ISOLASI MIKROORGANISME DENGAN TEKNIK

PENGENCERAN BERTINGKAT
Septiara Putri1*, Ismi Farah Syarifah2

1,2
Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Sunan Gunung Djati Bandung, Jl.
A.H. Nasution No.105, Cipadung, Cibiru Kota Bandung, Jawa Barat 40614

*septiarap5@gmail.com

Abstrak
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran
berbagai macam sel. Tanah merupakan salah satu tempat yang identik dengan mikroba.
Mikroba di dalam tanah berperan sebagai penyedia unsur hara bagi keberlangsungan hidup
tumbuhan. Jumlah miroba tanah yang melimpah menggambarkan tingkat kesuburan tanah
secara biologis. Namun karena keberagaman tersebut masyarakat menjadi sulit untuk
mengidentifikasi jenis mikroba apa saja yang ada pada tanah. Oleh karena itu diperlukan
suatu isolasi mikroba agar didapatkan mikroba yang sudah tidak bercampur lagi dengan
mikroba lainnya. Teknik kegiatan ini adalah dengan cara mengisolasi mikroba tanah, yang
kemudian dilakukan pengenceran bertingkat agar tidak terlalu banyak mikroba yang tumbuh
dan kemudian disebarkan pada media. Hasil dari pengamatan sample yang telah dilakukan
pengenceran bertingkat ini didapat bahwa mikroba yang tumbuh tidak terlalu beragam
sehingga mudah untuk diidentifikasi.

Kata kunci: Mikroba, tanah, isolasi, pengenceran

PENDAHULUAN dalam daur nutrisi (Scow et al., 2005).

Tanah merupakan bagian terluar dari
kerak bumi yang terdiri atas tiga fase yaitu
fase padatan, cairan dan gas. Keseluruhan
tanah disusun oleh lima komponen besar.
Komponen-komponen tersebut adalah
bahan-bahan mineral, air, bahan organik,
udara serta organisme hidup. Organisme
hidup yang terdapat pada tanah yaitu
hewan-hewan kecil dan mikroorganisme.
Pada umumnya, mikroorganisme tanah
memegang peranan paling penting dalam
menghasilkan nutrisi dan karbondioksida
untuk pertumbuhan tanaman.
Mikroorganisme tanah juga berperan
dalam dekomposisi bahan-bahan organik,
memperbaiki struktur tanah dan berperan
Kelompok utama dari mikroorganisme
tanah meliputi bakteri (termasuk
aktinomiset), cendawan dan protozoa. Dari
ketiga mikroorganisme tersebut bakteri
merupakan mikroorganisme yang paling
melimpah jumlahnya didalam tanah.
Dalam setiap gram diperkirakan terdapat
60.000 spesies yang berbeda dan
jumlahnya mencapai milyaran sel bakteri
(Reid et al., 2005). Jumlah dan tipe bakteri
yang terdapat pada tanah sangat
dipengaruhi oleh letak geografis, suhu, pH,
kandungan bahan organic, tipe tanah,
kultivasi, aerasi dan kelembaban tanah
(Davies et al., 1999). Bakteri tanah yang
paling sering dijumpai berbentuk kokus,
basil, spiral (Bhagabati et al., 2004).
 Mikroorganisme dalam tanah memiliki
fungsi sebagai penyedia unsur hara,
perombak bahan organik dan mineralisasi
organik, memacu pertumbuhan tanaman,
menjadi agen hayati pengendali hama dan
penyakit tumbuhan serta mempengaruhi
sifat fisika dan kimia tanah (Husen dkk,
2008).
Kesuburan tanah dapat diprediksi dari
jumlah populasi mikroba yang hidup di
dalamnya. Tingginya jumlah mikroba
merupakan pertanda tingginya tingkat
kesuburan tanah, karena mikroba berfungsi
sebagai perombak senyawa organik
menjadi nutrient yang tersedia bagi
tanaman dan di dalam tanah terkandung
cukup bahan organik dan senyawa lainnya
untuk pertumbuhan mikroba. Kelembaban
tanah berpengaruh pada aerasi, suhu dan
reaksi di dalam tanah, namun masih sedikit
peneliti yang mempertimbangkan secara
akurat perilaku mikroba tanah terhadap
setiap faktor lingkungan tanah. Untuk
mengetahui jumlah mikroorganisme tanah
dapat dilakukan metode pendekatan yaitu
pengambilan sample dan isolasi dengan
teknik pengenceran bertingkat
(Purwaningsih, 2005).
Teknik isolasi mikroorganisme adalah
suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba
diluar dari lingkungan alamiahnya.
Pemisahan mikroorganisme dari
lingkungan ini bertujun untuk memperoleh
biakan bakteri yang sudah tidak bercampur
lagi dengan bakteri lainnya dan disebut
dengan biakan murni. Prinsip dari isolasi
mikroba adalah memisahkan satu jenis
mikroba dengan mikroba lainnya yang
berasal dari campuran bermacam-macam
mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat, sel-
sel mikroba akan membentuk koloni sel
yang tetap pada tempatnya (Nur dan Asani,
2007).
Septiara Putri
Dikenal beberapa cara atau metode
untuk memperoleh biakan murni dari suatu
biakan campuran. Dua diantaranya yang
paling sering digunakan adalah metode
cawa gores dan metode cawan tuang. Yang
didasarkan pada prinsip pengenceran
dengan maksud untuk memperoleh spesies
individu. Dengan anggapan bahwa setiap
koloni dapat terpisah dari satu jenis sel
yang dapat diamati (Afrianto, 2004).
Pada kegatan ini dilakukan
pengenceran bertingkat yan bertujuan
untuk memperkecil atau mengurangi
jumlah mikroba yang tersuspensi dalam
cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya
tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sample.
Digunakan perbandingan 1:9 untuk sample
dan pengenceran pertama dan selanjutnya,
sehingga pengenceran berikutnya
mengandung 1/10 sel mikroba dari
pegenceran sebelumnya.
Biakan murni diperlukan dalam
berbagai metode mikrobiologis, antara lain
digunakan dalam mengidentifikasi
mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri
kultural morfologi, fisiologi dan serologi
dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu
spesies (Dwijoseputro, 2005). Beberapa
factor yang pelu diperhatikan dalam
melakukan isolasi miroba yaitu, sifat setiap
jenis mikroba, tempat hidup mikroba,
media pertumbuhan yang sesuai, cara
menginkubasi dan menginokulasi mikroba
dan lain sebagainya.
Kegiatan ini bertujuan untuk
menumbuhkan mikroba diluar dari
lingkungan alamiahnya dan untuk
memperoleh biakan bakteri yang sudah
tidak bercampur lagi dengan bakteri
lainnya (biakan murni) agar memudahkan
peneliti untuk melakukan penelitian.
Indonesian Journal of Halal Research, x, x (xxxx): xx-xx
METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah cawan petri, vortex,
batang L, bunsen, mikro cup, oven, pipet
ukur.
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah media NA, aquades,
sample tanah, etanol.
Prosedur Kerja
Langkah-langkah yang dilakukan dalam
proses isolasi mikroorganisme yang
pertama, yaitu nyalakan api bunsen untuk
memastikan bahwa lingkungan kerja dalam
keadaan steril, kemudian ambil sedikit
sample tanah lalu masukan kedalam mikro
cup dan homogenkan sample tanah
tersebut menggunakan vortex. Setelah
didapat suspensi mikroba tanah, langkah
selanjutnya adalah melakukan
pengenceran. Pengenceran dilakukan untuk
mengurangi jumlah dan jenis mikroba pada
sample tanah tersebut. Diambil 100
mikroliter sample tanah, lalu encerkan
dengan 900 mikroliter air aquades
kemudian campuran tersebut di
homogenkan menggunakan vortex. Lalu
tanamkan suspensi tersebut kedalam media
agar, dengan mengambil 100 mikroliter
sample yang telah dilakukan pengenceran
sebelumnya, lalu masukan kedalam media
agar, selanjutnya sebarkan sample tadi
menggunakan batang L yang telah
direndam didalam etanol dan dibakar
terlebih dahulu untuk memastikan bahwa
bakteri dari etanol di batang L tersebut
sudah menguap. Langkah selanjutnya
sebarkan pada media, setelah tersebar tutup
media agar dan terbalikan. Kemudian
media tersebut diinkubasi selama 3 hari
dalam suhu 37℃. Tunggu hingga 3 hari
dan amati.
Isolasi Mikroorganisme dengan Teknik Pengenceran Bertingkat
3 of 9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Inokulasi
Isolasi atau tindakan mengisolasi suatu
mikroba ialah memisahkan mikroba
tersebut dari lingkungannya di alam dan
menumbuhkannya sebagai biakan murni
dalam medium buatan. Untuk isolasi harus
diketahui cara-cara menanam dan
menumbuhkan mikroba pada medium
biakan serta syarat-syarat lain untuk
pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).
Selain istilah isolasi, kita mengenal pula
istilah inokulasi. Inokulasi berbeda dengan
isolasi, jika isolasi merupakan upaya
memisahkan mikroba, sedangkan inokulasi
merupakan pekerjaan memindahkan
mikroba dari medium yang lama ke
medium yang baru dengan tingkat
ketelitian yang sangat tinggi. Dengan kata
lain, inokulasi adalah suatu upaya untuk
menanamkan mikroba. Jadi antara isolasi
dengan inokulasi memiliki arti yang
berbeda. Sebelum melakukan kegiatan
isolasi dan inokulasi, biasanya dilakukan
terlebih dahulu kegiatan pembuatan
pengenceran bertingkat. Menurut
(Wasteson and Hornes, 2009) tujuan dari
pengenceran bertingkat yaitu memperkecil
atau mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan. Sehingga
memudahkan dalam proses penghitungan
jumlah mikrobia. Penentuan besarnya atau
banyaknya tingkat pengenceran tergantung
kepada perkiraan jumlah mikroba dalam
sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9
untuk sampel dan pengenceran pertama
dan selanjutnya, sehingga pengenceran
berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisme dari pengenceran
sebelumnya.
Teknik Preparasi Suspensi
Pada penelitian ini sample yang
dipakai adalah sample tanah. Sample tanah
yang didapat di campurkan dengan
aquades kemudian dihomogenkan. Teknik
ini dinamakan dengan dengan teknik
preparasi suspensi dengan metode rinse.
Metode rinse atau bilas ditujukan untuk
melarutkan sel-sel mikroba yang
menempel pada permukaan substrat yang
luas tetapi relative berukuran kecil. Sample
tanah ini dimasukan kedalam mikro cup
yang telah berisikan aquades dengan
perbandingan 1:9. Tujuan dari teknik ini
pada prinsipnya adalah melarutkan atau
melepaskan mikroba dari substratnya ke
dalam aquades sehingga lebih mudah
penanganannya. Selain metode Rinse ada
beberapa metode yang dapat digunakan,
yaitu:
1. Swab (ulas) dilakukan menggunakan
cotton bud steril pada sampel yang
memiliki permukaan luas dan pada
umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu
pada benda tersebut. Contohnya adalah
meja, batu, batang kayu, potongan daging
dan lain-lain. Swab dilakukan dengan
tahapan sebagai berikut: Siapkan cotton
bud steril, lalu usapkan cotton bud
memutar sehingga seluruh permukaan
kapas dari cotton bud kontak dengan
permukaan sampel, dan swab akan lebih
baik jika cotton bud dicelupkan terlebih
dahulu ke dalam larutan atraktan semisal
pepton water.
2. Maseration (penghancuran) sampel yang
berbentuk padat dapat ditumbuk dengan
mortar ataupestle sehingga mikroba yang
ada dipermukaan atau di dalam dapat
terlepas kemudian dilarutkan ke dalam
aquades. Contoh sampelnya antara lain
bakso, biji, buah dan lain-
lain.Perbandingan antar berat sampel
dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9
(w/v). Untuk sampel dari tanah tidak perlu
dimaserasi. Maseration dapat dilakukan
Septiara Putri
dengan tahapan sebagai berikut :
Masukkan sampel ke dalam mortar atau
pestle, kemudian hancurkan sample
menggunakan mortar dan sampel siap
untuk diencerkan dan digunakan.
Teknik Pengenceran Bertingkat
Pengenceran adalah mencampurkan
larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan
cara menanamkan pelarut agar diperoleh
volume akhir yang lebih besar. Prinsip
pengenceran adalah menurunkan jumlah
sehingga semakin banyak jumlah
pengenceran yang dilakukan maka
semakin sedikit jumlah mikroba.
Pada praktikum ini dilakukan
pengenceran bertingkat. Tujuan dari
pengenceran bertingkat yaitu memperkecil
atau mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan. Penentuan
besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan
jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan
perbandingan 1:9 untuk sampel dan
pengenceran pertama dan selanjutnya,
sehingga pengenceran berikutnya
mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari
pengenceran sebelumnya.
Secara umum langkah-langkah untuk
melakukan pengenceran bertingkat ini
adalah sebagai berikut: Sampel yang
mengandung mikroorganisme dimasukan
ke dalam tabung pengenceran pertama
(1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari
preparasi suspensi). Perbandingan berat
sampel dengan volume tabung pertama
adalah 1 : 9 dan perlu diingat bahwa
aquades yang digunakan jika memakai
teknik rinse dan swab sudah termasuk
pengencer 10-1 . Setelah sampel masuk
lalu dilarutkan dengan mengocoknya.
Kemudian diambil 1 ml dari tabung 10-1
dengan pipet ukur kemudian dipindahkan
ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian
Indonesian Journal of Halal Research, x, x (xxxx): xx-xx 5 of 9

dikocok dengan membenturkan tabung ke

telapak tangan sampai homogen (idealnya
adalah dihomogenkan menggunakan
vortex). Lalu lanjutkan pemindahan hingga
tabung pengenceran terakhir (cukup
sampai pengenceran 10-6) dengan cara
yang sama, hal yang perlu diingat bahwa Gambar 2 : Hasil sample pengenceran 10-
1, 10-2 dan 10-3
pipet ukur yang digunakan harus selalu
Sumber:
diganti, artinya setiap tingkat pengenceran https://youtu.be/pmRUBYIPMBM
digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak
perlu diganti jika memindahkan cairan dari
sumber yang sama.

Gambar 3 : Hasil sample pengenceran 10-

4, 10-5 dan 10-6
Sumber:
https://youtu.be/pmRUBYIPMBM

Gambar 4 : Hasil sample pengenceran 10-7

Gambar 1 : Pengenceran Bertingkat Sumber:
Sumber (Panduan Praktikum Mikrobiologi, https://youtu.be/pmRUBYIPMBM
UNTIDAR)
Dari gambar tersebut dapat disimpulkan
Pada video praktikum kedua, pengenceran bahwa media 10-1 merupakan media yang
dilakukan hingga mendapat sample ke 10. paling banyak ditumbuhi bakteri
Masing-masing sample dari 10 sampai 10
sedangkan media 10-7 merupakan media
disebarkan kedalam medium. Medium ang
dipakai adalah medium NA karena yang paling sdikit ditumbuhi bakteri. Hal
mikroba yang akan ditumbuhkan adalah ini menunjukan bahwa jumlah koloni
bakteri dan bakteri sangat cocok tumbuh sample semakin tinggi angka
dimedium NA. Sample kemudian pengencerannya maka jumlah bakteri
digerakan dan disebarkan menggunakan semakin sedikit.
jarum OSE agar seluruh suspensi tersebar
merata. Kemudian sample diinkubasi
Teknik Penanaman Mikroba
selama 2 hari dengan posisi terbalik. Dari
hasil inkubasi selama 2 hari akan terlihat Teknik penanaman mikroba untuk
beberapa bentuk koloni yang tumbuh pada memperoleh biakan murni ada beberapa
media didalam cawan petri secara cara tergantung substratnya. Penanaman
berurutan, sebagai berikut : mikroba dari substrat cair dapat

Isolasi Mikroorganisme dengan Teknik Pengenceran Bertingkat

menggunakan teknik spread plate dan pour
plate sedangkan untuk substrat padat dapat
menggunakan teknik suspensi dan tabur.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan
sebelum melakukan penanaman mikroba
sehingga biakan murni terbebas dari
kontaminan yaitu prosedur teknik aseptic,
jenis medium yang digunakan, teknik
isolasi, teknik pemilihan sumber biakan
dan penyimpanan pasca isolasi. Sementara
itu, jenis medium yang cocok digunakan
untuk memperoleh biakan murni adalah
medium padat, khususnya medium padat
dalam cawan petri. Medium padat dapat
menghentikan pergerakan sel-sel,
kemudian mengizinkan sel-sel mikroba
untuk tumbuh dan membentuk massa yang
tampak sebagai sebuah entitas tersendiri
yang disebut koloni.
Pada video praktikum pertama, sample
tanah yang telah di encerkan kemudian
disebarkan keatas media agar padat lalu
diratakan menggunakan batang L teknik ini
adalah teknik sebar atau spread plate.
Setelah itu sample mikroba di inkubasi
selama beberapa hari dengan suhu kurang
lebih 37℃. Setelah selesai didapati hasil
sebagai berikut :
Gambar 5. Hasil isolasi mikroba tanah
Sumber : https://youtu.be/b9QcxWeWECk
Pada gambar terlihat bahwa bakteri yang
tumbuh tidak sedikit, hal tersebut
dikarenakan pengenceran dilakukan hanya
2 kali. Bila mana pengenceran hingga
Septiara Putri
enam kali mungkin mikroba yang
dihasilkan akan lebih sedikit sehingga
lebih mudah untuk diteliti.
Seperti yang dikatakan diatas bahwa
banyak sekali teknik penanaman mikroba,
selain teknik spread plate. Beberapa
diantaranya yaitu :
1. Pour plate, teknik ini memerlukan agar
yang belum padat (>45℃) untuk dituang
bersama suspensi bakteri kedalam cawan
petri lalu kemudian dihomogenkan dan
dibiarkan memadat. Hal ini akan
menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya
pada permukaan agar saja melainkan
terendam didalam agar. Pada teknik pour
plate suspensi yang diteteskan hanya 1 mL
lebih banyak dari suspensi pada metode
spread plate yaitu 0,1 mL dikarenakan
pada pour plate membutuhkan ruang yang
lebih luas untuk penyebarannya.
2. Goresan, teknik ini bertujuan untuk
mengisolasi mikroba dari campurannya
atau meremajakan kultur kedalam medium
baru. Dasar dari metode ini yaitu dengan
menggoreskan suspensi bahan yang
mengandung mikroba pada permukaan
medium agar. Setelah diinkubasi maka
pada bekas goresan akan tumbuh koloni-
koloni terpisah yang mungkin berasal dari
satu sel mikroba, sehingga dapat diisolasi
lebih lanjut. Penggoresan yang sempurna
akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Teknik goresan ini dibagi menjadi 3 jenis,
yaitu :
a). Goresan sinambung, pada teknik ini
dilakukan dengan cara menyentuhkan
inoculum loop pada koloni dan gores
secara kontinu sampai setengah permukaan
agar, lalu dilanjut dengan melanjutkan titik
akhir goresan.
Indonesian Journal of Halal Research, x, x (xxxx): xx-xx
Gambar 6. Metode goresan sinambung
Sumber : Modul teknik penanaman
Goresan sinambung umumnya digunakan
bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,
melainkan untuk peremajaan ke medium
baru.
b). Goresan T, pada teknik ini media dibagi
menjadi 3 menggunakan spidol. Seperti
pada goresan sinambung, inokulasi ini
dilakukan dengan menggoreskan secara
zig-zag secara bergantian hingga kebagian
terakhir.
Gambar 7. Metode goresan T
Sumber : Modul teknik penanaman
c). Goresan kuadran, metode ini hampir
sama dengan goresan T, namun pola
goresannya saja yang berbeda yaitu dibagi
empat. Daerah 1 merupakan goresan awal
sehingga masih mengandung banyak sel
mikroba. Goresan selanjutnya dipotongkan
atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan
akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni
tunggal.
Gambar 8. Metode goresan kuadran
Sumber : Modul teknik penanaman
Isolasi Mikroorganisme dengan Teknik Pengenceran Bertingkat
7 of 9
KESIMPULAN
Teknik isolasi mikroorganisme adalah
suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba
diluar dari lingkungan alamiahnya.
Pemisahan mikroorganisme dari
lingkungan ini bertujun untuk memperoleh
biakan bakteri yang sudah tidak bercampur
lagi dengan bakteri lainnya dan disebut
dengan biakan murni. Prinsip dari isolasi
mikroba adalah memisahkan satu jenis
mikroba dengan mikroba lainnya yang
berasal dari campuran bermacam-macam
mikroba. Preparasi mikroba dilakukan
dengan metode swab, rinse dan maseration.
Teknik penanaman mikroba sangat
beragam tergantung jenis substratnya yaitu,
spread plate, pour plate, pengenceran dan
goresan.
Teknik pengenceran bertingkat bertujuan
untuk memperkecil atau mengurangi
jumlah mikroba yang tersuspensi dalam
cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya
tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiran jumlah mikroba dalam sample.
Digunakan perbandingan 1:9. Semakin
tinggi angka pengenceran maka jumlah
bakteri yang ditumbuh semakin sedikit.
DAFTAR PUSTAKA
Journal Article
Purwaningsih, Sri. (2011). Isolasi Mikroba
Penghasil Antibiotika dari Tanah Kampus
Unsri Indralaya Menggunakan Media
Ekstrak Tanah. Jurnal Biodiversitas. Vol.
6(2) 82-82.
Yunus, F., Orryani, L dan Suwastika. (2017).
Kelimpahan Mikroorganisme Tanah
Pada Sistem Perkebunan Kakao
(Theobroma cacao L.) Semi Intensif
Dan Non Intensif. Journal of Science
and Technology. Vol 6 (3) : 194 – 205.
Book
Dwidjoeseputro, D. 1998. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Malang; Djambatan.
Suriawiria, U. 1995. Pengantar
Mikrobiologi Umum. Bandung;
Angkasa.
Zahrotul., dkk. 2019. Panduan Praktikum
Mikrobiologi Dasar. Magelang;
Universitas TIDAR.
Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah.
Jakarta; Rineka Cipta.

Internet/Website article
Widya, Aqita. 2017. Pengenceran dan
Penanaman Mikroba. https://
aqitawidya23.blogspot.com/2017/04/la
poran-mikrobiologi-tentang.html
(diakses pada 10 april 2021)
Farmasi. 2019. Teknik-teknik Isolasi atau
Penanaman Mikroba.
http://farmasi.unida.gontor.ac.id/2019/
03/24/teknik-teknik- isolasi-atau-
penanaman-mikroba/ (diakses pada
10 april 2021)

Video
Bio-Rad Laboratories. 2012. Serial
Dilution and Plate Counts.
https://youtu.be/pmRUBYIPMBM
Farah, Ismi. 2021. Isolasi Mikroorganisme.
https://youtu.be/b9QcxWeWECk

Septiara Putri