JURNAL PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS INSTRUMEN

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Oleh:

SAVIRA AYU NINGTIAS

17030234015

UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN KIMIA
PRODI KIMIA
2020
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul
berdasarkan perbedaan polapergerakan antara fase gerak dan fase diam
untuk memisahkan komponen (berupa molekul)yang berada pada larutan.
HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknikkromatografi
dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan ataupadat. Banyak
kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metodelainnya yaitu
mampu memisahkan molekul-molekul dari suatucampuran, mudah
melaksanakannya, kecepatan analisis dankepekaan yang tinggi, dapat
dihindari terjadinya dekomposisi /kerusakan bahan yang dianalisis.
Prinsip dasar dari HPLC adalah teknik pemisahan komponen
yang berdasarkan perbedaan distribusi sampel pada kolom, dengan
memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat
ditingkatkan dengan besar (Veronika,1999).
HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri.
Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu
HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-
golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi
komponen-komponennya.
Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaansuatu
unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun inorganik,sedangkan
analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlahsuatu unsur atau
senyawa dalam suatu cuplikan.
Pada praktikum kali ini dilakukan uji instrumentasi
penetapankadar dari suatu sediaan obat dengan mengunakan aplikasi
HPLC(High Performance Liquid Cromatograpy). Untuk melihat
keefektivanpengunaan alat ini secara analisis kualitatif maupun kuantitatif.
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1 Bagaimana cara analisis sampel dengan menggunakan HPLC?
 2.2.1 Bagaimana cara menentukan konsentrasi sampel menggunakan
HPLC?
1.3 Tujuan
1.3.1 Mengetahui cara analisis sampel menggunakan HPLC
1.3.2 Mengetahui penentuan konsentrasi sampel menggunakan HPLC
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran
berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium
tertentu. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi
komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan
perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan (Veronika, 1999).
Pada dasarnya HPLC merupakan perkembangan dari metode
kromatografi kolom. HPLC mengizinkan penggunaan pertikel dengan
ukuran yang sangat kecil dengan luas permukaan yang lebih besar
sehingga interaksi akan semakin besar. Hal ini akan membuat sistem
pemisahan akan semakin baik (Hendayana, 2006).
Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan salah satu teknik
kromatografi yang menggunakan cairan sebagai fase geraknya. Pemisahan
terjadi dengan adanya interaksi antara fase gerak dan fase diam. Interaksi
yang terjadi dapat berupa adsorpsi padat-cair, partisi cair-cair, penukar ion,
maupun eksklusi ukuran (Harvey, 2000).
HPLC merupakan kondisi kromatografi yang fase geraknya
dialirkan menuju kolom secara cepat dengan bantuan tekanan dari pompa
dan hasilnya dapat dideteksi dengan detektor. Tujuan dari HPLC adalah
memperoleh hasil pemisahan yang baik dalam waktu relatif singkat
(Mulja, 1995).
2.2 Prinsip HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Prinsip dasar dari HPLC adalah teknik pemisahan komponen
yang berdasarkan perbedaan distribusi sampel pada kolom, dengan
memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat
ditingkatkan dengan besar (Veronika,1999).
Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa, fasa gerak
cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom, terjadi
 pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.
Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka
solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol
kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil
pengukuran HPLC (Gandjar, 2007).
2.3 Komponen-komponen HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
Komponen-komponen penting dari HPLC dapat dilihat pada gambar 1

diagram Blok HPLC berikut ini :

Gambar 1. Diagram Blok HPLC

(Veronika, 1999)

2.3.1 Pompa

Fase gerak dalam HPLC adalah suatu cairan yang

bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu

kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan

(constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi

dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa

 reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur

(pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau

peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line)

detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.

Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa

syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya

terbatas. Pompa berfungsi untuk mendorong eluen dan sampel

tersebut masuk ke dalam kolom. Kecepatan alir ini dapat dikontrol

dan perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan perbedaan hasil. Eluen

berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa sampel tersebut

masuk ke dalam kolom pemisah (Putra, 2004).

2.3.2 Injektor

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom,

harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.

Ada dua model umum yaitu stopped flow dan solvent flowing. Ada

tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan pertama stop-flow

(aliran dihentikan) injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem

tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan

karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

Kedua adalah septum dimana septum yang digunakan pada HPLC

sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini

dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum

ini tidak tahan dengan semua pelarut- pelarut kromatografi cair.

Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor)

 dapat menyebabkan penyumbatan. Dan yang ketiga adalah loop

valve dimana tipe injektor ini umumnya digunakan untuk

menginjeksi volume lebih besar dari 10 μl dan dilakukan dengan

cara otomatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume

yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load,

sampel di isi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve

difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. Injektor

merupakan tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat

didistribusikan masuk ke dalam kolom (Putra, 2004).

2.3.3 Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau

gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan

kondisi percobaan yang sesuai. Kolom umumnya dibuat dari

stainless steel dan biasanya di operasikan pada temperatur kamar,

tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi. Pengepakan

kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan (Liquid Solid

Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion

Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC).

Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada

dalam sampel. Keterpaduan antara kolom dan eluen bisa

memberikan hasil/puncak yang maksimal, begitu pun sebaliknya

(Putra, 2004).

2.3.4 Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya

 komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan

menghitung kadarnya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik

memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah,

kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua

tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan

fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat

diperoleh. Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor

UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk

mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor

berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor, begitu juga

rekorder yang berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang

masuk (Weiss, 1995).

2.4 Kelebihan dan Kekurangan HPLC (High Performance Liquid

Chromatography)

2.4.1 Kelebihan

Metode HPLC memiliki kelebihan yaitu kolom HPLC

dapat dipakai berkali-kali, resolusi yang didapatkan jauh lebih tinggi

daripada metode lain (KLT, spektrofotometer), teknik yang dipakai

tidak terlalu tergantung pada kemampuan operator dan derajat

keterulangan yang didapatkan sesuai dengan kriteria USP, waktu

analisisnya secara umum lebih singkat, dan preparasi dengan HPLC

dapat dilakukan pada skala besar. Selain itu HPLC juga dapat

menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil

(Synder & Kirkland, 1979).

 2.4.2 Kekurangan

 Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu.

 Hanya bisa digunakan untuk asam organik.

 Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut,

analit dan gradient elusi.

 Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup

penelitian yang terbatas.

 Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor.

 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan

ukuran 3 mikrometer dan 5 mikrometer sela-sela partikel lebih

mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan

kemurnian larutan harus dijaga (Veronika, 1999).

2.5 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak

Selama pemisahan kromatografi, solut secara individual akan

membentuk profil konsentrasi yang simetri atau dikenal juga dengan profil

Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak

atau pita, secara perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk

profil yang asimetrik karena solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase

diam. Penyebab terjadinya pelebaran puncak kromatografi, yaitu:

2.5.1 Difusi Eddy

Kolom biasanya dikemas dengan partikel fase diam yang kecil.

Fase gerak lalu melewatinya dan membawa molekul-molekul

sampel yang ada di dalamnya. Beberapa molekul meninggalkan

 kolom terlebih dahulu dibanding molekul yang lainnya. Beberapa

molekul ada yang meninggalkan kolom belakangan disebabkan

karena mengalami beberapa pengalihan (diversi) selama

perjalanannya (Rohman, 2009).

2.5.2 Difusi Longitudinal

Difusi longitudinal adalah proses yang terjadi dimana

molekul terdifusi dari daerah yang memiliki konsentrasi tinggi pada

bagian tengah kolom ke daerah yang memiliki konsentrasi lebih

rendah di bagian depan atau belakang kolom. Beberapa molekul

akan berada pada bagian belakang kolom dan tereluasi lambat,

sementara molekul-molekul lain bergerak lebih cepat daripada rata-

rata dan tereluasi terlebih dahulu. Difusi ini berbanding terbalik

dengan laju alir fasa gerak. Jika laju alir tinggi, maka molekul-

molekul tidak akan lama berada dalam kolom sehingga waktu yang

memungkinkan terjadinya difusi juga lebih singkat (Ali, 2012).

2.5.3 Ketidaksetombangan Transfer Massa

Pelebaran puncak juga disebabkan oleh laju alir fase gerak

yang sangat cepat sehingga kesetimbangan yang sesungguhnya di

antara fase diam dan fase gerak tidak dapat tercapai. Jika kecepatan

laju alir fase gerak lebih cepat, maka molekul-molekul komponen

tereluasi dari kolom sebelum kesetimbangan itu tercapai (Rohman,

2009).
2.6 Kegunaan HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah

senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidak

murnian (impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap

(non-volatil); pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit,

dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. HPLC cocok

digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas

campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk

memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau

memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya. Dapat

memisahkan dan menganalisis vitamin-vitamin yang larut dalam air

(Gandjar, 2007).

2.7 Parasetamol

Parasetamol atau 4’-hidroksiasetanilida dengan bobot molekul

151,16 mengandung tidak kurang dari 98,0 % dan tidak lebih dari 101,0 %

C8H9NO2, dihitung terhadap zat anhidrat. Pemerian serbuk hablur putih,

tidak berbau, rasa sedikit pahit, kelarutan : larut dalam air mendidih dan

dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. Struktur kimia

parasetamol adalah:

Gambar 2. Struktur Kimia Parasetamol

(Lusiana, 2002)
Parasetamol memiliki jarak lebur 169C-172C. Kelarutannya adalah 1

gram dapat larut kira-kira 70 ml air pada suhu 25C, 1 g larut dalam 20 ml

air mendidih, dalam 70 ml alkohol, dalam 13 ml aseton, dalam 50 ml

kloroform, dalam 40 ml gliserin dan dalam 9 ml propilenglikol. Tidak

larut dalam benzen dan eter dan larut dalam alkali hidroksida. Larutan

jenuh mempunyai pH kira-kira 6 dan pKa 9,51 (Connors,et al.,1986).

Serapan maksimum parasetamol pada daerah ultraviolet di larutan asam

adalah 254 nm (A 1%, 1cm = 668) dan dalam larutan basa adalah 257 nm

(A 1%, 1cm = 715) (Clarke, 1986).

Reaksi hidrolisis parasetamol dapat dilihat sebagai berikut:

Gambar 3. Reaksi hidrolisis parasetamol

(Lusiana, 2002)
 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat
1. Gelas kimia iwaki pyrex 100 mL 5 buah
2. Pipet tetes 3 buah
3. Labu ukur Herma 50 mL 1 buah
4. Pipet volume Herma 10 mL 1 buah
5. Propipet 1 buah
6. Neraca analitik 1 buah
7. Mortar dan alu 1 set
8. Spatula 1 buah
9. Instrumen HPLC 1 set
3.2 Bahan
1. Parasetamol 0,05 gram
2. Larutan parasetamol 50 ppm 65 mL
3. Aquades secukupnya
3.3 Prosedur
3.3.1 Pembuatan Larutan Standar
Larutan standar dibuat dengan melarutkan larutan parasetamol
50 ppm ke dalam labu ukur 50 ml. Langkah ini dilakukan sampai
diperoleh konsentrasi 25, 20, 15, 10, dan 5 ppm.
3.3.2 Pembuatan Kurva Standar
Kurva standar dibuat melalui hasil analisis larutan
parasetamol konsentrasi 25, 20, 15, 10, dan 5 ppm dengan
menggunakan alat HPLC.
3.3.3 Penentuan Konsnetrasi Sampel
Larutan sampel dibuat dengan melarutkan serbuk
parasetamol sebanyak 0,05 gram ke dalam labu ukur 50 ml. lalu
larutan parasetamol diambil sebanyak 50 μL menggunakan injektor
dan dimasukan ke dalam alat HPLC. Kromatogram yang didapat
digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel parasetamol yang
terkandung di dalam obat.
 DAFTAR PUSTAKA

Ali, A. 2012. Development and Validation of Analytical Method by RP-HPLC for

Quantification of Alphamangostin Encapsulated in PLGA Microspheres.
Journal Analytical and Bioanalytical Techniques. vol. 3. no. 7. DOI:
10.4172/2155-9872.1000155.
Ganjar, G.I dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar :
Yogyakarta.
Harvey, David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill
Comp
Hendayana. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis
Modern. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya
Lusiana, Darsono. 2002. Diagnosis dan Terapi Intoksikasi Salisilat dan
Parasetamol. Jurnal Kimia. Vol. 2. No. 1.
Mulja, M., Suharman. 1995. Analisis Instrumen. Cetakan 1. Surabaya: Airlangga
University Press.
Putra, E. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. Medan:
FMIPA Universitas Sumatra Utara
Rohman, A. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu
Synder,L. 1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography. New Jersey:
John Wiley and Sons, Inc
Veronika, R. 1999. Practical High Performance Liquid Chromatogaphy. ISBN:
0-471-98373-X
Weiss, J. 1995. Ion Cromatography 2nd Edition. Weinheim: VCH