PENUNTUN PRAKTIKUM

MATA KULIAH TEKNIK KULTUR JARINGAN

SEMESTER GANJIL 2015/2016

RINDANG DWIYANI
(KOORDINATOR)

KONSENTRASI AGRONOMI DAN HORTIKULTURA

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS UDAYANA
2015
 TOPIK 1. PENGENALAN PERALATAN KULTUR JARINGAN
Dasar Teori
Peralatan dalam kultur jaringan digunakan untuk melaksanakan pekerjaan kultur jaringan, dari
sterilisasi, penanaman dan inkubasi kultur. Beberapa diantaranya, yang penting dan wajib dimiliki
oleh setiap laboratorium kultur jaringan adalah : timbangan, autoklaf, magnetic stirrer, meja kerja,
shaker dan rak kultur.
1. Timbangan digital
Timbangan (balance) digital beragam jenisnya, gunanya secara umum adalah untuk menghitung
satuan massa suatu benda dengan teknik digital (Gambar 1). Dalam lab kultur, alat ini digunakan
untuk menimbang bahan/zat yang digunakan dalam kultur, misalnya zat pengatur tumbuh, bahan
untuk media, gula, agar, dan lain sebagainya. Secara umum, cara penggunaan timbangan adalah
sebagai berikut. Timbangan dihubungkan dengan stop kontak listrik (plug-in), kemudian tekan tombol
“on/off” untuk mengaktifkan. Sebelum digunakan timbangan dinolkan terlebih dahulu. Setelah alas
timbang (untuk menaruh bahan yang akan ditimbang) diletakkan pada timbangan, timbangan kembali
dinolkan. Kemudian bahan yang akan ditimbang ditaruh pada alas timbang yang sudah disiapkan.
Selanjutnya, berat benda yang ditimbang akan terbaca pada layar. Setelah pekerjaan penimbangan
selesai, timbangan harus dibersihkan.

Gambar 1. Timbangan digital

(a: kapasitas timbang 210g; b=kapasitas timbang 610g)
(Dokumentasi pribadi)
2. Magnetic stirrer
Magnetic stirrer digunakan untuk proses pembuatan media, yaitu untuk pemanasan (heating) dan
pengadukan (stirring) (Gambar 2). Dengan fungsi tersebut maka alat ini dilengkapi dengan dua
tombol putar, yakni tombol “stirrer” (pengaduk) dan tombol “heat” (untuk pemanasan). Alat ini juga
dilengkapi dengan magnet untuk mengaduk.
 Gambar 1. Magnetic stirrer
(Dokumentasi pribadi)

Untuk pembuatan media, cara kerjanya adalah sebagai berikut. Magnetic stirrer dihubungkan
dengan listrik. Letakkan gelas erlenmeyer yang akan digunakan sebagai wadah pembuatan media.
Ukuran Erlenmeyer biasanya lebih besar dari volume media yang dibuat. Misalnya untuk volume
media 1000 ml, digunakan gelas Erlenmeyer 2 L. Pelarut bahan media (umumnya aquades)
dimasukkan dalam gelas. Volume aquades pertama yang dimasukkan kurang lebih 300-500 ml
(untuk membuat 1000 ml media). Selanjutnya semua bahan media dimasukkan satu persatu sambil
tombol “stirrer” diputar perlahan, dari yang rendah ke yang tinggi, hingga terbentuk larutan yang
homogen. Selanjutnya ditambahkan aquades hingga volume mendekati 1000 ml. Diukur pH larutan
dan disesuaikan menjadi 5.6 - 5.8 dengan penambahan larutan HCl (jika terlalu basa) atau larutan
NaOH/KOH (jika terlalu asam). Magnet diangkat/diambil dari gelas erlenmeyer dan volume larutan
dibuat hingga 1000 ml dengan menambahkan aquades. Selanjutnya dilakukan pemanasan dengan
o
memutar tombol “heat” hingga suhu mencapai 80 C. Suhu ini adalah suhu maksimal untuk menjaga
agar bahan aktif yang terkandung dalam zat kimia tidak rusak. Media tersebut kemudian dituang
dalam botol-botol kultur steril (volume media umumnya sekitar 30 ml per botol), ditutup dan
disterilisasi dengan autoklaf. Selanjutnya magnetic stirrer tersebut dibersihkan setelah selesai
digunakan.

3. Autoklaf

Autoklaf adalah alat untuk sterilisasi dengan metode uap panas (steam heating). Ada dua jenis jika
dilihat dari daya yang digunakan. Yang pertama adalah autoklaf yang menggunakan kompor
(Gambar 3) dan yang kedua adalah autoklaf yang menggunakan daya listrik. Keduanya memiliki cara
kerja yang sama dalam proses sterilisasi.

Gambar 3. Autoklaf yang menggunakan daya kompor

(Dokumentasi pribadi)

Autoklaf dilengkapi dengan “sarangan” seperti pada dandang untuk mengukus. Pada sarangan ini
diletakkan benda yang akan disteril. Sementara pada dandang (dibawah sarangan) diisi dengan air
untuk menghasilkan uap, mirip seperti dandang pengukus. Setelah benda yang akan disterilisasi
dimasukkan, tutup autoklaf ditutup dengan jalan memutar „skrup‟ hingga benar-benar kencang,
sementara itu katup uap dibiarkan tetap terbuka. Setelah itu autoklaf diletakkan di atas kompor
(untuk yang menggunakan daya kompor) dan dihubungkan stop kontak (yang menggunakan daya
listrik). Katup uap ditutup jika sudah mengeluarkan uap agar suhu dan tekanan naik. Perlahan suhu
o
dan tekanan akan naik . Jika sudah mencapai tekanan 17,5 Psi atau suhu 121 C, kompor harus
segera dikecilkan. Kemudian kondisi dijaga dalam tekanan ini selama waktu yang dibutuhkan untuk
sterilisasi. Misalnya untuk sterilisasi media selama 20-30 menit, peralatan kecil dan glasswares
selama 1 jam. Untuk jenis autoklaf listrik, naiknya suhu sangat lambat dan tekanan 17,5 Psi dicapai
dalam waktu yang lebih lama. Namun kemudian stabil dalam tekanan ini tanpa harus mencabut stop
kontak seperti halnya mengecilkan kompor pada autoklaf kompor. Autoklaf kompor lebih murah
harganya dan lebih umum digunakan.

4. Oven

Sterilisasi juga bisa dilakukan dengan oven, namun hanya bisa untuk alat-alat kecil dan glasswares
dan tidak bisa untuk sterilisasi media. Di dalam laboratorium, oven diletakkan di ruang preparasi.
Metode sterilisasi dengan oven dikenal dengan dry heating, karena proses sterilisasi menggunakan
udara kering yang panas. Ada banyak ragam oven, namun satu diantaranya dapat dilihat pada
Gambar 4. Oven ini menggunakan daya listrik, dilengkapi dengan pengatur suhu dan waktu,
sehingga proses sterilisasi bisa dilakukan dengan menekan tombol sesuai dengan kebutuhan. Angka
yang menunjukkan suhu dan waktu pengovenan akan terbaca secara digital.

a b

Gambar 4. Oven (a) dan bagian dalamnya (b)

(Dokumentasi pribadi)

5. Meja Kerja (Enkas, laminar)

Meja kerja dalam kultur jaringan disebut juga meja tanam, adalah tempat yang digunakan untuk
menanam. Meja kerja yang sederhana disebut enkas (Gambar 5). Enkas tidak menggunakan daya
listrik. Di bagian depan terdapat dua lubang yang digunakan untuk memasukkan tangan
penggunanya. Bagian alam enkas dijaga sterilisasinya dengan jalan menyemprotnya dengan alkohol
atau spiritus. Demikian pula alat/bahan yang akan digunakan serta tangan penggunanya juga
disemprot dengan alkohol. Meja kerja lainnya adalah laminar air flow cabinet (LAFC) (Gambar 6).
LAFC lebih modern dari enkas, menggunakan daya listrik dan dilengkapi dengan lampu ultra violet
(UV) yang berguna untuk membunuh mikroorganisme serta lampu neon sebagai penerang. Lampu
UV ini dinyalakan 30 menit sebelum LAFC digunakan dan dimatikan segera saat LAFC mulai
digunakan. Prinsip kerja LAFC adalah dengan hembusan udara (air flow) yang steril. Pertama udara
diluar disaring oleh filter pertama yang letaknya umumnya di bagian atas laminar. Udara ini
selanjutnya memasuki sistem filter yang kedua dalam laminar dan menjadi steril. Udara steril ini
akhirnya dihembuskan pada areal meja kerja keluar dari laminar.

Gambar 5. Enkas
(Dokumentasi pribadi)

Gambar 6. Laminar air flow cabinet yang diletakkan berjajar

(Dokumentasi pribadi)

Hembusan udara steril ini akan menghalangi setiap mikroorganisme yang mungkin memasuki
laminar. Sama halnya seperti enkas, sebelum dan sesudah bekerja, laminar harus disemprot dengan
alkohol. Semua benda yang akan dimasukkan ke dalam laminar, termasuk tangan pengguna juga
disemprot dengan alkohol. Prinsip kerja steril merupakan syarat mutlak dalam pekerjaan kultur
jaringan.

6. Rak kultur
Rak kultur merupakan tempat untuk meletakkan eksplan setelah ditanam pada media steril dan
menumbuhahkannya hingga menjadi plantlet. Rak kultur diletakkan dalam ruang kultur. Semua
proses morfogenesis hingga terbentuknya plantlet berlangsung di ruang kultur pada rak kultur
(Gambar 7).

Gambar 7. Rak kultur

(Dokumentasi pribadi)
7. Glasswares

Glasswares adalah semua peralatan kecil yang terbuat dari bahan gelas seperti gelas ukur, gelas dan
labu Erlenmeyer, serta botol kultur. Alat-alat ini dapat disterilisasi dengan oven maupun dengan
autoklaf. Alat-alat ini harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi agar kondisi steril tetap terjaga
sampai alat tersebut digunakan. Botol-botol bekas seperti botol selai, botol minuman dan botol infus
yang terbuat dari bahan gelas dapat digunakan untuk botol kultur.

8. Peralatan kecil lainnya

Peralatan kecil lainnya terdiri dari dissecting kit (perataan untuk memotong/mengiris), pinset, spatula
dan lain-lain yang umumnya terbuat dari bahan logam (stainlessteel). Spatula merupakan pengaduk
atau digunakan untuk mengambil bahan berupa serbuk. Pinset digunakan untuk memegang /
menjepit benda, umumnya digunakan pada saat penanaman eksplan. Scalpel adalah gagang pisau
yang dalam penggunaannya berpasangan dengan blade (pisau). Gunanya adalah untuk
mengiris/memotong, dalam hal ini bahan eksplan yang akan ditanam. Bagian pisau dijual secara
terpisah dari scalpel (gagang)nya dan sudah dalam keadaan steril. Pisau steril ini bersifat sekali
pakai. Peralatan kecil dari bahan logam ini juga harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi.
Sterilisasi dapat dilakukan dengan oven maupun dengan autoklaf.
Pertanyaan:

1. Jelaskan fungsi dan cara kerja : autoklaf, timbangan, laminar

2. Sebutkan alat untuk sterilisasi: a. media; b. alat-alat kecil seperti pinset, scalpel, spatula, dan
sebagainya.

3. Apa yang dimaksud dengan sterilisasi dengan metode steam heating dan dry heating?

4. Apa itu meja kerja dan apa fungsinya?

5. Mengapa sebelum menimbang zat harus mengetahui kapasitas timbangan yang digunakan?
 TOPIK 2. PEMBUATAN MEDIA

Dasar Teori
Eksplan (berupa jaringan atau organ) yang ditumbuhkan secara in vitro pada media buatan, juga
membutuhkan hara untuk terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan. Secara umum media buatan
tersebut mengandung :

- Hara makro: nitrogen (N), posfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur
(S).

- Hara mikro : ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) dan
molybdenum (Mo).

- Gula.

Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi karena
tanaman kultur bersifat heterotrof atau tidak dapat melakukan fotosintesis untuk
menghasilkan karbohidrat.

- Vitamin

Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme.

Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel dan proses diferensiasi sel dan jaringan yang
ditanam secara in vitro. Beberapa jenis vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro adalah
thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine.

- Myo-inositol

Myo-inositol adalah senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur
dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel untuk banyak spesies tanaman.
Meskipun bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan
pectin.

- Zat pengatur tumbuh.

Umumnya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in-
vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin.

- Pemadat media

Media kultur diberi pemadat, dapat berupa agar, agarose atau gellan gum. Penambahan
senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat.

- Asam amino
 Asam amino tidak selalu harus ditambahkan pada media kultur, namun diperlukan untuk
kultur sel dan kultur protoplas.

- Senyawa organik alami

Senyawa organik alami seperti air kelapa, santan kelapa, jus/ekstrak tomat, ekstrak pisang,
ekstrak kentang dan lain sebagainya seringkali ditambahkan pada media kultur untuk
menstimulasi pertumbuhan sel/jaringan kultur. Kebutuhan akan jenis dan jumlahnya
tergantung spesies tanamannya.

Cara Pembuatan Media

A. Media Kemasan Jadi
Misalnya untuk membuat 1 liter media dasar MS, ditimbang 4.43 gram media kemasan MS (pada
label tertera „4.43 gram untuk 1 liter media‟) dan dimasukkkan dalam gelas beker ukuran 2 liter.
Ukuran gelas beker harus lebih besar volumenya dari volume media yang dibuat untuk
menghindarkan tumpahnya media ketika larutan dalam gelas beker mendidih. Selanjutnya
diletakkan di atas magnetic stirrer untuk proses pengadukan dan pemanasan. Ditambahkan air
destilasi (distilled water) dan diaduk dengan stirrer hingga larut. Kemudian ditambahkan komponen
lainnya seperti gula dan juga ZPT jika diperlukan dan dilarutkan kembali hingga benar-benar larut.
Selanjutnya ditambahkan air destilasi hingga volume mencapai 1 liter. Diukur pH larutan dan pH
selanjutnya disesuaikan menjadi 5.6-5.8 dengan menambahkan NaOH atau HCl. Terakhir
dimasukkan pemadat, kemudian dipanaskan hingga mendekati mendidih. Selanjutnya media dituang
dalam botol kultur steril, ditutup rapat dan disterilisasi dengan autoklaf. Lamanya sterilisasi
tergantung volume media, umumnya 20 menit untuk volume media 20-25 ml per-botol.

B. Media Racikan
Untuk membuat media racikan, maka harus diketahui dulu komponen masing-masing jenis
media seperti yang tertera dalam Tabel 1.

Tabel 1. Beberapa Jenis Media dan Komponennya

Komponen Jenis Media

media (mg/liter)

Hara makro: MS G5 W VW NN

Ca3(PO4)2 200.0
NH4NO3 1650. 720.0
0
KNO3 1900. 2500. 80.0 525.0 950.0
0 0
CaCl2.2H2O 440.0 150.0 166.0
 MgSO4.7H2O 370.0 250.0 720.0 250.0 185.0
KH2PO4 170.0 250.0 68.0
(NH4)2SO4 134.0 500.0
NaH2PO4.H2O 150.0 16.5
CaNO3.4H2O 300.0
Na2SO4 200.0
KCl 65.0
K2SO4
Hara mikro:
KI 0.83 0.75 0.75
H3BO3 6.20 3.0 1.5 10.0
MnSO4.4H2O 22.30 7.0 0.75 25.0
MnSO4.H2O 10.0
ZnSO4.7H2O 8.6 2.0 2.6 10.0
Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 0.25
CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.025
CoCl2.6H2O 0.025 0.025
Co(NO3)2.6H2O
Na2EDTA 37.3 37.3 37.3
FeSO4.7H2O 27.8 27.8 27.8
MnCl2
Fe(C4H4O6)3.2H2 28.0
O
Vitamin dan
suplemen
lainnya:
Inositol 100.0 100.0 100.0
Glycine 2.0 2.0 3.0 2.0
Thiamine HCl 0.1 10.0 0.1 0.5
Pyridoxine HCl 0.5 0.1 0.5
Nicotinic acid 0.5 0.5 5.0
Keterangan: MS=Murashige &
Ca- 1.0
Skoog; G5=Gamborg;
panthothenate
W=White; VW=Vacin &Went;
Cysteine HCl 1.0
Nitsch & Nitsch (Sumber : Saad
Riboflavin & Elshahed, 2012).
Biotin 0.05
Folic acid 0.5 Komponen media
dasar tersebut pada Tabel 1 juga dijual secara terpisah, sehingga pembuatannya melalui proses
pencampuran komponen. Preparasi media dilakukan dengan pembuatan larutan stok terlebih
dahulu. Tujuannya adalah untuk menghindarkan penimbangan banyak komponen secara berulang
jika pembuatan media dilakukan berkali-kali. Selain itu, untuk mempermudah penimbangan hara
mikro yang dibutuhkan dalam jumlah sangat sedikit. Berikut dijelaskan bagaimana pembuatan
larutan stok dibuat untuk media dasar MS serta berapa volume yang harus dipipet untuk pembuatan
1 liter media MS.
Cara pembuatan 500 ml larutan stok adalah sebagai berikut: tuang air destilasi sebanyak
kurang lebih 200 ml ke dalam gelas beker ukuran 1000 ml. Timbang dan masukkan secara berurutan
komponen satu persatu sambil dilakukan pengadukan dengan stirrer. Jika semua komponen sudah
larut, terakhir ditambahkan air destilasi hingga volume mencapai 500 ml. Sebaiknya digunakan air
destilasi steril untuk pembuatan larutan stok. Tujuannya adalah untuk memperkecil resiko
o
kontaminasi. Selanjutnya larutan stok yang sudah homogen ini disimpan pada suhu 4 C. Larutan
stok Fe-EDTA disimpan dalam keadaan kedap cahaya dengan jalan membungkus botol dengan
aluminium foil karena cahaya dapat merusak Fe.
500 ml larutan stok hara makro (Stok A)
Komponen Kebutuhan Stok 100 x Stok 50 x
untuk 1 liter konsentrasi konsentrasi
media (mg) (mg) (mg)
NH4NO3 1650 165000 82500
KNO3 1900 190000 95000
MgSO4.7H2O 370 37000 18500
KH2PO4 170 17000 8500
Volume stok
yang harus 5 ml 10 ml
dipipet untuk
1 liter media

500 ml larutan stok CaCl2.2H2O (Stok B)

Komponen Kebutuhan Stok 100 x Stok 50 x

untuk 1 konsentrasi konsentrasi
liter media (mg) (mg)
(mg)
CaCl2.2H2O 440.0 44000 22000
Volume
stok yang 5 ml 10 ml
harus
dipipet
untuk 1 liter
media

500 ml stok hara mikro (Stok C)

Komponen Kebutuhan Stok 100 x Stok 50 x
untuk 1 konsentrasi konsentrasi
liter media (mg) (mg)
(mg)
KI 0.83 83 41.5

H3BO3 6.20 620 310

MnSO4.4H2O 22.30 2230 1115

ZnSO4.7H2O 8.6 860 430

Na2MoO4.2H2O 0.25 25 12.5

CuSO4.5H2O 0.025 2.5 1.25

CoCl2.6H2O 0.025 2.5 1.25

Volume stok
yang harus 5 ml 10
dipipet untuk 1 ml
liter media
500 ml larutan stok Fe-EDTA (Stok D)
Komponen Kebutuhan Stok 100 x Stok 50 x
untuk 1 konsentrasi konsentrasi
liter media (mg) (mg)
(mg)
Na2EDTA 37.3 3730 1865

FeSO4.7H2O 27.8 2780 1390

Volume stok
yang harus 5 ml 10 ml
dipipet
untuk 1 liter
media

500 ml larutan stok vitamin (Stok E)

Komponen Kebutuhan Stok 100 x Stok 50 x
untuk 1 konsentrasi konsentrasi
liter media (mg) (mg)
(mg)
Inositol 100.0 10000 5000

Glycine 2.0 200 100

Thiamine 0.1 10 5
HCl
Pyridoxine 0.5 50 25
HCl
Nicotinic 0.5 50 25
acid
Volume
stok yang 5 ml 10 ml
harus
dipipet
untuk 1 liter
media

Pembuatan satu liter media MS dari larutan stok dilakukan dengan jalan menambahkan
larutan stok A, B, C, D dan E secara berurutan pada gelas beker ukuran 2 liter yang sudah berisi
kurang lebih 400 ml air destilasi. Volume larutan stok yang dipipet tergantung dari konsentrasi stok
yang dibuat dan volume larutan stok. Misal untuk volume 500 ml stok dengan “50 x konsentrasi”,
maka volume yang dipipet adalah 1/50 x 500 ml = 10 ml. ZPT atau senyawa organik alami (jika
diperlukan) ditambahkan sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan. Selanjutnya ditambahkan gula
sebanyak 20-30 gram, diaduk terus hingga homogen. Air destilasi ditambahkan hingga volumenya
1000 ml dan dilakukan penyesuaian pH menjadi 5.6-5.8 dengan menambahkan NaOH (jika terlalu
asam) atau HCl (jika terlalu basa). Setelah penyesuaian pH, ditambahkan pemadat, diaduk terus
sambil dipanaskan hingga mendekati mendidih. Selanjutnya media dituang dalam botol kultur dan
diautoklaf. Lamanya sterilisasi tergantung volume media seperti terlihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Minimal waktu sterilisasi dengan autoklaf yang dibutuhkan media kultur

Volume media Lama sterilisasi (menit)

(ml)
25 20
50 25
100 28
250 31
500 35
1000 40
2000 48
4000 63
(Sumber: Burger, 1988)

Pertanyaan:

1. Sebutkan komponen media kultur serta fungsi dari masing-masing komponen tersebut

2. Sebutkan cara membuat media baik dari media kemasan jadi maupun media racikan.
 TOPIK 3. PENYEMAIAN BIJI ANGGREK

Dasar Teori
Berbeda dengan biji tanaman angiospermae lain yang memiliki cadangan makanan, biji anggrek
sedikit atau tidak sama sekali memiliki cadangan makan (endosperm). Konsekwensinya, biji-biji ini
harus disemai secara in vitro di laboratorium pada media steril yang mengandung sumber makanan
(hara makro, hara mikro, vitamin). Perkecambahan biji anggrek secara alamiah (di habitatnya) bisa
terjadi, namun harus ada simbiosis dengan semacam mikoriza. Dengan demikian, penaburan biji
anggrek harus ditanam secara in vitro di laboratorium. Syarat utama untuk kultur in vitro adalah
kondisi aseptik, sehingga sterilisasi merupakan faktor penting untuk keberhasilan kerja kultur in vitro.

Cara Penaburan
Sterilisasi merupakan kunci keberhasilan dalam penaburan biji. Sterilisasi diawali dengan
menyemprot dan mengelap laminar (meja kerja) dengan alkohol (70% atau 95%). Selanjutnya,
lampu Ultra Violet (UV) pada laminar dinyalakan selama 30 menit dan ditutup rapat. Setelah lampu
UV dimatikan, lampu biasa dan „blower‟ dinyalakan. Selanjutnya alat tanam (pisau, skalpel, spatula),
petri, wadah steril (untuk tempat alkohol), lampu bunsen dan media tanam dimasukkan ke dalam
laminar dengan menyemprotnya terlebih dahulu menggunakan alkohol.
Sterilisasi terhadap material tanam dilakukan dengan tahapan sebagai berikut. Pertama
buah anggrek (yang akan ditabur bijinya) dicuci pada kucuran air kran sambil disikat (dengan sikat
gigi bersih) menggunakan detergen. Selanjutnya buah anggrek yang sudah bersih ini dicelupkan
dalam spiritus dan dibakar di atas lampu bunsen. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali, baru kemudian
dimasukkan ke dalam laminar.
Di dalam laminar, buah anggrek tersebut dipegang dengan pinset, dibakar sekali lagi baru
kemudian dibelah. Selanjutnya biji-biji anggrek ditanam pada media yang sudah disiapkan. Prinsip
untuk menjaga kondisi steril adalah setiap alat tanam yang akan mengenai bahan tanam harus
dicelupkan terlebih dahulu dalam alkohol, lalu dibakar di api lampu bunsen, baru kemudian
digunakan. Hati-hati dalam penggunaan alkohol dan api. Jangan sampai „alat yang masih
mengandung api‟ dicelupkan dalam alkohol karena dapat menyebabkan terbakarnya alkohol.
Prosedur penanaman biji anggrek ini dapat dilihat pada Gambar 8.
 1 2 3

6 4

Gambar 8. Prosedur Penanaman Biji Anggrek di laboratorium. Buah anggrek yang siap tabur
(1); Buah dicuci dan disikat dengan detergen (2); Buah dicelupkan pada spiritus dan dibakar di api
bunsen (3); Buah dibelah dengan pisau steril (4); Biji ditabur pada media (5) ; dan berkecambah (6)

Pengamatan dan pembahasan

- Amati saat terbentuknya struktur bulat hijau (protokorm)
- Berapa jumlah botol yang menghasilkan protokorm? dan bahaslah mengapa terjadinya
kegagalan pembentukan protokorm.
- Amati jumlah botol yang terkontaminasi dan bahaslah apa yang menyebabkan kontaminasi.

Pertanyaan
- Mengapa biji anggrek harus ditabur secara in-vitro? Dapatkan biji anggrek ditabur eks-vitro?
 TOPIK 4. KULTUR TUNAS TANAMAN MAWAR

Dasar Teori
Kultur tunas merupakan salah satu tipe kultur dalam mikropropagasi. Bahan tanam (eksplan)
dapat berupa tunas apikal ataupun tunas aksilar. Keduanya merupakan bahan tanam yang bersifat
meristematik dan mengandung bakal tunas di dalamnya (pre-existing shoot). Media kultur akan
menstimulasi terjadinya morfogenesis dan pembentukan propagul.
Popagul yang akan muncul tergantung dari jenis dan konsentrasi serta rasio zat pengatur
tumbuh yang digunakan dalam media. Rasio sitokinin / auksin yang tinggi (>1) akan menstimulasi
terbentuknya tunas dan sebaliknya rasio sitokinin /auksin yang rendah (<1) menstimulasi
terbentuknya akar. Jika rasio sitokinin /auksin 1 maka akan menstimulasi terbentuknya kalus.
Terbentuknya kalus juga dapat distimulasi oleh penggunaan 2,4-D yang memang dikenal superior
dalam pembentukan kalus secara in-vitro.

Cara Kerja
- Ambil tunas mawar dari tanaman induknya
- Cuci dibawah air mengalir dan sikat dengan detergen
- Rendam sambil digoyang-goyangkan eksplan dalam larutan fungisida (Benlate) konsentrasi
2g/liter selama 15 menit.
- Cuci bersih eksplan sebanyak 3 kali dengan air steril.
- Rendam sambil digoyang-goyangkan kembali eksplan dalam larutan clorox 5% selama 10
menit
- Cuci bersih eksplan sebanyak 3 kali dengan air steril
- Letakkan pada cawan petri steril dan masukkan dalam laminar
- Di dalam laminar kembali direndam dan digoyang-goyangkan eksplan dalam clorox 5%
selama 10 menit
- Cuci kembali dengan bersih eksplan menggunakan air steril sebanyak 3 kali
- Tiriskankan eksplan dengan jalan meletakkannya pada cawan petri steril yang sudah dilapisi
kertas saring steril
- Tanam eksplan pada media yang sudah disiapkan sebelumnya
- Media yang digunakan:
A = media MS (tanpa hormon)
B = media MS dengan 2 ppm 2-iP + 0.01 ppm NAA
C = media MS dengan 2 ppm 2-iP + 2 ppm NAA
D = media MS dengan 0.01 ppm 2-iP + 2 ppm NAA

- Pengamatan:
 Pengamatan dilakukan setiap hari. Amati saat propagul tumbuh dan jenis propagul yang
tumbuh pada masing-masing media.
Bahaslah dengan menggunakan referensi hasil yang diperoleh.

- Pertanyaan:
1. Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi morfogenesis dalam
mikropropagasi.
2. Sebutkan hormon yang tergolong sitokinin dan auksin dan jelaskan pengaruhnya
terhadap pertumbuhan eksplan di dalam kultur.

Daftar Pustaka
Burger DW. 1988. Guidelines for autoclaving liquid media used in plant tissue culture. Hort. Sci.
23: 1066-1068
Saad AIM & Elshahed AM. 2012. Plant tissue culture media. http://creative
commons.org./licenses/by/3.0 (download 03/01/2015)