LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM

Rabu, 4 Maret 2015

Kelompok II
Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama NPM
Iman Firmansyah 260110130044

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai TTD
 PEWARNAAN GRAM

I . Tujuan

Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif, dengan
menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan
reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Teknik Aseptis
Cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan
mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur
mikroorganisme yang diinginkan ( Siswaya, 2014 ).
2. Pewarnaan Diferensial
Memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.
Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang
memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak
tahan asam (Dwidjoseputro, 2005).
3. Ikatan Ion
Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya
muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna ( Volk &
Wheeler, 1984 ).
4. Absorbsi
Proses pemisahan bahan dari suatu campuran gas dengan cara pengikatan
bahan tersebut pada permukaan absorben cair yang diikuti dengan
pelarutan. Kelarutan gas yang akan diserap dapat disebabkan hanya oleh
gaya-gaya fisik (pada absorpsi fisik) atau selain gaya tersebut juga oleh
ikatan kimia (pada absorpsi kimia) ( Setyowati, 2009 ).
III. Teori Dasar

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut
pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri
Klebsiella Pneumonia (Karmana,2008).

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram
negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal
violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negatif misalnya adalah
Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram,
misalnya Mycobacterium sp, karena dinding selnya mengandung banyak
lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya.
Pada pewarnaantersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan
akan berwarna hijau (James, 2002).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam.
Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut
disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna
asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan
negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak
ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses
pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan
negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro, 2005).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan

untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan
negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada
struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian
sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat
zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya
sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme

disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat
warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang
bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang
disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan
mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro, 2005).

Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat

warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram
positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet
lebih kuat, sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid
sehingga pori-pori mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat
pencucian alkohol (Fardiaz, 1989).

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu

untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri
dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan
ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan
kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan
air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci
dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan
pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu tidak
terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikering anginkan. Kemudian
digenangi lagi dengan safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan
kering di udara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram
negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif (Pelczar,
2007).

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu

pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan
anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan
perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel
bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara
struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-
negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan
lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram-
negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif.
Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering
bersifat toksik (racun), dan membran bagian luar membantu melindungi
bakteri gram-negatfi patogen melawawn sistem pertahanan inangnya. Lebih
jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih resisten terhadap antibiotik
dibandingkan dengan gram-positif karena membran bagian luar itu
mengahalangi masuknya obat-obatan ( Campbell, 2003 ).

Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan
lapisan peptidoglikan yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jika
diwarnai dengan pewarnaan Gram. Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae,
Treponema pallidum, Vibrio Cholerae dan Bacillus subtilis. Sedangkan
Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan
lapisan peptidoglikan yang tipis. Bakteri ini akan berwarna merah muda atau
merah, kila diwarnai dengan pewarnaan gram. Contohnya Streptococcus
mutans, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (Aryulina, 2004).

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994).
IV. Alat dan Bahan

1. Alat :
a. Bak Pewarna.
b. Buku Gambar
c. Cawan Petri
d. Kaca Objek.
e. Kapas.
f. Kertas Saring.
g. Korek api
h. Mikroskop Majemuk.
i. Ose.
j. Pembakar Spirtus.
k. Pensil warna Merah, Biru, Ungu
l. Spidol
2. Bahan :
a. Air Suling dalam Botol Semprot.
b. Alkohol 70%.
c. Alkohol 95%
d. Desinfektan.
e. Emersi Oil.
f. Sampel Air Liur.
g. Suspensi Campuran Bakteri E. coli dan S. Aureus
h. Suspensi Campuran Bakteri E. coli dan B. subfilis
i. Zat Warna Karbol Fuksin.
j. Zat Warna Karbol Gentian Violet
k. Zat Warna Lugol.
3. Gambar Alat
V . Prosedur

Sampel suspensi bakteri di siapkan di dalam tabung reaksi. Kaca objek di

sterilisasi dengan cara dicuci, lalu dimasukkan kedalam larutan desinfektan,
kemudian dimasukkan kedalam larutan alkohol 70%. Setelah kaca objek
disterilisasi, di lap menggunakan kapas sampai mengeluarkan suara berdecit.
Lingkari bagian bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk
pengolesan sampel bakteri. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan
pembakar spirtus sampai ose berpijar. Ose didinginkan dengan cara
didekatkan dengan pembakar spirtus.

Dibuat olesan bakteri dari suspensi bakteri di atas kaca obyek yang bersih
serta bebas lemak dengan menggunakan ose yang sudah di fiksasi. Setelah
pengolesan, kaca objek di lewatkan di atas api pembakar spirtus sampai
sampel di atas kaca objek berubah warna menjadi pucat (keputih – putihan).

Kemudian letakkan kaca objek di atas bak warna, genangi olesan tersebut
dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit, buang zat warna yang
berlebih, lalu dibilas dengan air suling. Genangi olesan dengan lugol selama 2
menit, buang lugol yang berlebih lalu bilas dengan air suling. Cuci olesan
dengan pemucat alkohol 95% tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat
warna larut, lalu bilas dengan air suling. Genangi olesan dengan pewarna
tandingan air fuksin selama 30 detik, buang warna yang berlebih, bilas
dengan air suling lalu keringkan dengan kertas saring.

Teteskan sedikit minyak emersi pada gelas objek, lalu di periksa dibawah
mikroskop dengan pembesaran 10X dan 100X. Diamati dan digambar
hasilnya.
VI. Data Pengamatan

No Keterangan Hasil

Pembesaran Mikroskop 40X

1.

Sampel suspensi campuran

bakteri bakteri E. coli
(warna merah) dan B.
subfilis (warna violet) pada
2.
pembesaran mikroskop 40X
dan 100X

Sampel suspensi campuran

bakteri bakteri E. coli
(warna merah) dan S.
aureus (warna biru) pada
3.
pembesaran mikroskop 40X
dan 100X
VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa

pewarnaan gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang
sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal
identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri
gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel.

Pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara

di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam
alkohol 70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi
semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat
yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan
olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada
pembakar spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat
pada ose, supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di uji.

Sebelum melakukan pengolesan bakteri kaca objek di beri tanda

lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel
bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dua
kali dengan sampel suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus &
suspensi campuran Bakteri E. coli dan B. subfilis.

Kemudian melakukan pengolesan pada kaca objek dengan salah satu

sampel suspensi campuran bakteri, setelah itu di fiksasi di atas api dengan
cara di lewat – lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati.
Fiksasi dalam tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass
tanpa merusak struktur selnya, mempermudah pengecetan,dan sediaan tahan
untuk disimpan jika belum sempat dicat.

Kaca objek yang sudah dioleskan bakteri kemudian di simpan di atas

bak warna lalu di teteskan pewarna karbol gentian violet dan diamkan
selama 1 menit. Karbol gentian violet merupakan campuaran fuchsin fenol,
dan dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Umumnya
digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan
untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba. Setelah 1
menit lalu di bilas dengan aquades. Lalu olesan di teteskan pewarna lugol
dan diamkan selama 2 menit. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu
pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol akan terperangkap
antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. Setelah
2 menit, lugol di bilas dengan aquades. Kemudian olesan dicuci dengan
alkohol 95% sampai zat warna larut. Alkohol 95% merupakan solven
organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci atau
tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen
dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan
bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna
akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol
96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel.

Setelah pemberian alkohol 95% olesan diberikan atau di teteskan

pewarna tandingan berupa karbol fuksin selama 30 detik. Karbol fuksin ini
berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna
utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin
memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan
sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga
sel berwarna ungu. Setelah 30 detik bilas dengan aquades lalu dikeringkan
dengan kertas saring. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu
dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades.
Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang
sedang diberikan.

Selanjutnya olesan di tetesi emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak

emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang
fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop. Minyak
emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air,
sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan
dengan tanpa minyak emersi.

Dari hasil pengamatan mikroskop sampel suspensi campuran bakteri

E. coli dan S. Aureus dapat teramati dengan ciri S. Aureus berbentuk coccus
dengan warna violet yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram positif,
sedangkan E. coli berbentuk basil dengan warna merah yang menandakan
bakteri tersebut bakteri gram negatif. Pada sampel yang kedua yaitu sampel
suspensi campuran bakteri E. coli dan B. subfilis dapat teramati dengan ciri
bakteri B. subfilis berbentuk basil dengan warna violet yang menandakan
bakteri tersebut bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli sama seperti
sampel pertama.

Beberapa perbedaan sifat yang terlihat antara bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif yaitu bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna violet sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri
 ini akan berwarna biru atau violet di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini di dasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel bakteri. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal di banding
bakteri gram negatif sehingga bakteri gram positif dapat mempertahan
warna ungu.

VIII. Simpulan

Dapat mengamati dua kelompok bakteri yaitu gram positif dan

gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan gram, dengan hasil
bakteri S. Aureus dan bakteri B. subfilis sebagai bakteri gram positif, lalu
bakteri E. coli sebagai gram negatif.

Dapat memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang

terjadi dalam proses tersebut yang dapat di lihat dari pewarna yang bereaksi
dengan sel bakteri.
 DAFTAR PUSTAKA

Aryulina, Diah.2004.Biologi Umum. Jakarta : Erlangga

Campbell, Nell.2003. Bilogi Edisi Kelima Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Dwidjoseputro, D.2005.Dasar - Dasar Mikrobiologi.Malang: Penerbit Djambatan.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor : IPB

James, Joyce. 2002. Prinsip - Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Jakarta :

Erlangga

Karmana, Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama.

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Siswaya,Yoanne.2014.Teknik Kultur Secara Aseptik. Tersedia online di

http://www.academia.edu/6138539/Praktikum_2 [Diakses pada tanggal 8
Maret 2015].

Setyowati, Suparni.2009.Absorbsi. Tersedia online di http://www.chem-is-

try.org/materi_kimia/kimia-industri/teknologi-proses/absorbsi/ [Di akses pada
8 Maret 2015].

Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta :
Erlangga.