MAKALAH

FITOKIMIA

“Senyawa Flavonoid Nobiletin dari Jeruk Mandarin (Citrus reticulata)”

OLEH :

NAMA : ARI ANGGORO

NO. BP : 1701109

KELAS : 2017B / VIB

DOSEN PEMBIMBING : KHUSNUNNISA, M.Farm, Apt

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI (STIFARM)

PADANG

2020
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunianya
penulis dapat menyelesaikan makalah yang berjudul ”Senyawa Flavonoid Nobiletin
dari Jeruk Mandarin (Citrus reticulata)”. Penulis juga mengucapkan terimakasih
yang sebesar-besarnya kepada Ibu selaku dosen mata kuliah Fitokimia yang sudah
memberikan kepercayaan kepada penulis untuk menyelesaikan makalah ini.
Penulis sangat berharap makalah ini dapat bermanfaat dalam rangka
menambah pengetahuan juga wawasan bagi pembaca dan penulis tentunya. Penulis
pun menyadari bahwa di dalam makalah ini masih terdapat banyak kekurangan dan
jauh dari kata sempurna. Oleh sebab itu, penulis mengharapkan adanya kritik dan
saran demi perbaikan makalah yang akan penulis buat di masa yang akan datang,
mengingat tidak ada sesuatu yang sempurna tanpa saran yang membangun.
Mudah-mudahan makalah sederhana ini dapat dipahami oleh semua orang
khususnya bagi para pembaca. Penulis mohon maaf yang sebesar-besarnya jika
terdapat kata-kata yang kurang berkenan.

Padang, 09 April 2020

Penulis

2|Page
 DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................ 2
DAFTAR ISI........................................................................................................... 3
BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 4
A. Latar Belakang ............................................................................................. 4
B. Rumusan Masalah ........................................................................................ 4
C. Tujuan Penulisan......................................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 6
A. Tinjauan Tentang Tanaman Jeruk Mandarin (Citrus reticulata) .................. 6
B. Klasifikasi Tanaman..................................................................................... 6
C. Nama Daerah................................................................................................ 7
D. Morfologi Tanaman ..................................................................................... 7
E. Khasiat Tanaman.......................................................................................... 8
F. Kandungan ................................................................................................... 8
G. Efek Farmakologi......................................................................................... 8
H. Struktur Nobiletin ...................................................................................... 10
I. Cara Isolasi Flavonoid Nobiletin ............................................................... 11
BAB III PROSEDUR KERJA .............................................................................. 14
A. Alat dan Bahan........................................................................................... 14
B. Prosedur Kerja............................................................................................ 14
BAB IV PEMBAHASAN..................................................................................... 17
A. Pemisahan Pada Kromatografi Silika Gel.................................................. 17
B. Pemisahan pada sistem HPLC fase balik C18 ........................................... 18
C. Pemisahan pada kolom kiral Welk-O ........................................................ 18
D. Interaksi antara kelompok fungsional utama Whelk-O dan PMFs ............ 20
BAB V PENUTUP................................................................................................ 22
A. Kesimpulan ................................................................................................ 22
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 23

3|Page
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang kaya akan hasil pertanian seperti buah dan
sayuran. Salah satu komoditas holtikultura yang sangat sering dikonsumsi dan
ditanam oleh masyarakat. Indonesia adalah tanaman jeruk (Citrus sp). Jeruk
mandarin (Citrus reticulata) merupakan salah satu spesies dari sekian banyak
spesies jeruk yang sudah dikenal dan dibudidayakan di Indonesia. (AAK, 2006).

Kulit jeruk mandarin (citrus reticulata) mengandung 8 jenis flavanones dan

9 flavone/flavanols, diantaranya adalah hesperidin, naringin, dan
polymethoxylated flavones (PMFs). Kulit jeruk nipis, termasuk lapisan albedo,
flavedo dan lapisan segmennya, memiliki kandungan flavonoid yang lebih tinggi
daripada jus butiran daging buahnya. Flavonoid yang terkandung dalam kulit
jeruk nipis antara lain adalah eriocitrin, nairutin, hesperidin, neohesperidin,
neoponcirin, poncirin, isorhoifolin, diosmin, neodiosmin, sinensetin, nobiletin,
tangeretin, dan heptamethoxyflavone (Nogata et al, 2006) menyatakan bahwa
dalam kulit jeruk nipis juga terdapat kandungan apigenin, rutin, quercetin, dan
kaempferol yang melimpah. Selain flavonoid, dalam kulit buah jeruk juga
terkandung polymethoxylated flavones (PMFs), terpene limonoid, karoten dan
pigmen beta cryptoxanthin, citral, serta minyak atsiri. Zat-zat dalam kulit jeruk
tersebut mampu bekerja sebagai zat anti inflamasi, anti bakteri, anti mikroba, anti
virus, anti ulserogenik, anti oksidan, anti kanker, menurunkan kadar kolesterol,
anti neoplastik, antitumor, anti platelet, anti hepatotoksik, serta anti hipertensi
(Nogata et al, 2006).

B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana klasifikasi jeruk mandarin?
2. Apa saja kandungan kimia yang terdapat pada jeruk mandarin?

4|Page
 3. Apa saja kegunaan dari jeruk mandarin?
4. Apa saja efek farmakologi dari senyawa kimia flavonoid nobilotin?
5. Bagaimana cara mengisolasi nobilotin dari jeruk mandarin?
6. Bagaimana cara menganalisis senyawa nobilotin baik secara kualitatif
ataupun kuantitatif?

C. Tujuan Penulisan
1. Untuk mengetahui klasifikasi jeruk mandarin.

2. Untuk mengetahui kandungan kimia yang terdapat pada jeruk mandarin.

3. Untuk mengetahui kegunaan dari jeruk mandarin.

4. Untuk mengetahui efek farmakologi dari senyawa kimia flavonoid nobilotin.

5. Untuk mengetahui cara mengisolasi nobilotin dari jeruk mandarin.

6. Untuk mengetahui cara menganalisis senyawa nobilotin baik secara

kualitatif ataupun kuantitatif.

5|Page
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Tentang Tanaman Jeruk Mandarin (Citrus reticulata)

Jeruk (Citrus sp) merupakan tanaman tahunan yang berasal dari Asia
Tenggara. Sejak ratusan tahun yang lampau, tanaman ini sudah terdapat di
Indonesia, baik sebagai tanaman liar maupun sebagai tanaman budidaya. Di
Indonesia, bila dilihat dari luas pertanaman dan jumlah produksi per tahun jeruk
merupakan komoditas buah-buahan yang terpenting ketiga setelah pisang dan
mangga (Ashari, 1995). Jeruk mandarin (Citrus reticulata) merupakan salah satu
spesies dari sekian banyak spesies jeruk yang sudah dikenal dan dibudidayakan
di Indonesia (Zahara, 2002).

B. Klasifikasi Tanaman
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Super Divisi : Spermatophyta (Mengasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Sapindales

Famili : Rutaceae (Suku jeruk-jerukan)

Genus : Citrus

Spesies : Citrus reticulate Blanco

6|Page
C. Nama Daerah
Jeruk mandarin sendiri mempunyai nama daerah yaitu: keprok boci, keprok
brastepu (Sumatra Utara), keprok cina konde, keprok garut (Jawa Barat), keprok
batu atau keprok punten (Batu, Malang), keprok fremont atau frimong (Thailand)
dan keprok madura (Madura). (Zahara, 2002).

D. Morfologi Tanaman
Tanaman jeruk mandarin (Citrus reticulata) diduga berasal dari Asia
Tenggara, kemudian menyebar ke seluruh dunia terutama di daerah subtropis.
Berdsarkan habitat atau ekologi tumbuhnya, jeruk mandarin terbagi dalam dua
kelompok besar, yakni jeruk mandarin dataran tinggi dan jeruk mandarin dataran
rendah. Jeruk mandarin dataran tinggi biasanya tumbuh di daerah yang memiliki
ketinggian diatas 700 m dpl, sedangkan jeruk dataran rendah merupakan jeruk
yang tumbuh di daerah yang memiliki ketinggian antara 1-700 m dpl. Saat ini,
jeruk mandarin dataran tinggi yang masih tetap bertahan adalah mandarin
Takengon di Aceh, mandarin Soe di Nusa Tenggara Timur, dan mandarin
Brastagi di Sumatera Utara. Jeruk mandarin baru mulai berbuah pada umur 3
tahun. Buah dan produktivitas jeruk mandarin akan mencapai titik optimum
setelah berumur di atas 10 tahun (Rahardi, 2004).

Jeruk mandarin memiliki daun berwarna hijau muda pada permukaan bawah
tangkai. Buah jeruk tergolong buah sejati tunggal dan berdaging. Jeruk mandarin
dikenal dengan daging buah berwarna oranye dan kulitnya mudah dikupas.
Rasanya manis atau asam manis. Jumlah bijinya biasanya tidak terlalu banyak.
Warna jeruk masak adalah oranye. Jeruk mandarin disebut juga jeruk keprok.
Buahnya bundar, tidak terlalu licin dan berkulit agak tebal. Kulit berbenjol yang
tidak mudah lepas dan berwarna oranye kekuningan. Buah jeruk ada yang
berbentuk bulat, oval atau lonjong sedikit memanjang (Kanisius, 1994).

7|Page
E. Khasiat Tanaman
Tanaman yang berasal dari Asia tenggara ini sudah banyak di konsumsi
hampir di seluruh dunia sebagai sumber vitamin C, memiliki jumlah folacin,
kalsium, kalium, tiamin, niasin, magnesium yang cukup dan antioksidan alami
yang kuat membangun sistem kekebalan tubuh. Senyawa biologis aktif
mencegah 7 arteriosclerosis, kanker, batu ginjal, radang perut dan penurunan
kadar kolesterol dan darah tinggi yang meningkatkan kesehatan manusia (Robert,
2007). Dimana tanaman ini juga memiliki khasiat sebagai antihipertensi,
antiinflamasi, antikanker, analgesik, antipiretik, antimikroba dan, antidiabetes
(Etebu & Nwauzoma, 2014).

F. Kandungan
Kulit jeruk Citrus reticulata mempunyai berbagai macam senyawa
diantaranya Tangeraxanthin, Tangeritin, Terpinen-4-ol, Terpineolene,
Tetradecanal, Threonine, Thymol, Thymyl- methyl-ether, Tryptophan, Tyrosine,
Cis-3-hexenol, Cis-carveol, Citric-acid, Citronellal, Citronellic-acid, Citronellyl-
acetate, Cystine, Decanal, Decanoic- acid, Decanol, Nobiletin. (Intekhab &
Aslam, 2009).

G. Efek Farmakologi
Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang memiliki dasar kerangka 15-
karbon yang terdiri dari dua cincin benzena yang bergabung oleh tiga rantai
karbon linear, dan dapat direpresentasikan sebagai C6 C3 C6. Flavonoid dari
buah jeruk memiliki senyawa yaitu flavanon dan flavon. Flavanon yang paling
umum ditemukan adalah hesperetin dari buah jeruk dan naringenin dari buah
anggur, sedangkan flavon relatif sering ditemukan adalah tangeritin dan nobiletin
yang terdapat pada kulit jeruk (Whitman et al,, 2004).

8|Page
 Komponen utama flavonoid polimetoksi (PMFs) dalam buah jeruk, memiliki
antikanker, antivirus dan aktivitas anti-peradangan. Sebagai antiinflamasi agen,
nobiletin dapat menghambat degradasi matriks tulang rawan artikular, dan
pembentukan pannus pada osteoartritis dan rheumatoid arthritis dengan secara
efektif menghambat produksi promatrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dan
prostaglandin E2 (PGE) pada fibroblas manusia dengan menurunkan
siklooksigenase-2 secara selektif (COX-2) aktivitas (Lin et al., 2003). Bukti
biologis molekuler menunjukkan bahwa nobiletin menekan ekspresi gen dan
produksi beberapa matrix metallproteinases (MMP-1, MMP-3 dan MMP-9) pada
kelinci artikular kondrosit dan fibroblast blast (Ishiwa et al., 2000). Karya terbaru
dari Ishiwa et al. (2000) juga menunjukkan bahwa proMMP-1 dan proMMP-3
juga dihambat oleh nobiletin, sedangkan MMP endogen inhibitor TIMP-1
diregulasi. Ekspresi gen dari sitokin proinflamasi lainnya, seperti interleukin L-
1α, IL-1β, TNF-α dan IL-6, juga ditemukan diregulasi oleh nobiletin pada
makrofag tikus (Lin et al., 2003). Efek penghambatan pada produksi protein
diinduksi nitric oxide synthase (iNOS) diamati di makrofag tikus (Murakami et
al., 2000). Pengamatan ini menunjukkan bahwa nobiletin mungkin merupakan
antiinflamasi baru dan obat imunomodulator.

Penelitian tentang aktivitas antikanker nobiletin berasal dari aktivitas

anticarcinogenic dan antitumor dari flavonoid jeruk. Dilaporkan bahwa nobiletin
dapat menghambat proliferasi prostat manusia, kulit, payudara dan garis sel
karsinoma usus besar, menghambat produksi beberapa MMP, dan menghambat
proliferasi dan migrasi sel endotel umbilikal manusia.

Baru saja, nobiletin terbukti memiliki antiproliferatif dan efek apoptosis pada
garis sel kanker lambung dan miliki efek mengganggu pada perkembangan siklus
sel. Dalam evaluasi dari 42 flavonoid, nobiletin menunjukkan yang terkuat
aktivitas antiproliferatif terhadap enam sel kanker manusia baris (Yoshimizu et
al., 2004).

9|Page
 Nobiletin juga terbukti menekan produksi PGE dan ekspresi protein COX-2
secara in vitro. COX-2 diinduksi oleh beberapa rangsangan terkait dengan
peradangan yang terlibat dalam karsinogenesis, termasuk tumorigenesis usus
besar manusia dan tikus (Kohno et al., 2001). Selama penyelidikan baru-baru ini,
ditemukan bahwa nobiletin adalah inhibitor ganda dari generasi NO2 dan O2
dalam leukosit, dan menghambat promosi tumor pada tumorigenesis kulit tikus
dua tahap (Murakami et al., 2000).

Bukti kuat menunjukkan bahwa flavonoid jeruk dapat mengurangi produksi

kolesterol hati yang mengandung lipoprotein, sehingga mengurangi konsentrasi
kolesterol total dalam plasma, dan akibatnya mengurangi terjadinya penyakit
kardiovaskular (Kurowska et al., 2004; Wilcox et al., 2001). Hasil terbaru
menunjukkan bahwa nobiletin dapat mengurangi konsentrasi sirkulasi dari
lipoprotein densitas sangat rendah (VLDL) dan lipoprotein densitas rendah
(LDL) dalam darah dan dapat secara langsung menghambat pembentukan sel
busa makrofag yang diturunkan di situs perkembangan lesi di dalam dinding
pembuluh darah (Kurowska dan Manthey, 2004). Karena itu, nobiletin dapat
dicegah atherosclerosis (Whitman et al., 2005). Temuan ini tentang aktivitas
biologis penting nobiletin menunjukkan pentingnya ketersediaannya dalam
jumlah besar, untuk digunakan dalam penelitian efikasi dan metabolisme

H. Struktur Nobiletin

Nobiletin (Li et. al., 2005)

10 | P a g e
I. Cara Isolasi Flavonoid Nobiletin
1. Ektraksi

Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya

dengan menggunakan pelarut selektif sesuai dengan prosedur standar Dalam
proses ektraksi, terjadi penggumpalan ekstrak dalam pelarut yang selanjutnya
terjadi kontak antara bahan dan pelarut sehingga menyebabkan pengendapan
massa dengan cara difusi pada bidang antarmuka bahan ekstraksi dan pelarut
yang digunakan. Tujuan dari ekstraksi adalah untuk memisahkan metabolit
tumbuhan yang dapat larut dan meninggalkan residunya (Azwanida, 2015).

Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan pada kelarutan komponen

terhadap komponen lainnya dalam campuran. Senyawa yang memiliki sifat
polar akan larut ada larutan yang juga memiliki sifat polar, sedangkan
senyawa yang bersifat non-polar akan larut pada pelarut nonpolar. Metode
ekstraksi terdiri atas dua jenis yakni ekstraksi panas dan ekstraksi dingin.
Ekstraksi panas menggunakan cara refluks, destilasi uap, dan sokletasi
sedangkan ekstraksi secara dingin menggunakan cara maserasi,perkolasi..

a. Ekstraksi Secara Panas

a) Ekstraksi Secara Refluks.
Ekstraksi secara refluks adalah cara berkesinambungan dimana cairan
penyari secara kontinyu menyari zat aktif dalam sampel.
b) Ekstraksi Secara Destilasi Uap
Ekstraksi secara destilasi uap adalah cara yang digunakan untuk
menyaring saampel yang mangandung minyak yang mudah menguap
ataumengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih tinggi
padatekanan udara normal.Destilasi merupakan metode ekstraksi

11 | P a g e
 yang memanfaatkan perbedaan titik didih dari senyawa. Biasa
digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri (Hakim,2011).
c) Ekstraksi Secara Soxhletasi
Merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan pemanasan untuk
destilasi pelurut sehingga terjadi sirkulasi pelarut melalui serbuk
simplisia. Metode ini efisiensi dalam pemanfaatan pelarut tetapi
berisiko pembentukan artefak akibat penggunaaan panas. Ekstraksi
secara soxhletasi merupakan carapenyarian sampel
secaraberkesinambungan, cairan penyari dipanaskan sehingga
menguap, uapcairan penyari terkondensasi menjadi molekul-molekul
cairan oleh pendingin balik dan turun menyari sampel di dalam
klonson dan selanjutnya masuk kembali ke dalam labu alas bulat
setelah melewati pipa siphon.

b. Ekstraksi Secara Dingin

a) Ekstraksi Secara Maserasi
Istilah maserasi berasal dari bahasa latin macerare yang artinya
mengairi, melunakkan dan merupakan cara ekstraksi yang paling
sederhana (Pratiwi, 2010). Maserasi adalah proses ekstraksi dengan
cara perendaman sampel pelarut organik pada suhu ruangan.
Maserasi merupakan teknik yang awalnya digunakan dalam
pembuatan minuman wine dan saat ini telah
diadaptasi untuk digunakan pada penelitian senyawa akftif pada
tanaman (Azwanida, 2015). Proses ini sangat berguna untuk isolasi
senyawa bahan alam karena melalui perendaman sampel
tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding sel dan membran sel yang
disebabkan oleh perbedaan tekanan di daerah luar dan dalam sel
sehingga metabolit sekunder yang ada pada sitoplasma akan terlarut

12 | P a g e
 dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena
dapat diatur lama perendaman yang akan dilakukan.

b) Ekstraksi Secara Perkolasi

Perkolasi adalah suatu cara penarikan dengan memakai alat
yang yang disebut perkolator, dimana simplisia terendam dalam
cairan penyari sehingga zat-zatnya terlarut dan larutan tersebut akan
menetes secara beraturan keluar sampai memenuhi syarat-syarat yang
telah ditetapkan. Ekstraksi secara perkolasi merupakan cara
penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui
serbuk sampel yang telah dibasahi.

2. Kromatografi
Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan
tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase
yaitu fasa tetap (stationary) dan fasa gerak (mobile), pemisahan tergantung
pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut. Kromatografi secara garis besar
dapat dibedakan menjadi kromatografi kolom dankromatografi planar.
Kromatografi kolom terdiri atas kromatografi gas dan kromatografi cair,
sedangkan kromatografi planar terdiri ataskromatografi lapis tipis dan
kromatografi kertas (Hostettemann,1995).

13 | P a g e
 BAB III

PROSEDUR KERJA

A. Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
 HPLC (Waters Delta Prep4000 delivery pump, Milford, MA, USA)
 NMR (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA).
 Flash Column System (model Foxy 200, sg100, ISCO Inc., Lincoln, NE,
USA)
 UV–vis detector (Waters 486 tunable absorbance detector, USA) Injector
(Waters U6K injector, Milford, MA, USA)
 Regis Welk-O 1 R,R 450 gram column (Regis Technologies Inc., Morton
Grove, IL, USA)
 kloroform deuterated (CDCl3).
 KLT
3.1.2 Bahan
 Ekstrak kulit jeruk manis (OPE) diperoleh dari Florida Flavours,
Lakeland, FL, USA.
 Etanol absolut
 Heksana
 Etil asetat
 Metilen klorida

B. Prosedur Kerja
a. Sistem kolom flash.

Sistem kromatografi abu otomatis (model Foxy 200, sg100, ISCO Inc.,
Lincoln, NE, USA) dilengkapi dengan 330 g silika gel prepacked (ukuran

14 | P a g e
 partikel 35-60 m) kolom api dari ISCO Inc. digunakan. Fase gerak untuk
kolom fasa normal terdiri dari etil asetat dan heksana atau isopropanol dan
heksana dalam proporsi yang bervariasi dan laju aliran ditetapkan pada 90 mL
/ menit. Eluen dipantau dengan detektor UV saluran tunggal pada panjang
gelombang 254 nm.

b. Sistem HPLC.

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) yang dilengkapi dengan

pompa(Waters Delta Prep4000 delivery pump, Milford, MA, USA) , detektor
UV-vis (Waters 486 tunable absorbance detector, USA) dan injektor (Waters
U6K injector, Milford, MA, USA) digunakan. Kolom Regis Welk-O 1 R, R
450 gram (Regis Technologies Inc., Morton Grove, IL, USA) digunakan
untuk sistem HPLC. Fase gerak untuk sistem HPLC adalah 35% etanol
absolut dan 65% heksana dengan laju aliran ditetapkan pada 85 mL / menit.
Eluen terdeteksi dengan panjang gelombang UV pada 326 nm.

c. Instrumen NMR.

Spektrum NMR direkam pada Varian 300 Spectrometer (Varian Inc.,

Palo Alto, CA, USA). 1H NMR dan 13C NMR direkam pada 75 MHz dengan
TMS berfungsi sebagai standar internal.

d. Prosedur pemisahan OPE mentah.

Campuran OPE mentah (10 g) dilarutkan dalam campuran metilen

klorida (2 mL) dan heksana (2 mL) dan dimuat ke kolom kolom silika gel
silika yang telah dikondisikan (ukuran 330 g). Gradien dimulai dengan 10%
etil asetat dan 90% heksana dan pergi ke 40% etil asetat dan 60% heksana

15 | P a g e
 dalam 35 menit. Kemudian fase seluler isokratis diterapkan selama 15 menit.
Fraksi yang memiliki absorbansi UV pada 254 nm dianalisis pada
kromatografi lapis tipis (KLT) dengan sistem pelarut 40% etil asetat dan 60%
heksana. Fraksi yang mengandung nobiletin yang dianalisis dengan LC / MS
digabungkan dan dipusatkan dalam vakum. Residu yang dihasilkan dilarutkan
dalam campuran etanol absolut (50%) dan heksana (50%) dan dimuat ke
dalam sistem HPLC. Pemisahan itu selesai menggunakan metode isokratik
35% etanol dan 65% heksana selama 40 menit. Nobiletin yang diisolasi
dikeringkan dan NMR diambil dalam kloroform deuterated (CDCl3).

16 | P a g e
 BAB IV

PEMBAHASAN
Dilaporkan oleh Yu et al. (2004) bahwa ada lebih dari tujuh flavonoid
polimetoksilasi dalam OPE. Dalam penelitian kami, OPE mentah awalnya dipisahkan
ke beberapa subkelompok menggunakan kromatografi fase-normal. Fraksi nobiletin
mentah (subkelompok kaya-nobiletin) selanjutnya dimurnikan dengan menggunakan
berbagai pemisahan teknik. Di antara metode pemisahan yang kami coba, kolom
Regis Welk-O 1 memberikan hasil pemisahan terbaik dan paling efisien. Dari struktur
kimia nobiletin dan 5,6,7,4′-tetramethoxyflavone (Fig. 1), kita dapat melihat bahwa
nobiletin memiliki dua kelompok metoksi tambahan, satu di posisi 3 ′ dari cincin-B
dan yang lain di posisi 8 dari cincin-A. Jelas bahwa mereka memiliki sifat fisik yang
sangat mirip, seperti polaritas yang sama dan afinitas yang mirip dengan permukaan
gel silika dan ikatan hidrokarbon dari bahan C-18.

Figure 1. Structures of nobiletin and 5,6,7,4¢- tetramethoxyflavon

A. Pemisahan Pada Kromatografi Silika Gel

Dalam pemisahan fase normal dengan kromatografi silika gel, kami
bereksperimen dengan berbagai sistem pelarut dan metode gradien yang berbeda.
Dengan kolom yang lebih besar (330 g kolom silika gel) dan jumlah sampel kecil
(kurang dari 200 mg sampel nobiletin mentah), sistem isokratik etil asetat (35%) dan
heksana (65%) memberikan hasil terbaik dalam hal pemisahan. Sistem pelarut lain
yang memberikan pemisahan yang masuk akal adalah 15% isopropanol dan 85%

17 | P a g e
 heksana. Namun, setiap upaya untuk meningkatkan jumlah pemuatan bahan nobiletin
mentah dengan kondisi pemisahan yang dioptimalkan sebelumnya menghasilkan
resolusi yang buruk dan sebagai hasilnya memperoleh nobiletin yang kurang murni.
Banyak siklus pemurnian harus diulang untuk mendapatkan jumlah 780 mg nobiletin
murni untuk metabolisme dan antiinflamasi in vivo pada tikus. Strategi pemisahan ini
sangat melelahkan dan menghabiskan banyak waktu dengan konsumsi tinggi pelarut
organik dan kolom serpihan gel silika. Oleh karena itu, tidak praktis untuk
menggunakan pemisahan kromatografi silika gel untuk memenuhi kebutuhan jumlah
besar untuk studi in vivo dan metabolisme (Yu, 2004). Dengan kata lain, interaksi
permukaan gel silika dengan nobiletin dan dengan 5,6,7,4′-tetramethoxy flvone sulit
dibedakan.

B. Pemisahan pada sistem HPLC fase balik C18

Studi tentang pemurnian nobiletin dilakukan dengan Pemisahan pada
kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik C18 (HPLC). Hasil yang sama seperti
dengan pemisahan silika gel diperoleh, yang berarti bahwa nobiletin dan 5,6,7,4′-
tetramethoxy flavone dapat dipisahkan ketika hanya 10 mg atau kurang nobiletin
mentah dimuat ke sistem HPLC semi-prep (kolom YMC HPLC kolom , Id 75 × 30
mm, ukuran partikel 5–10 µm). Namun demikian, disimpulkan bahwa kedua flavon
polimetoksi ini tidak dapat dipisahkan dari material pemuatan yang lebih tinggi
sebagai hasil penyaringan berbagai sistem pelarut dan laju aliran yang optimal.
Dengan kata lain, pemisahan HPLC fase balik lebih buruk daripada kromatografi
silika gel. Sekali lagi, banyak siklus pemurnian akan diperlukan untuk mengisolasi
nobiletin dalam jumlah gram untuk memenuhi kebutuhan penelitian invivo tentang
nobiletin.

C. Pemisahan pada kolom kiral Welk-O

Selama pencarian metode pemisahan yang tepat yang berlaku untuk isolasi
nobiletin skala besar, sebuah penelitian dilakukan dengan membandingkan kolom
yang berbeda, terutama permukaan ikatannya, termasuk kolom fase terbalik C18 dan

18 | P a g e
C8, diol yang dibatasi gel silika, kolom cyano dan amino, dan stationaryphases kiral
tipe-Pirkle.

Figure 2. Stationary phase of Whelk-O 1 column.

Ditemukan bahwa fase diam Whelk-O (Fig. 2) memiliki fitur unik dalam
hal pengikatannya dengan flavonoid polymethoxylated. Oleh karena itu, dalam
metode yang dikembangkan, sejumlah kecil (kurang dari 50 mg) nobiletin mentah,
terutama campuran nobiletin dan 5,6,7,4′-tetramethoxy flvone, dimuat ke kolom
Whelk-O 1 (Whelk-O 1 R, R 35 gram kolom). Sistem pelarut, termasuk metanol-
heksana, diklorometana-heksana, isopropanol-heksana dan etanol – heksana,
memberikan pemisahan yang memuaskan sehingga menghasilkan pemisahan dasar
minimum. Fase gerak yang menghasilkan pemisahan optimal adalah 35% etanol
absolut dan 65% heksana. Dengan menggunakan metode ini, 140 mg campuran
mentah dimasukkan ke dalam kolom yang sama dan 104 mg nobiletin murni
diperoleh.

Tidak ada fraksi yang tumpang tindih atau terkontaminasi silang yang
ditemukan dalam pemisahan ini. Akibatnya, kondisi pemisahan ini diterapkan pada
pemisahan skala besar. Jadi, 3,54 g campuran nobiletin mentah dimasukkan ke kolom
Whek-O besar (Regis Welk-O 1 R, R 450 gram kolom). Di bawah kondisi yang sama
dijelaskan di atas (35% etanol, 65% heksana, laju aliran 90 mL / menit), dalam waktu
45 menit, 2,48 g nobiletin murni diperoleh, bersama dengan 0,85 g murni 5,6,7,4
′tetramethoxy flavone . Ada 40 mL tumpang tindih mengelusi fraksi yang dikeluarkan
dari penggabungan dengan fraksi nobiletin murni atau 5,6,7,4 ,7etrametoksi murni.

19 | P a g e
 Struktur dari dua flavon polimetoksi yang dimurnikan dikonfirmasikan oleh LC / MS
dan H NMR, yang juga menunjukkan bahwa skor kemurnian kedua senyawa berada
di atas 99%. Pemulihan keseluruhan nobiletin dari batch OPE ini adalah 25%.

Jejak absorbansi UV dari pemisahan HPLC ini adalah ditunjukkan pada Figure. 3.

Figure 3. Absorbansi UV dari pemisahan HPLC dengan kolom kiral

Whelk-O 1.

D. Interaksi antara kelompok fungsional utama Whelk-O dan PMFs

Fase diam kiral Whelk-O, berdasarkan pada 1 (3,5dinitrobenzamido) -
1,2,3,4-tetrahydrophenanthrene, adalah fase penerima π-elektron / fase donor
electron-elektron (Fig. 2). Secara khusus, sistem 3,5 3,5-dinitrobenzamide berfungsi
sebagai akseptor electron-elektron karena efek penarikan elektron yang kuat dari dua
kelompok nitro (Pirkle dan Welch, 1994), sedangkan sistem 1,2,3,4
tetrahydrophenanthrene π bertindak sebagai π-elektron donor dalam banyak kasus.

20 | P a g e
Selain itu, hidrogen pada nitrogen amida adalah donor hidrogen khas dalam
membentuk ikatan hidrogen. Dalam sistem flavonoid polimetoksilasi, cincin-A yang
kaya-elektron bertindak sebagai donor electron-elektron karena sifat pemberian-
elektron yang kuat dari gugus metoksi. Dengan demikian kekuatan interaksi π-face
tatap muka terbentuk antara donor π-elektron dari sistem A-ring flavonoid-A dan
akseptor π-elektron dari sistem 3,5 3,5-dinitrobenzamide π.

Bersamaan dengan itu, interaksi π-π tatap muka terbentuk antara sistem rah
tetrahidrophenanthrene yang dapat disimpulkan, tingkat interaksi tatap muka yang
berbeda antara sistem rah tetrahydrophenanthrene dan sistem analit yang berbeda
merupakan dasar untuk membedakan sangat mirip. molekul seperti nobiletin dan
5,6,7,4′tetramethoxy flvone dalam penelitian ini. Fungsi dari interaksi ikatan hidrogen
antara oksigen karbonil dari PMF dan hidrogen amida tidak diketahui saat ini dalam
mengenali PMF yang berbeda. Penelitian ini menunjukkan bahwa, dibandingkan
dengan 5,6,7,4′tetramethoxy flvone, ada interaksi yang lebih kuat disebabkan oleh
kelompok metoksi ekstra pada nobiletin Bring, baik melalui interaksi π-π tatap muka
antara sistem tetrahidrophenanthrene fase diam dan sistem and pada nobiletin
Membawa atau melalui ikatan hidrogen yang lebih kuat

21 | P a g e
 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan
Jeruk mandarin (Citrus reticulata) terbukti mengandung senyawa
flavonoid. Kulit jeruk mandarin (Citrus reticulata) mengandung senyawa
nobiletin. Nobiletin memiliki aktivitas antikanker, antivirus, dan antiinflamasi.
Nobiletin juga terbukti menekan produksi PGE dan ekspresi protein COX-2
secara in vitro. COX-2 diinduksi oleh beberapa rangsangan terkait dengan
peradangan yang terlibat dalam karsinogenesis, termasuk tumorigenesis usus
besar manusia dan tikus. Nobiletin merupakan inhibitor ganda dari generasi NO2
dan O2 dalam leukosit, dan menghambat promosi tumor pada tumorigenesis kulit
tikus dua tahap .

Jumlah gram dapat dicapai dengan menggunakan kolom kiral Whelk-O

pada sistem HPLC dengan fase gerak sederhana yang mengandung alkohol dan
heksana, seperti etanol absolut (35%) dan heksana (65%). Dalam pemisahan
nobiletin, kromatografi fase-normal silika gel dan kromatografi cair kinerja
tinggi fase-balik C18 dapat digunakan, tetapi mereka terbatas pada isolasi skala
miligram. Penerapan kolom Whelk-O untuk pemisahan flavon polimetoksi
sangat efisien dibandingkan dengan hasil yang diperoleh dari fase normal dan
pemisahan reversefase. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengembangkan
metodologi sistematis untuk digunakan dalam pemisahan yang lebih sulit ditemui
dalam fase normal dan fase sebaliknya menggunakan kolom kiral, seperti Whelk-
O kolom. Eksplorasi lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme
interaksi antara Whelk-O stasioner fase dan flavinoid polimetoksilasi.

22 | P a g e
 DAFTAR PUSTAKA

AAK. 2006. Budidaya Tanaman Jeruk. Yogyakarta: Kanisius.

Ashari, 1995. Hortikultura Aspek Budidaya. Buku. Penerbit Universitas Indonesia.

Jakarta. 141--146 p.
Azwanida, N. N. 2015. A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants,
Principle, Strength and Limitation. Medicinal & Aromatic Plants.

Etebu, E. and Nwauzoma, A. B. 2014. A Review on Sweet Orange (Citrus sinensis L.

Osbeck): Health, Diseas and Management. American Journal of Research
Communication. 2(2): 33- 70

Hakim,Alifman. 2011. Keanekaragaman metabolit sekunder Genus Artocarpus

(Moraceae). 8 (2):86-90
Handa, S. S., Khanuja, S. P. S., Longo, G. and Rakesh, D. D. 2008. Extraction
Technologies for Medicinal and Aromatic Plants, (1stedn), no. 66. Italy: United
Nations Industrial Development Organization and the International Centre for
Science and High Technology.

Hostettemann, K., Hostettemann, M., Maston, A., 1995. Cara Kromatografi

Preparatif, Bandung : Institut Teknologi Bandung

Intekhab, J., Aslam, M. 2009. Isolation of Flavonoid from the Roots of

Citrus sinensis. Malaysian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2009; 7(1):
1–8.
Ishiwa J, Sato T, Mimaki Y, Sashida Y, Yano M and Ito A. A citrus
2000; 27: 20.

Kanisius, A. A. 1994. Budidaya Tanaman Jeruk. Yogyakarta: Kanisius.

23 | P a g e
Kohno H, Yoshitani S, Tsukio Y, Murakami A, Koshimizu K, Yano M,
Tokuda H, Nihshino H, Ohigashi H and Tanaka T. Dietary
administration of citrus nobiletin inhibits azoxymethane- induced
colonic aberrant crypt foci in rats. Life Science 2001; 69: 901.

Kurowska EM and Manthey JA. Hypolipidemic effects and adsorption of

citrus polymethoxyated flavones in hamster with diet-induced
hypercholesterolemia Journal of Agriculture and Food Chemistry 2004;
52: 2879.

Kurowska EM, Manthey JA, Casaschi A and Theriault AG. Modulation of

HepG2 cell net apolipoprotein B secretion by the citrus
polymethoxyflavone, tangeretin. Lipids 2004; 39: 143.

Li S and Ho CT. Polymethoxyflavonoids in sweet orange peel: Isolation and in

vivo transformation study. Abstracts of Papers, 229th ACS National
Meeting, San Diego, CA, 13–17 March 2005, AGFD-028.

Lin N, Sato T, Tkayama Y, Mimaki Y, Sashida Y, Yano M and Ito A.

Novel anti-inflammatory actions of nobiletin, a citrus polymethoxy
flavonoid, on human synovial fibroblasts and mouse macrophages.
Biochemcial Pharmacology 2003; 65: 2065.

Murakami A, Nakamura Y, Torikai K, Tanaka T, Koshiba T, Koshimizu K,

Kuwahara S, Takahashi Y, Ogawa K, Yano M, Tokuda H, Nishino H,
Mimaki Y, Sashida Y, Kitanaka S and Ohigashi H. Inhibitory effect of
citrus nobiletin on phorbol ester- induced skin inflammation, oxidative
stress, and tumor promotion in mice. Cancer Research 2000; 60: 5059.

Nogata, Y., Sakamoto, K., Shiratsuci, H., Ishii, T., Yano, M and Ohta, H., 2006,
Flavonoid Composition of Fruit Tissues of Citrus Species, Biosci.
Biotechnol.Biochem, 70(1): 178-192.

24 | P a g e
Pan, M. H., Chen, W. J., Shiau, S. Y. L., Ho, C. T., and Lin, J. K.(2002). ‘Tangeretin
Induced Cell Cycle G1 Arrest through Inhibiting Cyclin Dependent Kinases 2
and 4 Activities as well as Elevating Cdk Inhibitor p21 and p27 in Human
Colorectal Carcinoma Cell’, Carcinogenesis, 23 (10): 1677-1684.

Pirkle WH and Welch CJ. Use of simultaneous face to face and face to edge
p–p interactions to facilitate chiral recognition. Tetrahe- dron:
Asymmetry 1994; 5: 777.

Rahardi, F. 2004. Jeruk Manis: Varietas, Budidaya, dan Pascapanen. Cetakan 11.
Jakarta: Penebar Swadaya.
Whitman SC, Kurowska EM, Manthey JA and Daugherty A. Nobiletin, a
citrus flavonoid isolated from tangerines, selectively inhibits class A
scavenger receptor-mediated metabolism of acetylated LDL by mouse
macrophages. Atherosclerosis 2005; 178: 25.

Wilcox LJ, Borradaile NM, de Dreu LE and Huff MW. Secretion of

hepatocyte apoB is inhibited by the flavonoids, naringenin and
hesperetin, via reduced activity and expression of ACAT2 and MTP.
Journal of Lipid Research 2001; 42: 725.

Yoshimizu N, Otani Y, Saikawa Y, Kubota T, Yoshida M, Furukawa T,

Kumwi K, Kameyama K, Fujii M, Yano M, Sato T, Ito A and Kitajima
M. Anti-tumor effects of nobiletin, a citrus flavonoid, on gastric cancer
include: antiproliferative effects, induc- tion of apoptosis and cell cycle
deregulation. Aliment Pharmacol- ogy Therapy 2004; 20: 95.
Yu H, Robert RT and Ho CT. Anti-inflammatory activity of
polymethoxyflavones in sweet orange (Citrus sinensis) peel and
metabolites study of nobiletin. Abstracts of Papers, 227th ACS Na-
tional Meeting, Anaheim, CA, 28 March–1 April 2004; AGFD-025.
Yu H. Anti-inflammatory constitute in noni (Morinda citrifolia) fruits, sweet
orange (Citrus sinensis) peel, and biotransformation pathway of
nobiletin. Dissertation, Rutgers University, New Brunswick, NJ, 2004.

25 | P a g e
Zahara, F. 2002. Pengaruh Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Pembentukan dan
Pengakaran Tunas Mikro Pada Citrus nobilis secara In Vitro. Kultura 37(2):
22-25

26 | P a g e