Perbandingan Metode Formulasi untuk Menghasilkan NanoChitosan sebagai Agen

Penghambat untuk Pertumbuhan Bakteri

Abstrak
Abstrak. Kitosan dikenal sebagai agen antibakteri. Rasio luas permukaan efektif kitosan
dapat ditingkatkan dengan modifikasi menjadi partikel nano. Nanochitosan dapat dibuat
dengan beberapa metode sederhana, yaitu presipitasi, gelasi ionik, atau metode kompleks
polielektrolit. Studi ini membandingkan tiga metode ini dalam hal karakteristik produk yang
ditargetkan, yaitu stabilitas ukuran nanopartikel rata-rata serta dispersi koloid, dan
karakteristik antibakteri. Ketiga metode menghasilkan pembentukan nanopartikel, tetapi
dalam metode presipitasi pengurangan potensi zeta signifikan diamati karena adanya ion
negatif dari alkali yang menetralkan kelompok amina kitosan. Metode gelasi ion
menghasilkan potensi zeta yang lebih tinggi dan penghambatan pertumbuhan bakteri yang
lebih tinggi daripada yang dihasilkan oleh metode kompleks polyelectrolyte. Gelasi ionik dan
metode kompleks polielektrolit menghasilkan stabilitas dispersi koloid yang jauh lebih baik
daripada metode presipitasi, di mana peningkatan ukuran partikel yang signifikan diamati
setelah satu minggu penyimpanan. Hasil ini menunjukkan bahwa baik gelasi ionik dan
metode kompleks polielektrolit dapat digunakan untuk membentuk nano-kitosan untuk tujuan
pengawetan makanan. Namun, untuk produk perikanan disarankan untuk menggunakan
metode kompleks polyelectrolyte karena TPP yang biasanya digunakan dalam gelasi ionik
tidak diperbolehkan diterapkan pada ikan.

Pendahuluan
Perhatian terhadap formulasi dan aplikasi nanopartikel telah berkembang pesat selama
dekade terakhir. Nano-kitosan adalah bahan partikel nano yang memiliki potensi tinggi untuk
digunakan sebagai pengawet makanan. Nano-kitosan adalah transformasi kitosan menjadi
ukuran partikel nano. Chitosan sendiri adalah biopolimer yang aman, tidak beracun dan
ramah lingkungan [1]. Perubahan ukuran partikel kitosan tidak mengubah sifat-sifat kitosan
yang disebutkan sebelumnya dalam [2,3], tetapi memang mengubah sifat-sifat antibakteri [4].
Nano-kitosan telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri yang lebih baik daripada larutan
kitosan [5]. Ini mendorong aplikasi nano-chitosan sebagai pengawet makanan. Beberapa studi
tentang aplikasi nanochitosan untuk produk perikanan telah dilakukan, termasuk aplikasi
pada fillet ikan mas perak [6], udang kaki putih [7] dan jari-jari ikan [8], di mana dampak
positif penggunaan nano-chitosan pada perluasan kehidupan rak produk diamati.
Menggunakan proses bottom-up adalah pendekatan umum membangun nano-kitosan
karena molekul kitosan terlarut mampu berkumpul sendiri di hadapan pengikat silang [9].
Dalam asam asetat encer ke kitosan, kitosan menjadi larut dan terprotonasi. Protonasi
menyebabkan ukuran partikel yang sangat besar dalam kitosan karena adanya tolakan
elektrostatik [10]. Pengurangan ukuran partikel adalah strategi untuk mengoptimalkan
aktivitas kitosan karena meningkatnya daya muatan positif terkonsentrasi dan pembesaran
area permukaan kontak. Proses bottom-up seperti modifikasi ukuran dapat dilakukan dengan
menggunakan presipitasi [11], gelasi ion [12,13] atau metode kompleks polielektrolit [14].
Ketiga metode ini banyak digunakan karena sederhana dan murah. Perbedaan antara tiga
metode terletak pada bahan kimia yang digunakan untuk mengubah kitosan terlarut menjadi
partikel berukuran nano. Metode presipitasi menggunakan sifat fisikokimia spesifik kitosan,
yaitu ketidaklarutannya dalam larutan alkali. Dalam penerapan metode ini, larutan kitosan
dicampur dengan NaOH atau senyawa alkali lainnya untuk membuatnya diendapkan [11]. Di
sisi lain, gelasi ionik dan metode kompleks polielektrolit mengubah kitosan menjadi nano-
kitosan dengan menciptakan ikatan silang antara gugus amina dari polimer kitosan. Pengikat
silang dapat berupa molekul mikro anionik (seperti tripolifosfat) atau molekul anionik
makro (oligosakarida seperti gum Arab).
Pembentukan partikel nano-kitosan dipengaruhi oleh karakteristik larutan (pH,
suhu, rasio kitosan dan crosslinker, dan konsentrasi awal kitosan) dan oleh adanya molekul
lain yang mampu menyumbangkan muatan molekulnya [12,16,17 ] Pemanfaatan NaOH
mempengaruhi nilai pH, sementara TPP dan Gum Arab dipisahkan ketika dilarutkan dalam
air pada pH netral [14,18] sehingga masing-masing pengaruh ini berkontribusi terhadap
nanochitosan dengan karakteristik yang berbeda. Penggantian TPP sebagai crosslinker
dalam sintesis nano-kitosan diperlukan karena TPP dikenal untuk memanipulasi berat
ikan karena retensi air [19]. Sejauh ini, karakteristik nanochitosan yang dibuat
menggunakan metode tersebut belum mapan. Penelitian ini bertujuan untuk mengungkap
kelebihan dan kekurangan dari masing-masing metode untuk menemukan metode yang
paling tepat untuk menghasilkan nano kitosan sebelum diterapkan untuk pengawetan
makanan, terutama produk perikanan, yang sangat mudah rusak karena kandungan gizinya
yang tinggi.

Material dan Metode

Material
Bahan yang digunakan untuk persiapan nano-kitosan adalah bubuk kitosan (Bio
Chitosan Indonesia), asam asetat (glasial, Ajax Finechem Pty. Ltd.), natrium hidroksida
(Merck), tripolifosfat / TPP (Sigma Aldrich), gum Arab (pasar lokal) dan air MiliQ
(diperoleh dengan menggunakan peralatan yang dibuat oleh Millipore Corporation).
Penghambatan pertumbuhan bakteri diuji dengan menggunakan 4 strain bakteri, yaitu
Bacillus subtilis (dari koleksi kultur Laboratorium Kualitas dan Produk Perikanan, UGM),
Staphylococcus aureus (FNCC 0047), Escherichia coli (FNCC 0091), dan Vibrio
parahaemolyticus (JCM 2147) ). Media selektif, yaitu Agar MRS (agar-agar manusia, Rogosa
dan Sharpe agar dari Merck), MSA (Agar Garam Mannitol dari Oksoid), agar-agar EMB
(agar-agar Eosin Methylene Blue dari Oxoid) dan agar-agar TCBS (Agar Thiosulfate Citrate
Bile Salt Sukrose dari Merck), digunakan untuk menumbuhkan bakteri untuk menguji
aktivitas antimikroba dari nano-chitosa.
Metode
1. Persiapan Nano-kitosan Menggunakan Metode Presipitasi, Gelasi Ionik dan
Kompleks Polielektrolit.
Kitosan (0,08%, m / v) dilarutkan ke dalam 100 ml larutan asam asetat encer
encer (1%, v / v) dan kemudian dicampur menggunakan pengaduk magnetik selama 2
jam untuk mendapatkan larutan kitosan.
Langkah selanjutnya adalah memodifikasi ukuran partikel menggunakan tiga
metode. Metode pertama adalah metode presipitasi, menggunakan larutan NaOH
encer (dengan konsentrasi 0,1 N dan 1 N) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam
larutan kitosan menggunakan pipet sementara larutan terus diaduk. Penambahan basa
dihentikan ketika larutan mencapai nilai pH 6,3 [21]. Metode kedua adalah gelasi
ionik menggunakan larutan TPP (0,84 g / L) sebagai pengikat silang. TPP
ditambahkan ke larutan kitosan dengan rasio volume 5: 2 (kitosan: TPP) dan
dihomogenisasi selama 30 menit [22]. Metode terakhir adalah metode kompleks
polielektrolit, menggunakan langkah dan rasio yang sama seperti metode gelasi
ionik. Satu-satunya perbedaan adalah pada crosslinker yang digunakan, yaitu TPP
digantikan oleh 0,3% (m / v) dari larutan berbahasa Arab [14]. Konsentrasi ini
diperoleh dari penelitian kami sebelumnya pada optimasi rasio Arab-chitosan-karet.
2. Karakterisasi Ukuran Partikel, Potensi Zeta, dan pH Nano-kitosan
The nano-chitosans diproduksi oleh tiga metode masing-masing dalam
penelitian ini dikarakterisasi untuk ukuran partikel dan potensi zeta menggunakan
penganalisa ukuran partikel (Zetasizer Nano ZSP, Malvern). Kedua parameter juga
diukur dalam larutan kitosan untuk perbandingan. Untuk mengevaluasi kontribusi
asam asetat pada aktivitas antibakteri nano-kitosan, potensi zeta dari asam asetat
diamati juga. Nilai pH dianalisis menggunakan Mettler Toledo pHmeter.
3. Aktivitas Nano-kitosan dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri
Semua bakteri ditanam dalam agar selektif, yang disesuaikan dengan jenis
bakteri. Ke agar-agar selektif yang telah dipadatkan dalam cawan petri, 100 μl isolat
bakteri tertentu dituangkan dan kemudian diratakan menggunakan spatula Drigalsky.
Setelah pengeringan, piringan kertas berdiameter 5 mm ditempatkan pada agar-agar
selektif, dilanjutkan dengan membasahi cawan kertas dengan 20 μl larutan yang diuji.
Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam. Zona penghambatan
diekspresikan oleh zona bening yang muncul di sekitar disk kertas. Perhitungan zona
hambatan dilakukan dengan menghitung perbedaan antara diameter zona bening dan
diameter cakram kertas.
Hasil dan Pembahasan
1. Perbedaan antara Formulasi Nano-kitosan dalam Hasil Ukuran Partikel
Kitosan memiliki aktivitas multi-sifat karena gugus amina, yang sangat reaktif
dengan molekul lain. Chitosan memiliki banyak ikatan hidrogen di tulang belakang,
yang membuatnya hidrofobik. Asam memproton kelompok amina kitosan dan
mengurangi ikatan hidrogen sehingga kitosan mudah larut dalam air [23]. Protonasi
menghasilkan molekul besar karena gaya tolak muatan positif kitosan, seperti yang
dibuktikan oleh data pada Gambar 1. Netralisasi gugus amina terprotonasi
menyebabkan kitosan menjadi tidak larut dan ini digunakan untuk pembentukan
partikel nano. Namun, dalam larutan pH jauh di atas nilai pKa, gel terbentuk [21].
Penambahan pengikat silang berhasil mengurangi ukuran partikel kitosan. Tidak
ada perbedaan yang signifikan antara tiga metode persiapan nano-kitosan dalam hal
ukuran partikel dan semua metode menghasilkan solusi yang tampak jelas, yang
menunjukkan tidak adanya curah hujan (Gambar 2 (A), 2 (C), dan 2 (D) )). Metode
kompleks gelasi ionik dan polielektrolit memiliki mekanisme pembentukan yang
sama, di mana kerumitan terjadi karena interaksi ionik antara gugus amina terproton
kitosan dan pengikat silang terdisosiasi.
Tripolyphosphate (TPP) terdisosiasi sebagian ketika dilarutkan pada pH netral
[24]. Gugus fosfat yang mengikat gugus amina dengan ikatan ionik mengurangi
tolakan elektrostatik sehingga molekul yang membengkak menjadi lebih kecil. Hal
yang sama juga terjadi di kompleks Arab chitosan-gum. Gum Arabic adalah
polisakarida anionik alami dengan polisakarida bercabang tinggi yang terdiri dari
tulang punggung β- (1-3) galaktosa dengan cabang-cabang terkait asam arabinosa,
rhamnosa, dan asam glukuronat. Gugus karboksil (dari asam glukoronat) bertanggung
jawab atas muatan negatif getah Arab di atas pH 2,2 [25,26]. Asam glukononat
mengikat gugus amina terprotonasi, yang menyebabkan ikatan silang dan penyusutan
molekul.
Konsentrasi NaOH yang digunakan untuk mengendap kitosan mempengaruhi
pembentukan nanopartikel. Tidak ada aglomerasi yang diamati ketika pencampuran
kitosan dengan 0,1 N NaOH (Gambar 2 (A)), sedangkan aplikasi 1 N NaOH
menunjukkan aglomerasi, terlihat sebagai bayangan putih di bagian bawah botol
(Gambar 2 (B)). Tidak ada endapan yang jelas diamati dalam kasus TPP dan gum
Arab (Gambar 2 (C) dan 2 (D), masing-masing). Perubahan visual (aglomerasi) juga
terlihat dalam kitosan-NaOH (0,1 N NaOH) setelah penyimpanan selama satu minggu
pada suhu kamar. Nano-kitosan yang dibuat dengan gelasi ionik dan metode
kompleks polielektrolit menunjukkan stabilitas yang baik selama satu minggu
penyimpanan karena keduanya masih menunjukkan solusi yang jelas. Stabilitas
kitosan-TPP dapat diklasifikasikan sebagai sangat stabil karena masih menunjukkan
kisaran ukuran partikel yang sama dengan larutan segar setelah penyimpanan 3 bulan
pada suhu kamar [22]. Selain itu, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa
menyimpan nanopartikel kitosan-TPP pada 25 ° C menunjukkan stabilitas tinggi
selama 12 bulan, sedangkan penyimpanan pada 40 ° C stabil selama 6 bulan [27].
2. Potensi Zeta dan nilai pH Nano-kitosan Disiapkan dengan
Berbagai Metode
Meskipun nano-chitosan dihasilkan dari tiga metode yang dibahas sebelumnya
tidak menunjukkan perbedaan dalam ukuran partikel, mereka tidak sama sehubungan
dengan nilai potensial zeta. Potensi zeta mewakili potensi elektrostatik dari lapisan
ganda listrik yang mengelilingi partikel nano dalam larutan [28]. Zeta potensial di atas
nilai +30 mV menunjukkan koloid yang stabil, yang mencegah aglomerasi karena
adanya tolakan partikel bermuatan, yang memiliki manfaat untuk penyimpanan [29].
Bukti netralisasi muatan kitosan, dan karenanya penurunan nilai potensial zeta,
diamati dalam metode presipitasi (Gambar 3). Pengurangan potensi zeta juga terjadi
dalam kasus metode ionasi gelasi dan kompleks polielektrolit karena beberapa gugus
amina kitosan digunakan untuk berikatan dengan TPP dan getah Arab. Metode
gelasi ionik menghasilkan potensi zeta yang lebih rendah daripada metode kompleks
polielektrolit. Gum Arabic, ketika dilarutkan pada pH netral, mengalami disosiasi dan
berkontribusi pada muatan negatif dalam larutan. Muatan negatif ini berkurang ketika
getah Arab dicampur dengan larutan kitosan, yang memiliki pH rendah (2,7). Muatan
negatif getah Arab menurun seiring dengan penurunan nilai pH larutan [30] karena
protonasi gugus karboksilat getah Arab [31]. Goncalves et al. [32] telah membuktikan
bahwa pada kondisi asam, potensi zeta negatif getah Arab menurun dari sekitar -20
pada pH 6 menjadi sekitar -10 pada pH 3, dan ini berlanjut seiring dengan penurunan
nilai pH. Oleh karena itu, pengurangan muatan positif kitosan karena akan digunakan
dalam proses pengikatan silang, tidak mempengaruhi potensi zeta dari nano-kitosan
karena kontribusi getah Arab yang diprotonasikan.

3. Efek Nano-kitosan Disiapkan dengan Berbagai Metode dalam

Menghambat Pertumbuhan Bakteri
Dalam kasus ikan yang membusuk, kualitas ikan sebagian besar dipengaruhi oleh
aktivitas bakteri. Meskipun nano-chitosan juga memiliki aktivitas anti-jamur, ini tidak
dibahas dalam makalah ini karena tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk
mempersiapkan agen pengawet ikan dan karenanya pekerjaan difokuskan pada
aktivitas antibakteri. Metode persiapan mempengaruhi kemampuan nano-kitosan
untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Gambar 5 menunjukkan bahwa ukuran
partikel dan potensi zeta kitosan memainkan peran yang saling penting dalam
menghambat pertumbuhan bakteri. Kombinasi ukuran partikel yang lebih kecil dan
potensi zeta yang lebih tinggi menghasilkan aktivitas penghambatan pertumbuhan
bakteri yang optimal, seperti yang ditunjukkan dalam hasil dari metode kompleks
polielektrolit dan metode gelasi ionik. Metode presipitasi menghasilkan aktivitas
antibakteri terendah karena meskipun ukuran partikel yang sama seperti yang
dihasilkan oleh kedua metode lain, potensi zeta dari partikel yang dihasilkan dari
presipitasi adalah yang terendah di antara tiga metode yang diuji dalam penelitian ini.
Dengan nilai potensial zeta yang rendah, penghambatan yang diinduksi oleh
 nanopartikel dari metode presipitasi untuk pertumbuhan E. coli, Staphylococcus
aureus, dan Vibrio parahaemolyticus bahkan lebih rendah daripada efek
penghambatan 1% larutan asam asetat yang digunakan untuk melarutkan kitosan. .
Holappa et al. [33] juga menunjukkan bahwa peningkatan nilai pH di atas 6
menyebabkan penurunan aktivitas nano-kitosan dalam menghambat pertumbuhan
bakteri karena netralisasi biaya nano-kitosan seperti ditunjukkan oleh penurunan
potensial zeta. Metode gelasi ionik menunjukkan stabilitas yang baik dan efek
positif pada pengawetan makanan [6-8] tetapi ada kendala untuk penerapannya pada
produk perikanan karena mengarah pada retensi air, menghasilkan kecenderungan
untuk memanipulasi berat produk [33]. Kekurangan gelasi ionik nano-kitosan
dengan TPP ini dianggap tidak jujur bagi konsumen dan karenanya penerapannya
pada produk ikan harus dihindari, meskipun tidak ada masalah toksisitas. Sebaliknya,
aplikasi chitosan-Gum Arabic yang kompleks disarankan untuk aplikasi pada
produk perikanan. Penerapan kompleks Arab chitosan-gum sejauh ini lebih
diarahkan pada pengembangan rekayasa jaringan, pemberian obat [34] dan tujuan
lain. Hanya informasi yang sangat terbatas untuk aplikasi dalam pengawetan makanan
tersedia. Mengingat potensi yang ditunjukkan oleh penelitian ini, mekanisme
pembentukan nanopartikel kompleks Arab-kitosan-gusi dan penerapannya sebagai
bahan pengawet makanan perlu diselidiki lebih lanjut.

Kesimpulan
Metode persiapan nano-kitosan mempengaruhi ukuran partikel nanochitosan yang dihasilkan
dan kemampuannya untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Metode alkalipresipitasi
dianggap tidak tepat untuk memformulasikan nano-kitosan sebagai pengawet makanan
karena meskipun menghasilkan ukuran partikel yang kecil, metode ini juga mengurangi
potensi zeta karena efek netralisasi. Partikel yang dihasilkan juga menunjukkan
kecenderungan aglomerasi yang lebih tinggi, yang membuatnya tidak stabil selama
penyimpanan. Baik metode gelasi ionik (menggunakan TPP sebagai pengikat silang)
maupun metode kompleks polielektrolit (menggunakan pengikat gum Arab sebagai
pengikat silang) menghasilkan kisaran ukuran partikel nano-kitosan yang diharapkan,
menunjukkan stabilitas ukuran yang baik selama penyimpanan, dan menunjukkan aktivitas
penghambatan bakteri yang tinggi. Di antara kedua metode tersebut, metode kompleks
polielektrolit menyebabkan aktivitas penghambatan tertinggi. Ini menunjukkan potensi tinggi
dari metode kompleks polyelectrolyte untuk aplikasi sebagai bahan pengawet makanan alami
dan terjangkau. Namun, penelitian ini hanya dimaksudkan sebagai studi awal untuk
mengeksplorasi potensi dari tiga metode dan konsekuensi dari masing-masing metode.
Metode kompleks polielektrolit perlu diselidiki lebih lanjut dalam kaitannya dengan berbagai
aspek pengawetan makanan, terutama yang berkaitan dengan produk perikanan, sehingga
potensi getah Arab untuk digunakan sebagai pengikat silang alternatif untuk menggantikan
TPP, yang dilarang di industri perikanan, dapat dievaluasi.