Mikroba dapat diisolasi yang terdiri dari satu jenis mikroba yang dapat dipelajari

morfologi, sifat, dan kemampuan biokimianya. Oleh karena itu dibutuhkan metode isolasi mikroba.
Menurut Singleton & Sainsbury (2006), Isolasi mikroba merupakan proses pengambilan mikroba
dari medium atau lingkungan asalnya, dan menumbuhkan pada medium buatan sehingga
diperoleh biakkan atau kultur murni hasil isolasi tersebut. Isolasi mikroba ini bertujuan untuk
memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya lalu menumbuhkannya sebagai biakan murni. Dalam
memindahkan bakteri dari satu tempat ke tempat lain harus menggunakan prosedur aseptik.
Aseptik dalam hal ini berarti bebas dari kontaminasi mikroorganisme lain yang tidak
dikehendaki.

3.3.1.1 Metode Gores (Streak Plate Method)

Menurut Yusmaniar (2017), Streak plate method (cara gores), teknik isolasi
koloni bakteri dengan cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi bahan
yang mengandung mikroba pada permukaan media agar padat. Cara kerjanya yaitu,
dicairkan medium NA dalam penangas air, dan didinginkan sampai suhu ± 50ºc.
Menurut Atlas (2005), Mikroorganisme yang sering tumbuh di media NA adalah
bakteri. Menurut Hafsan (2014), Penuangan media sebaiknya tidak dilakukan dalam
keadaan panas >50oC supaya tidak terjadi kondensasi berlebihan pada tutup cawan.
Untuk mencegah kondensasi maka media siap tuang didinginkan (dijaga) pada suhu
50oC selama 30 menit kemudian dituang. Dituangkan medium secara aseptik ke
dalam cawan petri steril, dibiarkan sampai dingin dan padat. Menurut Hafsan (2014),
Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga
sterilitas ketika menangani pengkulturan Mikroorganisme untuk mencegah
kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dinyalakan Bunsen,
lalu disterilisasi jarum ose. Menurut Hafsan (2014), sterilisasi alat dapat dilakukan
dengan membakarnya langsung dengan pembakar bunsen. Diambil 1 ose suspensi
bakteri secara aseptik dan goreskan ose pada permukaan agar dengan pola goresan
kuadran. Menurut Putri (2017), Metode gores kuadran, merupakan metode yang
dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme, dimana setiap
koloni berasal dari satu sel. Menurut Amin (2013), Metode gores kuadran dilakukan
dengan cara cawan petri yang akan digunakan dibagi menjadi 4 kuadran yang diberi
penomoran 1-4. Mikroba diambil dengan menggunakan jarum ose gores, kemudian
digoreskan pada kuadran pertama. Jarum ose disterilkan, ujung dari penggoresan
pertama kemudian diteruskan dengan menariknya pada kuadran kedua dan digores
kembali. Begitu seterusnya hingga kuadran ke-4. Ditulis nama media, tanggal isolasi,
lalu diinkubasi pada suhu (37°C) selama 48 jam. Menurut Amelia (2017), Inkubasi
merupakan pembiakan (kultivasi) bakteri dalam kondisi yang menguntungkan bagi
pertumbuhan atau pembiakan bakteri yang dilakukan di dalam tabung atau cawan
petri. Menurut Hafsan (2014), Penentuan waktu inkubasi umumnya telah disesuaikan
berdasarkan jenis media dan mikroba yang dimungkinkan tumbuh. Inkubasi yang
sesuai menghasilkan koloni-koloni yang diameternya cukup terlihat dan tersebar
merata. Diletakkan cawan petri dalam posisi terbalik agar tidak terjadi tetesan air
hasil kondensasi pada permukaan medium. Dipilih koloni-koloni yang representatif
atau dapat mewakili, kemudian dipindahkan secara aseptik ke dalam medium agar
miring yang sesuai dengan digunakan ose yang sudah disterilisasi. Diinkubasi kultur
pada suhu yang sesuai selama 24 - 48 jam. Menurut Jutono (1980), Teknik
penanaman mikroba dengan goresan bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme
dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Cara gores
umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada medium-agar sehingga
didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni.

3.3.1.2 Metode Tabur (Pour plate Method)

Menurut Yusmaniar (2017), Spread plate method (cara tebar/sebar), teknik

spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur
mikroba dengan cara dipulas atau disebar pada permukaan media agar padat. Metode
ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Cara kerjanya yaitu,
disuspensi bahan yang mengandung bakteri, lalu diencerkan suspensi sampel untuk
menurunkan konsentrasi mikroba. Menurut Martius (2018), teknik preparasi suspensi
yaitu, sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril.
Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba
dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Dicairkan
medium NA dalam penangas air, dan didinginkan sampai suhu ± 50°c. Menurut
Hafsan (2014), Penuangan media sebaiknya tidak dilakukan dalam keadaan panas
>50oC supaya tidak terjadi kondensasi berlebihan pada tutup cawan. Untuk mencegah
kondensasi maka media siap tuang didinginkan (dijaga) pada suhu 50oC selama 30
menit kemudian dituang. Diinokulasi satu ose suspensi bahan yang mengandung
bakteri secara aseptik. Menurut Amelia (2017), Inokulasi merupakan pemindahan sel-
sel mikroorganisme dari biakan ke medium steril dengan jarum atau lingkaran
inokulasi yang steril. Dikocok secara hati-hati supaya suspensi bakteri tercampur rata
dalam media. Dituangkan media agar yang telah mengandung suspensi bakteri ke
dalam cawan petri steril secara aseptik ,lalu diratakan. Diberi keterangan (medium,
tangegal, bahan yang disolasi, dll.) Setelah medium membeku, kemudia diinkubasi
kultur pada suhu yang sesuai selama 24-48 jam. Menurut Hafsan (2014) Inkubasi
yang sesuai menghasilkan koloni-koloni yang diameternya cukup terlihat dan tersebar
merata. Menurut Hafsan (2014), Pada waktu minimum uji sterilitas 48-72 jam suhu
uji/penyimpanan inkubasi ialah 35-37 °C. Menurut Utami (2018), Tujuan dari teknik
Pour Plate Method (Metode cawan tuang) adalah untuk menyebarkan sel-sel bakteri
tidak hanya pada permukaan medium agar saja melainkan sel terendam dalam
medium (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang
kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar dengan kandungan oksigen sedikit.

3.3.1.3 Metode Sebar (Spread Plate Method)

Menurut Yusmaniar (2017), Pour plate method (cara tabur), teknik ini
dilakukan menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-
50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke
dalam cawan petri steril. Cara kerjanya, yaitu dibuat pengenceran 10-1–10-6 dari kultur
murni bakteri dengan larutan pengencer. Menurut Putri (2017), Isolasi menggunakan
media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah
penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel
di dalam tabung. Diambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri,
dibuka dan dibakar mulut tabung. Menurut Hafsan (2014), Membakar mulut atau
 bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang menempel.
Pembakaran mulut tabung/Erlenmeyer sebaiknya dilakukan untuk mencegah
kontaminasi. Dipindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media
NA dalam cawan petri. Dibakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam
alkohol, dibiarkan hingga dingin. Menurut Hafsan (2014), Spreader berfungsi untuk
meratakan dan menyebarkan air dari pengenceran (0,1 ml) di atas permukaan agar
dan untuk memastikan kesterilannya spreader dapat dicelupkan alkohol lalu dibakar.
Disebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai
permukaan agar mengering. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya
diinkubasi secara terbalik agar tidak terjadi tetesan air hasil kondensasi pada
permukaan medium selama 24-48 jam pada suhu kamar dan diamati pertumbuhannya.
Menurut Hafsan (2014), Ruangan inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25 oC
atau suhu kamar dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon, karena eksplan
yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatur dan cahaya
diatur dan disesuaikan jenis eksplannya. Menurut Utami (2018), Teknik spread plate
merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara
pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. tujuan isolasi ini
ialah untuk mendapatkan koloni tunggal. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme
yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar.

Pada Teknik isolasi mikroba, terdapat beberapa Teknik, yaitu streak plate, spread
plate, dan pour plate. Terdapat beberapa perbedaan dalam prinsip maupun tujuan
penggunaan masing-masing metode.
Pada dasarnya, metode streak plate menurut Jutono dkk (1980), ialah
menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar
yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh
koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi
lebih lanjut .
Berdasarkan tujuannya, menurut sanders (2012), Prosedur streak-plate dirancang
untuk mengisolasi kultur murni bakteri, atau koloni, dari populasi campuran dengan
pemisahan mekanis sederhana. Koloni dihasilkan menggunakan teknik streak-plate,
dimana Setiap koloni mewakili populasi sel yang secara genetik identik. koloni muncul di
kuadran keempat setelah inkubasi pada 30 ° C selama 24 jam. Tiga kuadran lainnya
menunjukkan pertumbuhan konfluen sel-sel yang diendapkan pada permukaan agar
berkembang menjadi koloni yang tumpang tindih.
Pada dasarnya, Teknik pour plate menurut Jutono dkk (1980), ialah
menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-50oC dengan
suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri
steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang
mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut .
Berdasarkan tujuannya, menurut sanders (2012), Metode ini sering digunakan
untuk menghitung jumlah mikroorganisme dalam sampel campuran. Proses ini
menghasilkan koloni-koloni yang terdistribusi secara merata di seluruh media padat.
Teknik ini digunakan untuk melakukan penghitungan viable plate, di mana disebutkan
jumlah total unit pembentuk koloni dalam agar-agar dan pada permukaan agar-agar pada
satu plate. Hitungan viable plate memberikan para ilmuwan cara standar untuk
menghasilkan kurva pertumbuhan, untuk menghitung konsentrasi sel dalam tabung
sampel berlapis, dan untuk menyelidiki efek dari berbagai lingkungan atau kondisi
pertumbuhan tingkat pertumbuhan atau pertumbuhan sel bakteri.

Teknik spread plate menurut Jutono dkk (1980), merupakan teknik isolasi
mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan
media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan
kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari
pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia
yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung

Berdasarkan tujuannya, menurut sanders (2012), Teknik ini biasanya digunakan

untuk memisahkan mikroorganisme yang terkandung dalam volume sampel kecil, yang
tersebar di permukaan suatu plate agar, menghasilkan pembentukan koloni diskrit yang
didistribusikan secara merata di permukaan agar pada konsentrasi yang sesuai dimana sel
dilapisi. spread-plating secara rutin digunakan dalam percobaan pengayaan, seleksi, dan
penyaringan. Hasil yang diinginkan untuk ketiga percobaan ini biasanya sama, yaitu
distribusi koloni diskrit terbentuk di permukaan agar-agar. Namun, tujuannya bukan
untuk memastikan semua sel yang hidup membentuk koloni. Sebaliknya, hanya sel-sel
dalam populasi yang memiliki genotipe tertentu yang akan tumbuh.

Menurut Hidayat (2006) Kultivasi mikroba merupakan metode untuk

melipatgandakan jumlah mikroba dengan membiarkan mereka berkembang biak dalam
media biakan yang telah disiapkan di bawah kondisi laboratorium terkendali. Kultivasi
mikroba bertujuan untuk mengetahui kelimpahan, jenis organisme, atau keduanya.
Biasanya kultur mikroba digunakan untuk monitoring kondisi pertumbuhan tingkat
pertumbuhan atau pertumbuhan sel bakteri.