ELISA

drh. Gegana Wimaldy Airlangga

Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Veteriner

Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
 TAHAPAN KERJA DIRECT ELISA
1. Coating Antigen
2. Washing
3. Blocking
4. Washing
5. Penambahan konjugat (antibodi berlabel
enzim)
6. Washing
7. Penambahan substrat
8. Stopping (3N NaOH)
9. Pembacaan pada ELISA Reader
3/12/2020 2
 Coating
Proses adsorpsi antigen atau antibodi pada fase
padat

Buffer coating menggunakan PBS, buffer

karbonat atau Tris-HCl

Coating yang baik untuk mendapatkan optical

density yang tinggi
 Blocking
Proses coating akan menyisakan beberapa
tempat kosong yang harus diisi oleh bahan.

Creamer 4-5% dalam PBS

Blocking bertujuan untuk menghindari

pewarnaan latar
 Washing
Bertujuan untuk menghilangkan semua materi
dari luar dan yang ikatannya longgar dari
permukaan fase padat.

Bahan washing adalah PBS mengandung Tween-

20
 Penambahan Konjugat
Pemilihan enzim pada konjugat berdasarkan beberapa kriteria :
1. Kemurnian tinggi
2. Sensitivitas terhadap deteksi produk
3. Kecepatan dan mudahnya deteksi reaksi enzim
4. Stabil
5. Mudah didapat dan murah

Enzim Horseradish peroksidase (HRP), alkaline fosfatase (AP)

 Penambahan Substrat
1. Enzim Alkaline Phosphatase (AP)
p-NPP (para-NitroPhenyl-Phosphate) 405 nm (kuning)
PMP (Phenol-Phthalein Monophosphate) 550nm (merah)

2. Enzim Horseradish Peroksidase (HRP)

OPD (o-Phenyldiamine) 492 nm (oranye)
ABTS [2,2-amino-di-(3-etilbenzotiazolin sulfonic acid)] 414 nm
(hijau)
TMB (3,3 , 5,5 – TetraMetilBensidin) 450 nm (kuning)