UJI PEWARNA SABIN-FELDMAN UNTUK TOXOPLASMOSIS

PENGGUNAAN SODIUM SITRAT DALAM FAKTOR AKSESORI, DAN METODE

UNTUK MENGUMPULKAN DAN MENYIMPAN DARAH PADA CAKRAM KERTAS

GORDON D. WALLACE

Pacific Research Section, National Institute of Allergy and Injectious Diseases, National
Institutes of Health, P.O. Box 1680, Honolulu, Hawaii 96806

ABSTRAK: Penambahan natrium sitrat pada sampel serum faktor-aksesori (AF) tertentu untuk
dimasukkan dalam uji pewarna Sabin-Feldman menurunkan proporsi Toxoplasma yang tidak
ternoda dari tingkat yang tidak dapat diterima ke tingkat yang dapat diterima. Prosedur ini juga
mempermudah lokasi donor AF yang sesuai, dan menghilangkan masalah endapan, sering kali
dijumpai dalam plasma yang dimaksudkan untuk digunakan sebagai AF. Metode cakram kertas
saring untuk mengumpulkan dan menyimpan darah sebagai penentuan antibodi terbukti sangat
akurat untuk digunakan dalam tes pewarna dengan membandingkan titer eluat dari kertas saring
yang berisi darah kapiler dengan titer serum dari darah vena yang dikumpulkan dari sekelompok
pendonor darah. Diamati juga bahwa darah pada kertas saring biasanya dapat disimpan selama
beberapa minggu pada suhu kamar tanpa kehilangan titer antibodi yang cukup besar. Lebih
lanjut, itu ditunjukkan secara eksperimental bahwa penentuan antibodi yang akurat dapat dibuat
dari cakram (disk) yang mengandung darah tikus yang dikumpulkan beberapa jam setelah
kematian.

Salah satu kesulitan yang diakui secara umum
dalam melakukan tes pewarna Sabin-Feldman
adalah menemukan serum manusia yang
cocok sebagai faktor aksesori. Hambatan
utama yang dihadapi laboratorium ini, dan
tampaknya pada orang lain juga, adalah
seringnya terjadi pada serum manusia normal
dari faktor anti-Toxoplasma. Beberapa peneliti
telah mengakui bahwa plasma lebih sering
cocok sebagai faktor pelengkap daripada
serum keseluruhan, tetapi endapan yang
menyulitkan mungkin ditemui dalam plasma.
Laporan ini menjelaskan dan membahas
keunggulan metode, pertama kali dilaporkan
oleh Payne, di mana serum yang mengandung
natrium sitrat digunakan sebagai faktor
aksesori daripada plasma. Selain itu, teknik
cakram kertas saring yang diadopsi untuk
digunakan dalam mengumpulkan
menyimpan darah untuk pengujian dengan tes
pewarna telah dijelaskan, dan data tentang
akurasi teknik ini dibandingkan dengan
metode konvensional telah disajikan.
BAHAN DAN METODE
Tes Pewarna
Uji pewarna Sabin-Feldman dilakukan,
dengan beberapa modifikasi, dengan metode
Frenkel dan Jacobs. Tekanan RH Toxoplasma
gondii digunakan, dan organisme
dikumpulkan dari eksudat peritoneal tikus 2
hari setelah inokulasi. Faktor aksesori (AF)
terdiri dari empat atau lima bagian serum
manusia normal yang dicampur dengan satu
natrium 0,2 M (Na3 C6 H5 O7 . 2H2O) dan
dianggap dapat diterima jika tidak mengurangi
proporsi pewarnaan Toxoplasma pada kontrol
di bawah 90%, dan tidak mengubah titer
antibodi uji-pewarna dari serum positif yang
diketahui lebih dari dua kali lipat. Ketika
donor yang cocok ditemukan, sekitar 250 ml
serum diperoleh dari darah beku dan disimpan
dalam alikuot 5,0 ml pada suhu 40 ° C.
Natrium sitrat dicampur dengan serum sesaat
sebelum digunakan dalam tes.
Untuk pengujian, satu bagian natrium heparin
(1.000 unit per cc) ditambahkan ke sekitar 10
bagian eksudat peritoneum dan eksudat
kemudian diencerkan dalam larutan salin
dan dapar fosfat Dulbecco, mengandung 20% AF,
untuk menyediakan 100 hingga 150 parasit per
tinggi bidang kering (44 X objektif, 10 X
okuler). Suspensi ini disentrifugasi (dalam
tabung non-silikon) selama 3 menit pada
kecepatan tiga perempat dalam model CL
International Clinical Centrifuge. Cairan
supernatan kemudian diganti dengan jumlah
AF yang sama yang diencerkan hingga 80%
dengan larutan garam buffer. Setelah
dicampur secara menyeluruh, 0,1 ml suspensi
telah ini ditambahkan ke tabung yang mengandung
0,1 ml serum atau elusi yang diencerkan dan
diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 ° C.
Serum positif yang diketahui dan parasit yang
mengandung tabung yang tersuspensi dalam
AF plus salin dimasukkan dalam setiap tes.
Setelah 0,1 ml pewarna buffered ditambahkan
biasanya ada sekitar 20 parasit per bidang
kering tinggi dalam cairan di setiap tabung.
Titik akhir dianggap sebagai pengenceran
awal serum atau eluat di mana 50% atau lebih
dari parasit tetap tidak ternoda.
Metode Cakram Kertas Saring
Bahan dan metode yang dijelaskan oleh Chin
dan rekan kerja) dipekerjakan, dengan
modifikasi berikut. Darah dikumpulkan hanya
pada dua cakram kertas saring, dikeringkan
selama 2 hingga 3 hari pada 24 ° C (± 1 °),
dan (kecuali jika dinyatakan lain) kemudian
disimpan pada suhu 4 ° C sampai dielusi. tunggal dalam jarum suntik sekali pakai 5,0-
Serum dielusi dengan menempatkan disk ml yang mengandung 0,7 ml larutan garam

fisiologis dan menahannya semalaman pada konsentrasi yang dinyatakan di sini, daripada
suhu 4 ° C. Cairan dalam laras jarum suntik ketika serum digunakan sendiri. Dia juga
dan dalam disk kemudian diekspresikan ke mempresentasikan data yang menunjukkan
dalam tabung reaksi dengan menekan plunger. bahwa garam lain tidak memiliki efek yang
Pengenceran serum yang dihasilkan sama. Dia secara konsisten menemukan,
diperkirakan antara 1:14 hingga 1:18 (0,10 ± penurunan titer antibodi dua kali lipat ketika
0,005 ml darah per disk). Setelah inaktivasi menggunakan serum yang dicampur dengan
pada 56 ° C selama 30 menit, sel tersebut sitrat. Kami menemukan bahwa dengan
disentrifugasi pada kecepatan maksimum mengencerkan serum AF (mengandung
selama 30 menit dalam International Clinical natrium sitrat) dengan larutan garam buffer
Centrifuge (Model CL). standar yang mengandung Ca dan Mg, tidak
ada kerugian pada titer (Tabel 1). Penurunan
HASIL
titer mungkin disebabkan oleh khelasi
Natrium sitrat beberapa Ca atau Mg, atau keduanya. Telah

Efek natrium sitrat (dalam AF-plasma atau disarankan bahwa Mg penting untuk reaksi uji
pewarna dan Ca juga mungkin penting.
serum) pada tes pewarna ditemukan di
laboratorium ini secara tidak sengaja Cakram Filter-Kertas

sementara konsentrasi sitrat dalam darah Darah vena dalam tabung dan darah kapiler
sedang disesuaikan untuk mengurangi
TABEL 1 Perbandingan titer antibodi dari tiga
endapan yang menyusahkan yang sering
sampel serum diuji dalam tes pewarna dengan
diatasi dalam plasma. Tinjauan terhadap
dan tanpa Ca dan Mg
laporan yang dipublikasikan menunjukkan
bahwa Payne memiliki data terperinci tentang
fenomena ini. Dia menemukan bahwa serum
dari sekitar 10 kali lebih banyak donor
memuaskan seperti AF dalam tes pewarna
(90% atau lebih Toxoplasma diwarnai dalam
kontrol) ketika sitrat ditambahkan, dalam
* a, AF diencerkan dengan PBS yang
mengandung Ca dan Mg; b, AF diencerkan
dengan PBS tidak mengandung Ca dan Mg.
+ Di mana persentase spesifik diberikan, 100
hingga 110 Toksoplasma dihitung.
diserap ke cakram kertas saring dikumpulkan
dari masing-masing dari 100 donor darah
untuk menguji kemampuan yang sesuai dari
metode pengumpulan cakram. Eluat dari satu
disk, dan serum yang dilarutkan 1:16, disaring
dengan tes pewarna dalam waktu 8 hari
setelah pengumpulan. Kedua spesimen dari 55
donor ditemukan mengandung antibodi
Toxoplasma, sedangkan spesimen dari donor
lain tidak positif. Kecuali untuk spesimen dari
satu donor yang secara tidak sengaja dibuang,
setiap serum positif dan eluat kemudian
dititrasi bersama. Hasilnya dirangkum dalam
Tabel 2. Titer eluat dan serum dari 42 donor
identik, dan variasi dalam titer antara
spesimen dari yang lain tidak lebih besar dari
dua kali lipat. Ketika perbedaan dicatat,
piringan eluat cenderung memiliki titer lebih
tinggi daripada serum yang diperoleh dari
darah vena, mungkin karena pengenceran awal
serum dalam piringan sedikit lebih rendah dari
1:16.
TABEL 2
Titer antibodi uji-serum serum dari darah vena
dibandingkan dengan titer eluat dari cakram
yang direndam dengan darah kapiler
Perbandingan juga dilakukan pada titer yang
diperoleh dengan cakram jenuh dengan darah
yang dikumpulkan dari tikus yang terinfeksi
secara eksperimental sebelum dan pada
berbagai waktu setelah kematian. (Untuk
tujuan survei ada keuntungan mengumpulkan
darah dari hewan liar kecil setelah kematian.)
Dalam studi ini, delapan tikus albino betina
dewasa terinfeksi dengan strain RH dari T.
gondii; sekitar 8 minggu kemudian, 1,0 ml
seluruh darah diperoleh dari masing-masing
hewan dengan tusukan jantung. Dua disk
jenuh dengan beberapa spesimen ini dan
sisanya disimpan untuk pemisahan serum.
Segera setelah itu masing-masing tikus
dibunuh dengan kloroform, dan cakram jenuh
dengan darah jantung (diperoleh dengan
membuka ventrikel) dari tiga tikus 1 hingga 2
jam setelah kematian; dari tiga lainnya, 3
hingga 4 jam setelah kematian; dan dari dua
yang tersisa, 5 hingga 6 jam setelah kematian.
Serum dan eluat dari disk yang dikumpulkan
sebelum dan sesudah kematian dititrasi dalam
dua kali pengenceran dalam tes pewarna yang
sama. Titer antibodi dari masing-masing
spesimen dari masing-masing tikus identik.
Titer bervariasi dari 2.048 hingga 8.192 di
antara masing-masing hewan.
Pengamatan awal pada disk dengan darah dari
empat orang dengan Toxoplasma anti titer
tubuh yang diketahui menunjukkan bahwa
penyimpanan pada suhu kamar (24 ° C ± 1 °)
selama 40 hari tidak mengurangi titer lebih
dari dua kali lipat.
Selanjutnya, tes lebih lanjut dilakukan dengan
beberapa cakram dari donor darah. tes dengan
cakram dari sembilan donor mengungkapkan
bahwa penyimpanan pada suhu 4 ° C selama
71 hingga 81 hari menghasilkan penurunan
titer dua kali lipat atau kurang dalam enam
contoh dan penurunan empat kali lipat pada
tiga donor lainnya. Cakram dari lantai lain
disimpan selama 33 hingga 34 hari pada suhu
4 ° C dan kemudian selama 38 hingga 47 hari
pada suhu kamar. Pada akhir waktu ini, titer
dari empat mengalami penurunan dua kali
lipat, empat lagi mengalami penurunan empat
kali lipat, dan satu lagi mengalami penurunan
delapan kali lipat.
DISKUSI
Penambahan natrium sitrat ke dalam serum
cenderung digunakan sebagai faktor aksesori
telah terbukti bermanfaat, sangat
menyederhanakan tugas mencari donor AF
yang cocok. Lebih lanjut, kemampuan
reproduksi hasil uji-celup di laboratorium
kami jauh meningkat setelah serum plus sitrat
digantikan dengan plasma.
Baru-baru ini, Kobayashi dan rekan kerja
melaporkan mengamati peningkatan yang
signifikan dalam proporsi Toxoplasma yang
diwarnai dalam tes pewarna ketika eksudat
peritoneum yang mengandung heparin,
EDTA, atau garam sitrat (digunakan untuk
mencegah koagulasi eksudat) ditambahkan
secara utuh ke dalam tes.
Efek natrium sitrat dan anti koagulan lainnya
terhadap kinerja serum faktor-aksesori
merupakan fenomena yang menarik tetapi
kurang dipahami. Rupanya zat-zat ini dalam
beberapa cara menetralkan efek faktor plasma
anti-Toxo dalam serum manusia normal. Di
laboratorium kami, dan setidaknya di dua
lainnya, faktor seperti itu telah ditemukan
panas-labil. Tidak diketahui apakah faktor ini
terkait dengan faktor anti-Toksoplasma yang
labil panas yang disebutkan oleh Sabin dan
Feldman karena biasanya terdapat dalam
serum beberapa spesies mamalia namun tidak
terjadi dalam serum dari tikus atau manusia. untuk mengeringkan cakram dan untuk
Strannegard telah menyajikan bukti bahwa mengelusi serum. Dengan eksperimen,
"faktor Toxoplasma-bermusuhan" yang labil bagaimanapun, itu harus dimungkinkan
dalam panas pada kelinci, kelinci percobaan, mempersingkat waktu pengeringan dan elusi
betis, dan serum monyet adalah antibodi dari
PENGAKUAN
tipe IgA.
Bantuan teknis yang sangat baik dari Bp.
Meskipun kertas saring sebelumnya telah
digunakan untuk mengumpulkan dan Richard Villantis berterima kasih.

melestarikan sedikit lalinan darah untuk DAFTAR PUSTAKA

pengujian serologis, penggunaan metode ini
1. Sabin, A. B., and Feldman, H. A., 1948.
untuk digunakan dengan uji pewarna belum
Dyes as microchemical indicators of a new
dilaporkan. Selama survei serologis,
immunity phenomenon affecting a protozoon
keuntungan mengumpulkan darah pada
parasite (toxoplasma). Science, 108: 660-663.
cakram kertas saring, dibandingkan dengan
mengumpulkan darah vena dalam tabung, 2. Beverley,J. K. A., and Beattie,C. P., 1952.
banyak. Sebagai contoh, kebutuhan untuk Standardization of the dye test for toxoplas
pendinginan langsung dan sentrifugasi mosis. I. Clin. Pathol., 5: 350-353.
spesimen dihilangkan, dan jumlah ruang
3. Frenkel, J. K., and Jacobs, L., 1958. Ocular
penyimpanan sangat berkurang. Faktor-faktor
toxoplasmosis; pathogenesis, diagnosis, and
ini sangat penting bagi simpatisan
treatment. Am. Med. Assoc. Arch. Ophthal
bekerja di daerah terpencil. Lebih jauh, mol., 59: 260-279.
pengumpulan darah dari anak kecil sangat
4. Payne, R. A., 1966. The effect of citrate
disederhanakan. Untuk survei pada hewan,
radical on the dye test for toxoplasmosis.
jumlah darah yang cukup dapat dikumpulkan
Month. Bull. Minist. Health, 25: 161-164.
langsung dari jantung tikus kecil dan mamalia
5. Kobayashi, A., Kumada, M., and
kecil lainnya beberapa jam setelah kematian –
Tsunematsu, Y., 1968. Effects of
berbeda keuntungan daripada menangani
anticoagulants on the dye test for
beberapa dari mereka hidup-hidup.
toxoplasmosis. lap. I. Med. Sci. Biol., 21: 71-
Kerugian utama dari metode pengumpulan
89.
kertas-cakram adalah waktu yang dibutuhkan
6. Lunde, M. N., 1967. Laboratory of Parasitic 3rd Ed., pp. 150-151. Lennette, E. H., and
Diseases, National Institute of Allergy and In Schmidt, N. J., eds. Am. Pub. Health Assoc.,
fectious Diseases, NIH, Bethesda, Maryland. Inc., New York, N.Y.
Personal communication.
10. Chin, James, Schmidt, N. J., Lennette, E.
7. Remington, J. 5., 1967. Allergy, H., and Hanahoe, Maureen, 1966. Filter paper
Immunology and Infectious Diseases Division, disc method of collecting whole blood for
Palo Alto Medical Research Foundation, Palo serologic studies in children. Am. I. Epide
Alto, Cali fornia. Personal communication. miol., 84: 74-80.

8. Frenkel, J., 1967. Department of Pathology 11. Feldman, H. A., 1956. The relationship of
and Oncology, School of Medicine, University Toxoplasma antibody activator to the serum
of Kansas, Kansas City, Kansas. Personal com properdin system. Ann. N. V. Acad. Sd., 66:
munication. 263-267. 12. Strannegard, Orjan, 1967. The
so-called Toxoplasma-hostile factor and its
9. Schmidt, N. J., 1964. Tissue culture
relation to anti body. Acta Path. Microbiol.
methods and procedures for diagnostic
Scand., 69: 465-476.
virology, pp. 78-1 76. In Diagnostic
Procedures for Viral and Rickettsial Diseases,