PENDAHULUAN

Salah satu tanaman obat yang ada di Indonesia adalah Sirsak (Annona muricata L.).
Sirsak merupakan tumbuhan dengan berbagai macam manfaat bagi kesehatan baik daging buah,
daun maupun bijinya memiliki kandungan kimia yang bermanfaat untuk pengobatan, antara lain
sebagai antibakteri, antivirus, antioksidan, antijamur, antiparasit, antihipertensi, antistres, dan
menyehatkan sistem saraf. Daging buahnya mengandung serat dan vitamin, kandungan zat gizi
terbanyak dalam buah sirsak adalah karbohidrat. Daunnya mengandung senyawa tanin, fitosterol,
kalsium oksalat, alkaloid murisin, monotetrahidrofuran asetogenin, seperti anomurisin A dan B,
gigantetrosin A, annonasin-10-one, murikatosin A dan B, annonasin dan goniotalamisin.
Penggunaanya di masyarakat yaitu dengan merebus daunnya kemudian hasil rebusan diminum
(Suranto, 2011).
Alkaloid merupakan suatu basa organic yang mengandung unsur Nitrogen (N) pada
umumnya berasal dari tanaman, yang mempunyai efek fisiologis kuat terhadap manusia.
Kegunaan senyawa alkaloid dalam bidang farmakologi adalah untuk memacu sistem syaraf,
menaikkan tekanan darah, dan melawan infeksi mikrobial (Pasaribu, 2009).

Ekstraksi senyawa alkaloid dilakukan dengan menggunakan metode maserasi, metode ini dipilih
karena pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diperoleh maseratnya,
serta proses perendaman yang cukup lama diharapkan dapat menarik lebih banyak zat aktif yang
terkandung di dalam simplisia. Tahap selanjutnya yaitu diidentifikasi dengan menggunakan
pereaksi umum alkaloid dan Kromatografi Lapis Tipis. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi
alkaloid pada daun sirsak (Annona muricata L.).

 Metode spektrofotometer FTIR dan LC-MS.

Penelitian ini dilakukan dengan mengekstraksi daun sirsak dengan menggunkan
heksan, metanol, Asam sitrat, Eter, Amoniak, NaOH, NH4Cl, Kloroform dan
Magnesium sulfat. Ekstrak alkaloid fenolik dan non fenoliknya dianalisis menggunakan
spektrofotometer FTIR dan LC-MS.

Pembuatan Simplisia
Daun sirsak yang digunakan adalah daun yang tidak terlalu tua dan juga tidak
terlalu muda. Daun sirsak segar dibersihkan dari kotoran-kotoran yang menempel
(sortasi basah), dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian ditiriskan untuk
membebaskan daun dari sisa air cucian. Daun yang telah bersih dan bebas dari air
cucian dikeringkan dalam udara tanpa terkena sinar matahari selama tiga hari, setelah
kering lalu dihaluskan dan disimpan dalam wadah bersih dan ditutup rapat.

Pembuatan Ekstrak Alkaloid Total

500 gram Serbuk daun sirsak dimaserasi dengan n-heksan 1 liter selama 3x24 jam, residu yang
diperoleh dimaserasi kembali dengan metanol dengan perbandingan pelarut 1:10 (b/v).
Selanjutnya ekstrak metanol dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator. Didapatkan
hasil residu eksktrak metanol. Ekstrak metanol ditambahkan dengan larutan asam sitrat 5%.
Didapat Fraksi asam, lalu di cuci dengan eter sampai lapisan itu menjadi tidak berwarna. Lapisan
asam dibasakan dengan amoniak sampai pH 8-9. Endapan yang terbentuk disaring lalu
ditambahkan kloroform. Didapat fraksi kloroform, kemudian dicuci dengan air. Selanjutnya
larutan kloroform dikeringkan dengan MgSO4 anhidrat dan diuapkan sampai tekanan rendah
hingga kering. Akhirnya diperoleh alkaloid total.

Pemisahan Alkaloid Fenolik dan Non Fenolik

Alkaloid total dilarutkan dalam kloroform kemudian ditambahkan dengan larutan
NaOH 5%. Fraksi basanya diasamkan dengan NH4Cl sampai pH 8-9. Endapan yang
terbentuk dilarutkan dengan kloroform, kedua fraksi digabungkan, lalu dicuci dengan

Kadar air (%) =

Bobot awal–Bobot akhir x 100%

Bobot awal

Penghitungan Kadar Rendemen Ekstrak

Kadar rendemen ekstrak dihitung untuk mengetahui seberapa besar ekstrak yang
dihasilkan dari proses ekstraksi dari masing masing pelarut.

Kadar rendemen ekstrak (%)=

Bobot hasil ekstrak x 100 %

Bobot simplisia

Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan massa molekul alkaloid fenolik dan
non fenolik. Disiapkan larutan standar 1 ppm. Masing-masing standar disuntikkan ke
dalam sistem LC-MS. Ditentukan parameter standar pada sistem diantaranya ionization
mode ES +, desolvation temp 300 0C, source temp 110 0C, cone 38 volt. Peak dengan
puncak paling tinggi menunjukkan zat yang dimaksud dan dapat diketahui massa (MS
Scan) dan massa pecahan (Daughter Scan).

Metode Analisis LC-MS

Masing - masing 10 mg Sampel alkaloid fenolik dan non fenolik dilarutkan 100 μL
kloroform kemudian disentrifus lalu ditambahkan 900 μL metanol dan dipisahkan
dengan sentrifus lalu diambil cairanya. kemudian diuapkan pada suhu 400C dibawah
aliran gas nitrogen. kemudian disuntikkan sebanyak 5 μL ke dalam sistem LC-MS/MS. Kondisi
HPLC meliputi kecepatan alir 0,3 mL/min, fase gerak asam format 0,1 %
dalam air dan asetonitril, guard kolom Acquity UPLC BEH C18 1.7μL, 2.1x50 mm.
Kondisi MS disesuaikan dengan kondisi yang diperoleh pada saat uji pendahuluan.

Analisis Spektrofotometri Infra Merah ( FTIR )

Sampel sebagai lempeng dalam Kalium Bromida kering, lempeng tersebut dibuat
dengan jalan menggerus cuplikan kira- kira 1% KBr dan ditekan sekitar 8 ton sehingga
diperoleh sebuah lempeng transparan. Sinar inframerah yang melalui lempeng tersebut
menunjukkan harga - harga bilangan gelombang yang tercatat dalam spektrumnya.
Untuk sampel cairan dioleskan pada plat KBr dan untuk sampel padatan atau serbuk
digerus kan pada plat KBr. Bila sampel mengandung pelarut organik maka setelah
sampel dioleskan pada plat KBr diletakan dibawah lampu pijar untuk menghilangkan
pelarut organik, sehingga yang tertinggal hanya pelarut organiknya saja. Plat yang
mengandung sampel ditempatkan pada alat FTIR dan tunggu sampai spektrum IR
muncul.

Hasil Dan Pembahasan

Hasil Uji Fitokimia

Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui jenis senyawa yang ada dalam ekstrak
daun sirsak. Uji ini dilakukan terhadap ekstrak metanol daun sirsak, diantaranya adalah
senyawa alkaloid. Hasil uji senyawa alkaloid dapat dilihat Tabel 4. Hasil Uji Fitokimia
Alkaloid Ekstrak Daun Sirsak.

Tabel 1. Hasil Uji Fitokimia Alkaloid Ekstrak Daun Sirsak.

No Uji Fitokimia Indikasi adanya senyawa uji Hasil

Pengamatan
1 Pereaksi Dragendroft Terbentuk endapan warna orange +
2 Pereaksi Mayers Terbentuk endapan warna putih +
3 Pereaksi Wagner Terbentuk endapan warna coklat +
Dari hasil uji fitokimia dapat diketahui bahwa dalam ekstrak metanol daun sirsak
terkandung senyawa alkaloid.

Hasil Identifikasi Senyawa Alkaloid Menggunakan LC-MS

Hasil identifikasi senyawa alkaloid menggunakan LC-MS terhadap ekstrak alkaloid
Fenolik dan alkaloid non fenolik daun sirsak dapat dilihat pada Tabel 2. dan Tabel 3.
Masing-masing standar disuntikkan ke dalam sistem LC-MS/MS. Ditentukan parameter
standar pada sistem diantaranya ionization mode ES +, desolvation temp 300 0C, source
temp 110 0C, cone 38 volt. Peak dengan puncak paling tinggi menunjukkan zat yang
dimaksud dan dapat diketahui massa (MS Scan) dan massa pecahan (Daughter Scan).

Tabel 2. Hasil Identifikasi Senyawa Organik Ekstrak Alkaloid Fenolik

No WR*(menit) Senyawa Kimia BM** Rumus molekul Rumus

Molekul
2-amino-2-
1 4,626 heksadesilpropana- 316,32 C19H42NO2
1,3-diol

2-[2-(4-Hidrosikfenil)-
2 4,519 4-fenil-1H-imidazol- 415,14 C28H19N2O
5-il]-9H-fluoren-9-one
Tabel 3. Hasil Identifikasi Senyawa Organik Ekstrak Alkaloid Non Fenolik

No WR*(menit) Senyawa Kimia BM** Rumus molekul Rumus

Molekul
3-Etil-N-(2 C12H14N7
1 4,887 piridinilmetil)-3H- 256,13
[1,2,3]triazolo[4,5d]piri
midin-7-amina

C34H72N
2 6,297 N-Heksadecil- 494,56
H3 C NH CH3
1-oktadekanamina

Hasil analisis identifikasi senyawa organik dengan LC-MS diketahui bahwa dalam
ekstrak alkaloid fenolik mengandung beberapa senyawaan diantaranya adalah: 2-amino-
2-heksadesilpropana-1,3-diol dan 2-[2-(4-Hidrosikfenil)-4-fenil-1H-imidazol-5-yl]- 9Hfluoren-
9-on. Alkaloidnya adalah alkaloid imidazol dan amina. Hasil analisis identifikasi senyawa
organik dengan LC-MS diketahui bahwa dalam ekstrak alkaloid non fenolik mengandung
beberapa senyawaan diantaranya adalah: 3- Etil-N-(2-piridinilmetil)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-
d]pirimidin-7-amina dan N-Heksadecil- 1-oktadekanamina. Alkaloidnya adalah alkaloid
pirimidin dan amina. Pada hasil identifikasi alkaloid fenolik dan non fenolik dengan
menggunakan LCMS didapat persentasi yang cukup besar antara 99,9 – 100% senyawa tersebut
terdapat dalam sampel alkaloid fenolik dan non fenolik.

Analisis FTIR Alkaloid Fenolik

Pada gambar 1 menunjukkan hasil analisis FTIR alkaloid fenolik. Adanya sebuah
serapan dalam daerah gugus fungsi sebuah spektrum infra merah merupakan petunjuk
bahwa beberapa gugus fungsi tertentu terdapat dalam cuplikan. Frekuensi rentang O-H
alkohol, fenol ( ikatan H ) menghasilkan puncak serapan besar di daerah 2000 sampai
dengan 3600 cm-1.
Sebuah gugus hidroksi bebas mengambarkan puncak tajam disekitar 3600 cm-1 dan
puncak lebar yang massanya terlihat adalah akibat interaksi
ikatan hidrogen antara gugus hidroksi dari beberapa molekul alkohol. Pada panjang
gelombang 1123,54 cm-1 terdapat ikatan N-H stretching untuk senyawa Alkil Amina,
pada panjang gelombang 1400 cm-1 terdapat ikatan C-N stretching untuk senyawa aril
sekunder amina dan pada panjang gelombang 2500 cm-1 gugus terdapat ikatan C-H
untuk senyawa aromatik.
Gambar 1. Spektrum FTIR Alkaloid Fenolik

Analisis FTIR Alkaloid Non Fenolik

Pada gambar Menunjukkan hasil analisis FTIR alkaloid non fenolik. Adanya
sebuah serapan dalam daerah gugus fungsi sebuah spektrum infra merah merupakan
petunjuk bahwa beberapa gugus fungsi tertentu terdapat dalam cuplikan. Frekuensi
rentang C-H untuk ikatan alkana menghasilkan puncak serapan besar di daerah 2850 -
2960 cm-1. Sebuah Ikatan N-H stretching terdapat pada puncak resapan sekitar 3200 –
3600 cm-1. Ini menunjukan didalam sampel alkaloid non fenolik terdapat senyawa
alkaloid, karena senyawa alkaloid mengandung ikatan N-H.
Pada daerah resapan 2271,41 cm-1 terdapat ikatan senyawa overtune C-H aromatik,
daerah resapan 1377,23 cm-1 terdapat ikatan C-N stretching untuk senyawa Amina
tersier dan pada daerah resapan 752,60 cm-1 terdapat ikatan C-H untuk senyawa Piridin.

Gambar 2. Spektrum FTIR Alkaloid Non Fenolik

 Metode Kromatografi Lapis Tipis

Sampel daun sirsak yang telah dikeringkan dan dihaluskan diekstraksi dengan metode
maserasi menggunakan pelarut etanol 96% selama 5 hari. Filtrat yang diperoleh dipekatkan
menggunakan rotavapor untuk mendapatkan ekstrak kental dan siap digunakan sebagai bahan
uji. Reaksi identifikasi alkaloid menggunakan metode yang tercantum dalam Materia Medika
Indonesia Edisi V. Identifikasi dengan metode kromatografi lapis tipis menggunakan eluen
etil asetat : metanol : air (16:1:2), noda diamati menggunakan sinar UV 254 nm kemudian
deteksi bercak dengan menyemprot pereaksi Dragendorff. Bercak yang menandakan adanya
alkaloid adalah bercak dengan warna jingga, hitung harga Rf.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
Hasil penelitian dapat dilihat pada table berikut

Tabel 1. Hasil Pengolahan Simplisia dan Ekstraksi

Jumlah sampel Cairan Waktu Hasil Hasil Hasil

yang digunakan Penyari maserasi rotavapor Ekstrak kental

100g 1200 mL 5 hari 900 ml 300 ml 13 g

Tabel 2. Hasil Identifikasi Alkaloid Menggunakan Reaksi Warna

Larutan Sampel Reaksi Warna Endapan
Larutan I Larutan+Pereaksi Bouchardat Keruh coklat-hitam
Larutan +Pereaksi Mayer Keruh -

Larutan II Larutan+Pereaksi Bouchardat Keruh coklat-hitam

Larutan +Pereaksi Mayer Keruh -

Tabel 3. Hasil Identifikasi Alkaloid Secara Kromatografi Lapis Tipis

Larutan Sampel Lampu UV Pereaksi Dragendorff Harga Rf
Ekstrak + Etanol 96% Noda tidak tampak Jingga 0,76

Pembahasan

Ekstraksi alkaloid dari daun sirsak dilakukan dengan metode maserasi karena
pengerjaannya lebih mudah dan peralatan yang digunakan sederhana, serta proses maserasi
sangat menguntungkan dalam ekstraksi senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel
tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara
didalam dan diluar sel, sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut
dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna. Penggunaan etanol 96% sebagai
pelarut adalah karena etanol 96% dapat bertindak sebagai pelarut dan pengawet sehingga zat
yang dinginkan dapat terekstraksi serta tahan lama dan tidak mudah ditumbuhi jamur. Proses
maserasi 100 gram serbuk daun sirsak dilakukan selama 5 hari dan sehari sekali sampel diaduk
sehingga sampel bagian bawah berada pada bagian atas, maserat yang diperoleh kemudian
diuapkan dengan rotavapor kemudian diuapkan kembali diatas tangas air sampai di dapatkan
ekstrak kental. Selanjutnya untuk reaksi identifikasi alkaloid dibuat 2 larutan uji, larutan pertama
ekstrak diencerkan dengan air kemudian ditambahkan 1 mL HCl 2N dan pada larutan kedua
ditambahkan 9 mL HCl 2N .
Penambahan HCL 2N dimaksudkan untuk menarik senyawa alkaloid dalam ekstrak
karena alkaloid bersifat basa maka dengan penambahan asam seperti HCl akan terbentuk garam,
sehingga alkaloid akan terpisah dengan komponen-komponen lain dari sel tumbuhan yang ikut
terekstrak dengan mendistribusikannya ke fasa asam. Setelah itu
dilakukan pemanasan selama 2 menit di atas penangas air kemudian didinginkan lalu saring
kemudian dipipet tiga tetes filtrat dan dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya direaksikan
dengan pereaksi Mayer terjadi kekeruhan tetapi tidak terbentuk endapan, hal ini dikarenakan
tidak semua alkaloid bereaksi dengan pereaksi Mayer.
Pengendapan yang terjadi tergantung pada jenis alkaloidnya. Setelah itu diambil kembali
tiga tetes filtrate direaksikan dengan pereaksi Bouchardat terbentuk endapan berwarna coklat
kehitaman yang menandakan adanya alkaloid, akan tetapi karena semua senyawa yang
mengandung unsure nitrogen dapat bereaksi dengan pereaksi Bouchardat maka dilakukan
identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis.
Proses identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis menggunakan eluen etil
asetat : metanol : air dengan perbandingan 16 : 1: 2 tujuan dipilihnya tiga pelarut tersebut
karena masing-masing pelarut memiliki kepolaran yang berbeda sehingga senyawasenyawa
dengan kepolaran yang berbeda dapat terpisahkan dengan eluen tersebut. Deteksi bercak dengan
menggunakan sinar UV 254 nm.
Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna
gelap. Hasil setelah dilihat di bawah sinar UV 254 nm noda atau bercak tidak tampak,
dikarenakan tidak semua noda atau bercak yang menandakan adanya alkaloid bisa dilihat dengn
UV 254 nm oleh karena itu lempeng disemprot dengan pereaksi Dragendorff untuk
menampakkan noda atau bercaknya. Setelah lempeng disemprot dengan pereaksi dragendorff
terdapat bercak berwarna jingga yang dapat dilihat secara langsung. Bercak
berwarna jingga ini menandakan adanya senyawa golongan alkaloid pada daun sirsak. Harga Rf
yang didapatkan setelah dihitung adalah 0,76. Berdasarkan Harborne (1987) nilai Rf
0,76 tidak masuk dalam kisaran 12 alkaloid yang paling umum yaitu 0,07 – 0,62 namun dengan
melihat hasil identifikasi dengan pereaksi kimia dan kromatografi lapis tipis dapat dinyatakan
bahwa daun sirsak mengandung senyawa alkaloid.