakukan dengan jaminan kualitas (sampel replikasi, verifikasi kalibrasi instrumen dan
pemeriksaan pengulangan instrumen). Dua duplikat kosong diproses sebagai sampel nyata untuk
memeriksa kontaminasi silang atau hilangnya analit. Seperangkat solusi standar stok kerja disiapkan
dengan mengencerkan alikuot dari solusi stok. Larutan standar PAH kalibrasi disiapkan dengan
pengenceran yang sesuai dari larutan stok dengan campuran asetonitril / air (50:50, v / v) untuk
memberikan konsentrasi yang sesuai dari setiap senyawa PAH (Tabel 2). Solusi standar kalibrasi
disimpan pada suhu 4 ºC dalam gelap dan stabil selama sekitar tiga bulan. Kalibrasi instrumen
dilakukan dengan menyuntikkan jumlah aktif konsentrasi PAH lima tingkat sebagai fungsi area
puncak menggunakan fit linear. Identifikasi puncak analit dilakukan oleh waktu retensi yang akurat
dari setiap standar. Kalibrasi diverifikasi dengan menganalisis standar kalibrasi tingkat menengah
dan perbedaan persentase relatif antara lima titik kalibrasi (Tabel 2). Instrumen dikalibrasi dengan
setiap batch analisis sampel. Kurva kalibrasi mengikuti hukum Beer dalam rentang investigasi PAH
yang disuntikkan di kolom. Data statistik lainnya untuk kalibrasi instrumen, yaitu persamaan regresi,
standar deviasi (SD) dan nilai koefisien korelasi berganda (R2) dari instrumen tercantum dalam Tabel
2. Pengukuran diulang tiga kali untuk setiap sampel dan hasilnya dirata-rata dan dinyatakan relatif
terhadap hasil rata-rata untuk metode kosong (konsentrasi, <DL "BDL"). Batas deteksi metode atau
batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) dihitung untuk puncak terukur yang valid pada rasio
sinyal terhadap noise> 3: 1 dan 10: 1. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) diperoleh
dengan memproses delapan alikuot dari sampel berduri untuk menghasilkan respons yang dapat
terdeteksi (s / n> 3) dan mengalikan deviasi standar dengan 3 (nilai siswa untuk delapan ulangan di
Tingkat kepercayaan 99%) dan 10, masing-masing. Batas deteksi yang dihitung secara statistik untuk
semua enam belas PAH disajikan pada Tabel 2. Kinerja metode dan efek matriks diperiksa dengan
menganalisis sampel berduri dengan standar pengganti (1-fluoronaphthalene). Hasil studi pemulihan
dilaporkan pada Tabel 3.

• Perhitungan Hasil

Hasilnya harus dihitung sebagai berikut:

Konsentrasi PAH (μg / l atau μg / kg) = (AxB / C)

Dimana:

A * = Konsentrasi PAH yang diperoleh dari instrumen (ng)

B = Volume ekstrak akhir (ml)

C = Volume sampel awal diambil (L atau Kg)

* Berdasarkan rata-rata 3 penentuan terpisah dari setiap solusi. Nilai kosong harus dikurangi.

• Penerapan Metode

Untuk menilai penerapan metode ini, penentuan prioritas enam belas hidrokarbon aromatik
polisiklik dilakukan dalam sampel air drainase kota dan sedimen. Sampel air dan sedimen
dikumpulkan dari berbagai situs saluran air kota di Delhi. Konsentrasi yang diamati dari masing-
masing senyawa PAH disajikan pada Tabel 5.

  d. Hasil dan Diskusi

• Persiapan Sampel dan Pembersihan

Tujuan dari pekerjaan kami adalah mengembangkan prosedur pembersihan satu langkah sederhana
yang cocok untuk air dan sedimen. Sampel air dibuat hanya dengan ekstraksi manual dengan
diklorometana. Sampel sedimen dihomogenisasi dengan natrium sulfat anhidrat dan ekstraksi
dilakukan dengan menggunakan teknik Sonication. Secara umum, matriks air bersih tidak
memerlukan langkah pembersihan. Namun, ekstrak sampel sedimen dibersihkan dengan
kromatografi kolom silika gel sederhana untuk memisahkan hidrokarbon aromatik dari hidrokarbon
alifatik. Injeksi ekstrak sampel yang tidak bersih menghasilkan generasi tekanan balik yang
substansial dalam kolom analitis, mengurangi reproduktifitas retensi dan gangguan dalam
identifikasi puncak [19]. Masalahnya hilang ketika pembersihan gel silika digunakan dan juga
ditemukan metode dapat digunakan pada sampel sedimen. Kedua metode ini hemat biaya, mudah
dilakukan dan digunakan oleh beberapa pekerja [11,20-22] untuk kuantifikasi PAH untuk penilaian
risiko kesehatan lingkungan dan manusia.
• Kuantifikasi Instrumental

Metode HPLC dan GC telah dianggap sebagai pendekatan yang sama validnya untuk menganalisis
PAH oleh USEPA dan lembaga lingkungan lainnya. Dalam penelitian ini, metode HPLC sederhana
divalidasi untuk pemisahan dan deteksi PAH dalam sampel air dan sedimen. Pemisahan hidrokarbon
aromatik polisiklik biasanya dilakukan pada kolom fase terbalik dengan fase seluler asetonitril-air
menggunakan deteksi array ultraviolet-dioda. Dalam kondisi ini, pemisahan tergantung pada retensi
PAH dalam kolom, yang sebanding dengan berat molekul sampel, yaitu hidrofobisitas [24]. Kondisi
elusi gradien fase HPLC seluler diberikan pada Tabel 1.

• Parameter Metode Validasi

Validasi metode analitik memainkan peran utama dalam mencapai data yang konsisten, andal, dan
akurat selama pengukuran analitis. Berbagai parameter telah didefinisikan [18, 25-28] untuk validasi
metode analitis, yang dijelaskan secara singkat dalam paragraf berikut.

Selektivitas / Kekhususan:

Spesifisitas adalah kemampuan metode analitik untuk membedakan dan mengukur analit dengan
adanya senyawa lain dalam sampel. Kekhususan dalam kromatografi cair diperoleh dengan memilih
kolom yang optimal dan mengatur kondisi kromatografi, seperti komposisi fase gerak, suhu kolom
dan panjang gelombang detektor. Selain pemisahan kromatografi, langkah persiapan sampel juga
dapat dioptimalkan untuk selektivitas terbaik. Kondisi HPLC spesifik yang dioptimalkan diikuti untuk
selektivitas dengan analisis sampel kosong (air pra-ekstraksi dan sampel sedimen) dalam rangkap
tiga. Setiap sampel kosong diuji untuk gangguan, dan selektivitas lebih rendah dari batas deteksi
(LOD). Spesifisitas metode ditentukan dengan menganalisis larutan sampel yang mengandung semua
enam belas senyawa PAH. Untuk tujuan ini 20 μL dari salah satu larutan sampel disuntikkan ke dalam
sistem HPLC dan spesifisitas metode diukur dalam hal resolusi antara dua puncak (waktu retensi)
tanpa tumpang tindih puncak (Tabel 2).