Disusun oleh:
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa (YME). Di
mana Tuhan YME telah memberikan rahmat dan karunia-Nya. Sehingga
kami dari kelompok 5 dapat menyelesaikan sebuah makalah dengan baik.
Sehingga akhirnya tersusunlah sebuah makalah Praktikum Imunologi 3 ini.
Laporan ini telah kami susun dengan sistematis dan sebaik mungkin. Hal ini
bertujuan untuk memenuhi tugas Praktikum Imunologi 3.
Dengan selesainya makalah ini maka kami tidak lupa mengucapkan banyak
terima kasih. Kami juga menyampaikan terima kasih kepada semua pihak
yang terlibat dalam penyusunan makalah Praktikum Imunologi 3.
Khususnya kepada :
1. Kepada Dr. Budi Santosa, S.KM, Msi.Med dan ibu Meutia Srikandi Fitria,
S.Si, M. Biotech selaku dosen pengampu mata kuliah praktikum Imunologi.
3. Orang tua kami yang telah mendoakan kelancaran kuliah kami.
4. Seluruh teman-teman yang berkenan saling membantu menyelesikan
makalah Praktikum Imunologi 3.
Demikian ini makalah Praktikum Imunologi3 yang telah kami buat. Kami
mohon kritik dan sarannya apabila terdapat kekurangan dalam penyusunan
makalah ini. Semoga makalah raktikum Imunologi3 ini dapat bermanfaat
bagi semua pihak. Juga bermanfaat bagi kami selaku penulis.
Penyusun,
ii
DAFTAR ISI
iii
iv
BAB I
PENDAHULUAN
1
antigen yang dikenali oleh antibodi atau dapat digunakan untuk menguji
antibodi yang mengenali antigen.
2.1 Permasalahan
1. Apa yang dimaksud HCG (Human Chorionic Gonadotropin) ?
2. Apa yang dimaksud dengan Elisa ?
3. Bagaimana prinsip pemeriksaan metode Elisa?
4. Bagaimana cara pemeriksaan HCG menggunakan metode Elisa
5. Bagaimana cara mengintrepretasikan hasil pemeriksaan HCG metode
Elisa
3.1 Tujuan
1. Mengetahui apa itu HCG dan perannya dalam tubuh.
2. Mengetahui cara pemeriksaan HCG menggunakan metode Enzimatik
Elisa.
3. Mengetahui cara intrepretasi hasil pemeriksaan HCG menggunakan
metode Elisa.
2
BAB II
ISI
3
selama awal kehamilan untuk menyelamatkan korpus luteus dari
kematian. Sekresi puncak HCG terjadi sekitar 60 hari setelah akhir siklus
haid terakhir. Pada minggu ke 10 kehamilan, hormon ini turun ke tingkat
yang rendah yang berlangsung selama sepanjang kehamilan.
Turunnya hormon HCG terjadi pada saat korpus luteum tidak lagi
diperlukan untuk sekresi hormon steroidnya, karena plasenta mulai
mengeluarkan estrogen dan progesteron dalam jumlah yang signifikan.
Korppus luteum mengalami regresi parsial seiring dengan merosotnya
sekresi HCG.
2.2. Elisa (Enzim Linked Immunosorbent Assay)
2.2.1 Pengertian Elisa
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) adalah suatu
tekhnik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi
untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
Elisa telah digunakan dalam bidang medis, patologi tumbuhan dan juga
berbagai bidnag industri. Dalam pengertian sederhana, sejunmlah antigen
yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian
antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan
berikatan dengan antigennya. Antigen ini terikat dengan suatu enzim dan
pada tahap terakhir di tambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim
menjadi sinyal yang dapat terdeteksi.
2.2.2 Prinsip metode Elisa
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada
suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat
dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan
adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan
menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan
antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA
sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah
ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila
sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan
4
bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik)
dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi
antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas
permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke
permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik
yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi.
Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi
atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal yang berupa pendaran flourescense.
2.2.3 Jenis –jenis Metode Elisa
Jenis jenis Metode ELISA (Enzyme linked immunosorbent Assay)
1. ELISA ( enzyme Linked imunosorbent Assay) DIRECT
Tekhnik ELISA ini merupakan teknik ELISA paling sederhana.
Tekhnik ELISA ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan
mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct
menggunakan satu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada
tekhnik direct ELISA, pertama microtiter diisi dengan sampel yang
mengndung antigen yang diinginkan, sehinngga antigen tersebut dapat
menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian
microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada
dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan
enzim signal dimasukkan kedalam lubang lubang microtiter sehingga
dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan
dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi tetaut enzym
signal yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, kedalam luabng
lubang tersebut itambahkan substrat yang dapat berinteraksi dengan
enzim signl, sehingga enzym yang tertau antibody yang telah
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan
5
substrat dan menimbulkan signl dapat di deteksi. Pendeteksian
interaksi antara antigen dan antibodi selanjutnya dapat dihitung
dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent
end point.
2. ELISA (Enzyme linked immunosorbent Assay) Indirect
Elisa indirect merupakan tekhnik elisa paling sederhana, hanya saja
dalam tekhnik elisa indirect yang dideteksi dan yang diukur
konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan
suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik
tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
3. ELISA (Enzyme Linked immunooassay) Sandwitch
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk
menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut
enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan.
Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan
ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang
diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang
diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer
spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka
teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen
memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein.
Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai
antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut
sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali
disebut sebagai antibody deteksi. Dalam pengaplikasiannya, ELISA
sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan
antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan
dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA
sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang
6
diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi
dengan kedua antibody.
2.3. Pemeriksaan Hcg metode elisa
2.3.1. Prinsip Pemeriksaan Hcg Metode elisa
CBI hCG ELISA adalah metode sandwitch ELISA fase padat yang
diadaptasi. Smapel konjugat anti hCG-biotin berlabel anti hCG-
HRP ditambahkan kesumur yang dilapisi dengan streptavidin. hCG
dalam serum pasien berikatan dengan antibodi anti hCG dan
membentuk sandhwitch pada pelat berlapis streptavidin. Protein
yang tidak terikat dan konjugat HRP dicuci dengan buffer cuci.
Setelah poenambahan substrat, intensitas warna sebanding dengan
konsentrasi hCG dalam sampel. Kurva standar disiapkan yang
menghubungkan intensitas warna dengan konsentrasi hCG dalam
sampel.
2.3.2. Alat dan bahan pemeriksaan Hcg
Alat dan bahan yang digunakan dalam pemeriksaan Hcg elisa
Bahan :
1. Microwell yang dilapisidenganstreplavidin
2. Reagent standart.
3. Sampelpengencer.
4. Enzimkonjugat.
5. Serum.
6. Substrate tbm.
7. Stop solution.
Alat :
1. Strip test.
2. Kantung foil.
3. Segel.
4. Kertas penyerap.
7
Hal hal yang perlu dilakukan sebelum melakukan pemeriksaan
1. Lapisi sumuran dengan anti body anti-B-hCG (monoclonal)
2. Pastikan semua bahan tidak mengandung pengawet yang
mengandung merkuri
3. Pada pemeriksaan ini menggunakan sampel berupa serum atau
plasma ( EDTA , herparin atau sitrat) pastikan specimen tidak
boleh hemolitik, ikterik, atau lipemik. Sampel yang
mengandung natrium azida tidak dapat digunakan.
Pengumpulan specimen
1. Serum : Kumpulkan darah dengan vene puncture ( mis.
Sarstatedt monovette untuk serum), mengubah dot, dan
memisahkan serum dengan centrifuge pada suhu kamar. Jangan
centrifuge sebelum cloting lengkap terjadi.
2. Plasma : Seluruh darah harus dikumpulkan pada tabung
centrifuge yang mengandung anti koagulan dan segera di
centrifuge setelah pengambilan sampel.
Persiapan dan penyimpanan harus ditutup dan dapat disimpan
hingga 5 hari pada suhu 2°C – 8°C sebelum pengujian. Specimen
yang disimpan untuk waktu yang lebih lama harus dibekukan
hanya sekali pada suhu – 20°C sebelum pengujian. Pengenceran
specimen jika dalam pengujian awal lebih tinggi specimen dapat
diencerkan seperti yang dijelaskan dalam prosedur pengujian.
2.3.3. Prosedur pemeriksaan Hcg
Sebelum dilakukan pengujian, disiapkan reagen pada suhu kamar
(20-25ºC), kocok pelan semua reagen ketika akan digunakan.
1 Diletakkan sejumlah strip yang diinginkan kedalam dudukan.
Ganti semua strip mikrosumur yang tidak terpakai kembali
kedalam kantung foil, segel, dan simpan pada suhu2-8 °C.
2 Dipipet 25 μL standar HCG, kontrol, dan sampel (serum)
kesumur yang sesuai.
3 Diambahkan 100 μLreagenkonjugatkesemuasumuran.
8
4 Diinkubasi selama 60 menit pada suhu kamar (18-26 ° C).
5 Dibuang cairan dari semua sumuran. Kemudian dicuci
sumuran tiga kali dengan 300 μL buffer cuci 1X. Blot pada
handuk kertas penyerap.
6 Ditambahkan 100 μL substrat TMB kedalam semua sumuran.
7 Diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
8 Ditambahkan 50 μL stop solution kedalam masing-masing
sumuraan, dikocok pelan untuk mencampur larutan
9 Dibaca absorbansi pada Elisa Reader 450 nm dalam waktu 15
menit setelah menambahkan stop solution.
2.3.4. Intrerpretasi Hasil
Kalkulasi hasil (kuantitatif)
1. Hitung niali absorbansi rata-rata untuk setiap, kontrol, dan
sampel pasien.
2. Menggunakan kertas grafik linir, buat kurva standar dengan
memplot rata-rata absorbansi yang diperoleh dari masing-
masing standar terhadap konsentrasinya dengan nilai basorbansi
pada sumbu vertikal (Y) dan konsentrasi pada sumber horizontal
(X).
3. Menggunakan nilai absorbansi rata-rata untuk setiap sampel
menentukan konsentrasi yang sesuai dari kurva standar.
4. Metode otomatis: Hasil dalam Petunjuk Penggunaan telah
dihitung secara otomatis menggunakanKurva 4-Parameter yang
cocok. (4 Parameter Rodbard atau 4 Parameter Marquardt
adalah metode yang direkomendasikan). Fungsi reduksi data
lainnya mungkin memberikan hasil yang sedikit berbeda.
5. Konsentrasi sampel dapat dibaca langsung dari kurva standar
ini. Sampel dengan konsentrasi lebih tinggi dari standar tertinggi
harus lebih lanjut diencerkan atau dilaporkan sebagai> 1000
mIU / mL. Untukperhitungan konsentrasi faktor pengenceran ini
harus diperhitungkan.
9
6. ContohKurva Standard
Standard Optical Units (450 nm)
Standard 1 (5 mIU/mL ) 0.05
Standard 2 (50 mIU/mL) 0.14
Standard 3 (200 mIU/mL) 0.43
Standard 4 (500 mIU/mL) 0.94
Standard 5 (1000 mIU/mL) 1.54
Hasil Kualitatif
Untuk analisis kualitatif kadar hCG, perubahan warna spesimen
dibandingkan dengan warna Sample Diluent (0 mIU / mL) dan Standard 2
(50 mIU / mL). Jika warna biru kurang kuat dari warna Standard 50 mIU /
mL, sampel dianggap negatif. Jika warna biru lebih kuat dari atau sama
dengan warna 50 mIU / mL Standard sampel dianggap sebagai positif.
Nilai Normal:
Sangat disarankan bahwa setiap laboratorium harus menentukan nilai
normal dan abnormalnya sendiri. Hasil itu sendiri seharusnya tidak
menjadi satu-satunya alasan untuk konsekuensi terapeutik. Hasilnya harus
berkorelasi dengan pengamatan klinis dan tes diagnostik lainnya. Dalam
sebuah penelitian yang dilakukan dengan orang dewasa sehat yang
tampaknya normal, menggunakan ELISA hCG IBL nilai-nilai berikut
adalah diamati:
10
Kadar hCG dalam Serum pada masa kehamilan:
MasaKehamilan MasaKehamilan
Konsentrasi Konsentrasi
(Minggu) (Minggu)
BAB III
11
PENUTUP
3.1. KESIMPULAN
1. HCG (Human Chorionic Gonadotropin) adalah hormon yang
diproduksi selama masa kehamilan. Hormon ini hadir dalam darah dan
dikeluarkan oleh sel plasenta, sebagai hasil pembuahan sel telur oleh
sperma. Kira-kira 10 hari setelah sel telur dibuahi sperma di tuba
fallopii, sel telur akan bergerak menuju rahim dan melekat pada
dindingnya, sejak itulah plasenta mulai berkembang dan memproduksi
HCG yang dapat di temukan di dalam darah dan air seni.
2. Pemeriksaan HCG menggunakan metode elisa sandwich dimana
menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang
diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan ELISA sandwich ini
cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic
(sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent
seperti polisakarida atau protein.
3. Intrepretasi hasil HCG dapat dilihat dari nilai normalnya itu sendiri
yang ada dalam tabel. Dan dibandingkan dengan hasil yang diperoleh
12
DAFTAR PUSTAKA
13